Contributo alla valutazione delle opacità corneali mediante la microscopia confocale

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1 Contributo alla valutazione delle opacità corneali mediante la microscopia confocale Contribution to corneal opacities evaluation by confocal microscopy Altimari S, Malarska KG, Losciale R, Nazzarro V, Bonci E, Zompatori L Università degli Studi di Roma La Sapienza Dipartimento di Scienze Oftalmologiche Direttore: Prof. C. Balacco Gabrieli Servizio Speciale di Fisiopatologia Corneale e Contattologia Medica Primario: Prof A. Missiroli Dr.ssa Simona Altimari RIASSUNTO Obiettivo: Gli autori stabiliscono una quantificazione osservatore indipendente delle opacità corneali usando la microscopia confocale, completando un precedente studio che prendeva in esame solo haze post-prk. Metodo: Mediante microscopia confocale (Confoscan 3) è stata eseguita una scansione sulla zona centrale della cornea di 70 pazienti sani. La curva Z-scan è stata normalizzata in relazione alla reflettività endoteliale di ogni individuo, creando una curva standard Z- scan per ogni gruppo d età. Nella curva normalizzata è stato considerato per ogni punto un fattore di tolleranza K pari a 95%. Sono stati poi presi in esame 5 pazienti, 3 maschi e 2 femmine, presentanti un haze corneale di diversa origine e sottoposti a microscopia confocale in prima visita. Risultati: Ognuna delle opacità può essere valutata come area sotto la curva ottenuta dalla differenza tra il limite fiduciale superiore di Z-scan standard e la curva registrata col ConfoScan 3. È stata tracciata una significativa correlazione tra l opacità esaminata ed il grado clinico dell opacità, secondo la scala di Heitzmann, ottenuto con lampada a fessura. Conclusioni: Il microscopio confocale ha fornito un dato essenziale, impossibile da ottenere tramite l esame con lampada a fessura. Lo studio della densità dell opacità corneale per mezzo del microscopio confocale fornisce parecchi vantaggi: misurazione della profondità, dello spessore e quantificazione della reflettività causata dall opacità. Effettuando una comparazione tra questi parametri e la curva normalizzata è possibile l analisi obiettiva, la quantificazione e il follow-up di tutti i tipi di opacità corneale. SUMMARY Intent: The authors establish an indipendent observed quantification of macula corneae using confocal microscopy, to finish a previous study which dealt only with post-prk haze. Method: The scanning of the central zone of the corneas of 70 healthy patients was carried out using the confocal microscopy ConfoScan 3. The Z-scan curve was standardized in relation to the endothelial reflectivity of each individual. A standard Z-scan curve was created for each age group. In the normalized curve, a tollerance factor K of 95% was considered for each point. 5 patients, 3 male and 2 female, showing a second-degree post-prk corneal haze were then examined and subjected to confocal microscopy both at the first visit. Results: Each of the opacities can be evaluated as the area under the curve obtained by the difference between the superior tollerance limit of the standard Z- scan and the curve recorded with ConfoScan 3. A significant correlation was found between the examined opacity and the clinical degree of opacity, according to Heitzmann s scale, obtained by slit lamp. Conclusions: The confocal microscopy furnished essential data that is impossible to obtain through examination by slit lamp. The study of the density of macula corneae by confocal microscopy offers many advantages: depth and thickness determination and quantification of reflectivity caused by opacity. Comparing these parameters and the standard curve, it is possible to carry out an objective analysis, quantification and follow-up of all types of macula corneae. 17 PAROLE CHIAVE: haze corneale, microscopia confocale, PRK KEYWORDS: confocal microscopy, corneal haze, PRK

2 18 INTRODUZIONE La trasparenza è una proprietà fisiologica indispensabile della cornea, essenziale per la visione. Le alterazioni della trasparenza corneale vengono divise in 3 grandi gruppi: condizioni associate ad un abnorme contenuto d acqua (edema) anormale diametro, spaziatura ed orientamento delle fibre collagene (tessuto cicatriziale o fibrosi) accumulo abnorme di macromolecole (proteine, glicosaminoglicani, lipidi, etc.) (distrofie corneali). L opacità corneale molto spesso può essere dovuta all associazione di più cause (1). Sono molte le patologie corneali associate ad alterazione della trasparenza: opacità corneali congenite (distrofie corneali, mucolipidosi), opacità corneali da alterato metabolismo (glucidico, lipidico e protidico), opacità corneali post-cheratite (da Herpes Simplex, Pseudomonas aeruginosa, acanthamoeba), cheratopatia neuroparalitica (causata da una lesione al V paio di nervi cranici), post chirurgia rifrattiva (PRK). Nella pratica clinica l opacità (haze) corneale è soggettivamente suddivisa in vari gradi secondo la capacità di interferire col visus e di nascondere i dettagli della camera anteriore (2) : Grado 0: cornea chiara, assenza di haze Grado 0.5: opacità difficilmente distinguibili Grado 1: opacità visibili solo con illuminazione indiretta tangenziale, non influenza il visus Grado 1.5: uguale al grado 1 ma con minima influenza sul visus Grado 2: opacità visibili con illuminazione diretta focale Grado 3: opacità che nasconde parzialmente i dettagli iridei Grado 4: opacità che impedisce la visualizzazione della camera anteriore. Tale metodo soggettivo non è però riproducibile e può essere influenzato dalla variabilità inter-operatore (3,4). Nonostante ciò, fino ad ora non sono stati utilizzati metodi oggettivi per la valutazione dell haze corneale, ma la sua stadiazione è stabilita soggettivamente (5,6,7,8,9). Lo sviluppo di nuove tecniche in grado di studiare qualitativamente, quantitativamente ed in modo riproducibile la cornea in vivo è un requisito fondamentale per una migliore comprensione dei meccanismi riparativi tissutali e della modulazione farmacologica di tali processi. Il microscopio confocale in vivo è uno strumento molto utile per l analisi della morfologia e dell innervazione corneali (10), che consente di eliminare la variabilità osservatore dipendente ed inoltre permette di identificare minime alterazioni (subcliniche) nella trasparenza e nella microstruttura della cornea (4). Oltre a ciò, lo studio delle opacità corneali mediante microscopia confocale ci consente di (3) : misurare la profondità media dell opacità; una quantificazione oggettiva della reflettività, e quindi della densità; una valutazione della componente cellulare, acellulare e nervosa; poter effettuare un follow-up obiettivo nel tempo. Attraverso la microscopia confocale si può poi ottenere indirettamente una valutazione della densità dell haze attraverso la valutazione della reflettività che può essere misurata oggettivamente (3). L uso del microscopio confocale consente un follow-up della morfologia e dell evoluzione clinica dell entità dell opacità. Questo permette un confronto non solo tra pazienti differenti, ma anche in uno stesso paziente in tempi diversi. SCOPO DELLO STUDIO Il nostro obbiettivo è stato quello di ottenere una quantificazione osservatore-indipendente delle opacità corneali di diversa origine usando una scansione a fessura con microscopia confocale. METODO Sono state effettuate rapide scansioni multiple sull asse Z (CMTF Confocal Microscopy through focusing) nell area corneale centrale di 70 soggetti sani per un totale di 123 occhi, con una distanza stimata fra le immagini registrate di 8,5 µm. (Grafico1)

3 I limiti della tecnica CMTF sono dovuti alla regolazione manuale dell intensità luminosa. Infatti una misurazione obiettiva poteva essere ottenuta solo mantenendo parametri FISSI di intensità luminosa. Ma ciò non è pratico in quanto spesso in presenza di opacità corneali, lo Z- scan rileva un over-range che non permette di stimare l intensità di luce riflessa. Le scansioni sono state così normalizzate sulla base della reflettività endoteliale di ciascun soggetto. Abbiamo così creato un indice di reflettività calcolato punto per punto come il rapporto tra la reflettività di ciascun punto della curva e la reflettività endoteliale. (Grafico 2). In tal modo si passa da una scala assoluta non riproducibilead una scala relativa riproducibile e confrontabile. Abbiamo poi preso in esame 5 pazienti, 2 femmine e 3 maschi, di età media pari a 48 anni, presentanti opacità corneali ad etiologia varia, e li abbiamo sottoposti ad esame microscopico confocale in prima visita. (Tabella 1). Tabella I: Gruppo di pazienti con opacità corneale (n=5). Pazienti Sesso età Diagnosi tempo 0 M.L. Paz.1 M 28 Post-PRK 10,39 R.A. Paz.2 F 59 Ch. Acanthamoeba 74,98 S.M.L. Paz.3 F 44 Ch. neurotrofica 27,01 A.A. Paz.4 M 39 Ch. post-erpetica 51,14 F.C. Paz.5 M 29 Ch. Pseudomonas 10,29 19 RISULTATI È stata creata una curva z-scan standard per ciascun gruppo d età e di ogni curva age-matched è stato calcolato il limite fiduciale inferiore e superiore del 95% (pari a due deviazioni standard) in modo da delimitare i limiti di normalità della reflettività individuale. La curva così creata rappresenta la base su cui calcolare obiettivamente l opacità corneale. Riportiamo le curve per i gruppi d età in cui rientrano i nostri pazienti (Grafici 3, 4, 5 e 6).

4 20 Una stima obiettiva dell opacità è stata ottenuta confrontando lo z-scan di ciascun soggetto con la curva standard per classe di età di riferimento da noi creata sulla base dei dati relativi ai soggetti sani di controllo. L area sopra la curva fiduciale stima l opacità combinando le misure di intensità relativa e di spessore e operando una differenza fra il limite fiduciale superiore delle curve di controllo e la curva in esame. La sommatoria delle differenze tra la curva in esame e il limite fiduciale superiore ci consente di ottenere un valore che rappresenta un numero puro e quindi non legato alle variabili di luminanza. Analizziamo adesso, caso per caso, i pazienti presi in esame e vediamo i risultati ottenuti. Il paziente 1, con opacità corneale post-prk, sottoposto a microscopia confocale, in prima visita (tempo 0) presentava un certo grado di opacità (Grafico 7) la cui sommatoria, calcolata secondo la metodica precedentemente esposta, era pari a (grafico 8). Il paziente 2, riferiva pregressa cheratite da Acanthamoeba che aveva portato alla formazione di un leucoma corneale centrale. Il valore sommatoria risultava infatti molto elevato: 74,98 (Grafici 9 e 10).

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6 Il paziente 3, affetto da cheratite neurotrofica, presenta- va una sommatoria di 27,01 (Grafici 11 e 12). 22 Il paziente 4, con pregressa cheratite erpetica, presentava esiti corneali la cui sommatoria era pari a 51,14 (Grafici 13 e 14).

7 Il paziente 5, presentava gli esiti di una cheratite da Pseudomonas, e una sommatoria pari a 10,29 (Grafici 15 e 16). 23 DISCUSSIONE Questo studio è il completamento di uno studio precedentemente effettuato e presentato al XX Congresso Annuale della Società Italiana Laser in Oftalmologia (S.I.L.O.) i cui risultati, in corso di pubblicazione, prendevano però in considerazione solo haze post-prk. I dati forniti da questo studio consentono di ottenere una quantificazione operatore-indipendente delle opacità corneali di diversa etiologia, attraverso la valutazione dell area sotto la curva ottenuta dalla differenza tra margine superiore del limite di affidabilità di z- scan standard e la curva registrata dal microscopio

8 24 confocale (Confoscan 3). Il valore sommatoria ottenuto diventa così indicativo dell opacità e può rendere possibile una comparazione non solo tra pazienti differenti, ma anche, nello stesso paziente nel tempo e permette in questo modo di effettuare follow-up dell evoluzione clinica dell entità dell opacità. La densità dell opacità stimata mediante la microscopia confocale è espressa in modo indiretto come riflettività e può essere valutata utilizzando i parametri stabiliti sull intensità della luce. Lo z-scan, che permette una quantificazione della reflettività e dello spessore, fornisce dati precisi che evidenziano una correlazione fra l indice di reflettività (reflettività dello strato/reflettività dell endotelio) tramite CMTF e la stadiazione clinica dell haze tramite lampada a fessura. I limiti della tecnica CMTF sono dovuti alla regolazione manuale dell intensità luminosa. Infatti una misurazione obiettiva poteva essere ottenuta solo mantenendo parametri fissi di intensità luminosa. Ma ciò non è pratico in quanto spesso in presenza di opacità corneali, lo Z-scan rileva un over-range che non permette di stimare l intensità di luce riflessa. La normalizzazione delle scansioni sulla base della reflettività endoteliale di ciascun soggetto permette di creare un indice di reflettività punto per punto tramite il rapporto tra la reflettività di ciascun punto della curva e la reflettività endoteliale. Il nostro scopo è stato quindi innanzitutto normalizzare la curva z-scan. In tal modo è stato possibile passare da una scala assoluta e non riproducibile ad una scala relativa riproducibile e confrontabile. Tale tecnica rappresenta una modifica rispetto a quella ideata da Møller-Pendersen e coll. (1) in quanto la curva risulta normalizzata e non influenzata dalla intensità luminosa. Inoltre permette un analisi statistica più semplice in quanto non richiede una ricostruzione tridimensionale della cornea ablata ma solo lo z- scan fornito dal microscopio (11). La microscopia confocale fornisce un importante contributo allo studio dell haze corneale. La misurazione obiettiva dell haze può contribuire allo sviluppo di trial clinici volti a ricercare le variabili biologiche che ne influenzano lo sviluppo (11). Tuttavia questa metodica possiede dei limiti, che sono: - necessità che l endotelio sia clinicamente sano e quindi perfettamente riflettente, al fine della normalizzazione della curva; - necessità di una buona acquisizione della scansione: superficie della lente pulita microscopio perfettamente allineato livello del nero (livello di intensità luminosa al di sotto del quale il Confoscan 3 non acquisisce la scansione) uguale in tutti gli esami. Quando i fattori esterni sono controllati, il CMTF esegue una misurazione obiettiva e quantitativa dell haze. Possiamo quindi concludere che la misurazione obiettiva delle opacità corneali è di fondamentale rilevanza clinica in quanto da questa dipende l atteggiamento terapeutico da intraprendere. Il miglioramento dell acquisizione della scansione CMTF permetterà di ottenere uno strumento capace di studiare esattamente ogni tipo di opacità corneale. BIBIOGRAFIA 1) Møller-Pedersen T: Keratocyte reflectivity and corneal haze. Exp Eye Res 2004 Mar; 78(3): ) Heitzmann J, Binder PS, Kassar BS, Nordan LT: The correction of high miopia using the excimer laser. Arch Ophthalmol 1993;111: ) Mastropasqua L, Nubile M: Corneal opacities and phototherapeutic keratectomy. Confocal microscopy of the cornea. SLACK Incorporated 2002; 9: ) Møller-Pedersen T, Cavanagh D, Petroll M, Jester JV: Corneal Haze Development After PRK is Regulated by Volume of Stromal Tissue Removal. Cornea 1998 Nov; 17(6): ) Andrade HA, McDonald MB, Liu JC, Abdelmegeed M, Varnell R, Sunderland G: Evaluation of an opacity lensometer for determining corneal clarity following excimer laser photoablation. Refract Corneal Surg 1990 Sep-Oct; 6(5): ) Lesher MP, Lohman LE, Yeakley W, Lass J: Recurrence of herpetic stromal keratitis after a conjunctival flap surgical procedure. Am J Ophthalmol 1992 Aug 15; 114(2): ) Allemann N, Chamon W, Silverman RH, Azar DT, Reinstein DZ, Stark WJ, Coleman DJ: High-frequency ultrasound quantitative analyses of corneal scarring following excimer laser keratectomy. Arch Ophthalmol 1993 Jul; 111(7): ) Binder PS, Bosem M, Weinreb RN: Scheimpflug anterior segment photography assessment of wound healing after myopic excimer laser photorefractive keratectomy. J Cataract Refract Surg 1996 Mar; 22(2): ) Braunstein RE, Jain S, McCally RL, Stark WJ, Connolly PJ, Azar DT: Objective measurement of corneal light scattering after excimer laser keratectomy. 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