Modellistica molecolare

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1 Modellistica molecolare Davide Cittaro e Marco Stefani Master bioinformatica 2003 Introduzione La genomica ha mostrato come la sequenza di aminoacidi di una proteina non sia sufficiente per determinare con precisione la sua struttura, e con essa la sua funzionalità: si è visto infatti che sequenze molto simili, se non addirittura identiche, possono generare proteine con strutture e quindi funzionalità diverse. D altro canto, la capacità di predire la struttura di una proteina, data la sequenza, è importante per essere in grado di analizzare da un punto di vista teorico le funzionalità di proteine sconosciute. Lo scopo è studiare la capacità di interazione della proteina con l ambiente circostante, cioè con le altre proteine e il solvente presenti nella cellula, ma anche come la struttura della proteina cambia in seguito ai cambiamenti ambientali o alle mutazioni della sua struttura. La teoria Uno degli strumenti che cercano di risolvere questo problema è la modellistica molecolare, che, utilizzando le conoscenze sull interazione tra atomi e molecole che derivano dalla chimica e dalla fisica, cerca di determinare la struttura finale della molecola. Questa metodologia è detta ab initio proprio perché si basa sulle caratteristiche fondamentali degli atomi e sulle leggi che determinano le interazioni tra atomi. La modellistica molecolare studia lo stato energetico delle molecole partendo dalle relazioni geometriche e spaziali tra gli atomi che le compongono. Una molecola viene descritta attraverso tre valori, che determinano univocamente le relazioni geometriche e spaziali di qualunque numero di atomi: distanza di legame: è la distanza che separa due atomi angolo di valenza: è l angolo individuato da tre atomi angolo diedro: è l angolo di rotazione tra i due atomi centrali in un sistema di quattro atomi. Viene anche detto angolo di torsione L energia di una molecola è definita come una ipersuperficie detta Superficie di Energia Potenziale (PES), che ha (3N - 6) + 1 dimensioni, dove N è il numero di atomi. Le 6 dimensioni sottratte sono i gradi di libertà legati ai moti esterni; ciò rende il sistema leggermente meno complesso, ma soprattutto lo rende indipendente dalla posizione della molecola rispetto al sistema di riferimento. La PES è una curva continua e quindi in teoria ammette infinite configurazioni; di queste, però, viene cercato solo il sottoinsieme delle configurazioni chimicamente possibili, e di queste, quelle chimicamente più stabili, cioè con derivata prima nulla, hanno un interesse biologico perché sono le configurazioni che la molecola assume con maggiore probabilità.

2 Da un punto di vista teorico, utilizzando le leggi della meccanica quantistica, è relativamente semplice costruire un modello teorico in grado di descrivere con una buona approssimazione il sistema di atomi e la sua evoluzione nel tempo. Purtroppo, quando si abbandona la descrizione analitica per calcolare numericamente lo stato del sistema in un certo istante, la dimensione del problema rende sostanzialmente intrattabile il problema per una tipica proteina di qualche centinaio di aminoacidi. La complessità computazionale è dell ordine di O(N 3 ). Nella realtà, questo metodo è praticabile solo con molecole di qualche decina di atomi. La prima semplificazione è data dall utilizzo della meccanica classica: descrivere gli atomi come entità indivisibili riduce sia il numero di variabili sia la complessità intrinseca del sistema, che scende a circa O(N 2 ). Le relazioni tra gli atomi sono espresse dalla legge di Hooke: gli atomi si comportano come se fossero legati tra loro da molle. L energia interna della molecola è data da due tipologie di parametri: i cosiddetti termini di legame e i termini di non legame. La quantità calcolata è sempre considerata relativa all energia della molecola allo stato naturale, cioè allo stato di minima energia potenziale in condizioni di equilibrio energetico. I termini di legami sono i legati alle relazioni spaziali tra gli atomi; i termini di non legame descrivono le interazioni coulombiane e di Van der Waals, determinate cioè dalla loro carica. Poiché l energia potenziale della molecola in uno stato di non equilibrio non è nota, ma, in condizioni normali, la molecola vibra in un intorno dell equilibrio, è ragionevole approssimare la funzione dell energia intorno al valore di minimo con una espansione in serie di Taylor. Sfruttando una serie di considerazioni matematiche, è possibile semplificare ulteriormente l equazione. La PES di una molecola presenta un numero estremamente elevato di punti stazionari, molti dei quali hanno un energia troppo elevata per essere chimicamente verosimili. Le conformazioni interessanti, quindi, sono quelle che hanno la maggiore probabilità reale di verificarsi e in cui la molecola tende a stabilizzarsi. Questa probabilità è definita dalla probabilità di Boltzman: e Ei / KT p i = Ei / KT e i, dove E i = E 0 - E i e E 0 è il minimo assoluto. La probabilità di Boltzman è funzione della temperatura dell intero sistema: alcune conformazioni sono più probabili a una certa temperatura T. Ma aumentando la temperatura, cresce anche l energia cinetica della molecola, la quale può superare le eventuali barriere energetiche e cadere in un altro minimo. La ricerca dei punti stazionari può utilizzare metodi di calcolo locali o globali, che differiscono essenzialmente nella capacità di superare le barriere potenziali della PES. I metodi locali si basano tutti sulla variazione del gradiente: dato un punto specifico della PES, si cercano le variazioni della geometria della molecola fino a raggiungere il minimo locale che rappresenta l attrattore del punto di partenza. Poiché la derivata prima della funzione dell energia potenziale non è nota, occorre utilizzare delle

3 approssimazioni che danno il valore della derivata in un insieme discreto di punti, partendo dal valore noto della derivata prima del punto di partenza. Il metodo del gradiente segue la direzione dello spostamento dell energia in modo da minimizzare il gradiente, fino ad annullarlo. Esistono due tecniche fondamentali, che nella ricerca vengono usate in successione: metodo Newton-Raphson metodo lineare. I metodi globali si muovono su tutta la PES alla ricerca del minimo globale. Poiché l esplorazione sistematica della superficie è normalmente impensabile, i metodi campionano un sottoinsieme delle possibili conformazioni secondo strategie deterministiche o stocastiche; le conformazioni più promettenti (in genere quelle con energia minima) vengono analizzate con un metodo locale alla ricerca del punto stazionario di attrazione. Dopo un sufficiente numero di campionamenti e dei rispettivi minimi locali, si considera il minimo globale come il punto stazionario di minore energia tra tutti quelli trovati. L unico metodo in grado di garantire il minimo globale è il cosiddetto simulated annealing, che però in pratica non viene usato perché converge troppo lentamente. Tra le tecniche alternative, che non garantiscono il risultato ottimale, ci sono il metodo stocastico Metropolis-Montecarlo: da un valore iniziale dato (seed), l algoritmo genera un insieme casuale di numeri sulla base dei quali si variano le coordinate interne della molecola ottenendo una nuova conformazione; se l energia associata è minore dell energia della configurazione di partenza, la configurazione viene accettata e minimizzata; se l energia è maggiore, si calcola la probabilità di Boltzman p associata alla variazione dell energia tra le due configurazioni e si genera un nuovo numero casuale r: la nuova configurazione viene accettata se p > r. Le configurazioni accettate sono la base per una nuova iterazione, fino a quando si decide di avere trovato il minimo globale. I tempi di convergenza non sono garantiti e c è la possibilità di calcolare più volte la stessa configurazione. La ricerca sistematica è un metodo deterministico, la cui velocità di esecuzione è inversamente proporzionale alla risoluzione della PES, cioè alla dimensione degli incrementi con cui si esplora la PES. D altro canto, è evidente che una bassa risoluzione porta ad un campionamento approssimativo che potrebbe fare perdere molti punti stazionari. Un altro metodo deterministico modifica la funzione dell energia in modo tale che, in un dato intervallo, abbia un solo minimo, che viene trovato iterativamente dividendo l intervallo in sottointervalli sempre più piccoli. Questo metodo garantisce di trovare il minimo, cosa impossibile per i metodi stocastici. La dinamica molecolare analizza l evoluzione della conformazione molecolare nel tempo, cioè cerca di determinare le traiettorie degli atomi della molecola sottoposti alle forze determinate dall energia cinetica del sistema e dalle interazioni tra gli atomi stessi. Per ogni atomo occorre quindi risolvere l equazione fondamentale del moto: ρ ρ dri fi = mi 2. dt

4 L intero sistema di equazioni differenziali viene calcolato ad intervalli regolari, che dipendono dalla frequenza del moto che si vuole studiare. Le vibrazioni molecolari, per esempio, che sono il movimento fondamentale della molecola, sono dell ordine del femtosecondo. Ciò implica, che se si vuole ottenere una istantanea dello stato della molecola, è indispensabile definire gli intervalli di tempo della simulazione dello stesso ordine di grandezza. Le condizioni del sistema all interno del quale si conduce la dinamica molecolare sono fondamentali per determinare l andamento della simulazione. Se si impone che il sistema sia isolato, le forze interne devono rimanere costanti per tutta la dinamica; se inoltre l inizio della dinamica corrisponde allo stato naturale della molecola, allora le forze interne devono essere nulle, cioè i momenti angolare e lineare devono essere conservati. Due parametri fondamentali per la definizione del sistema sono l energia e la temperatura. Poiché ad ogni grado di libertà della molecola corrisponde un energia termica, l energia cinetica del sistema è data da 3N 6 Ki = kbt. 2 i Mantenendo costante uno dei due valori, si ottengono due tipici sistemi: NVE o microcanonico NVT o canonico Entrambi hanno impongono che il numero di molecole e il volume all interno del quale si muovono gli atomi siano costanti. Nel modello microcanonico l energia totale del sistema deve restare costante, in quello canonico la temperatura. Gli esperimenti Utilizzando le tecniche della modellistica molecolare abbiamo cercato di verificare la capacità dei simulatori di riprodurre il ripiegamento di una sequenza di aminoacidi, come normalmente avviene per le proteine; gli esperimenti condotti sono stati essenzialmente due: verificare la stabilità strutturale di una proteina nota, e la ricerca del minimo globale nella PES di una breve sequenza di aminoacidi. STABILITÀ CONFORMAZIONALE Dalla banca dati PDB abbiamo scelto il peptide sintetico 1DNG; la sua struttura non è determinata da un ambiente complesso come è il citoplasma; inoltre è breve (15 residui) e con una sola α-elica, che costituisce il 53,33% della struttura: QAPAYEEAAE ELAKS S HHHHH HHHTT La struttura del polipeptide è stata determinata sperimentalmente tramite NMR, e quindi è un buon punto di riferimento per la verifica dell evoluzione della simulazione.

5 Per questo esperimento abbiamo usato una serie di cicli di meccanica e dinamica molecolare, per vedere l evoluzione nel tempo della struttura e a quale conformazione la ricerca della minima energia potenziale avrebbe portato la molecola. Per la minimizzazione della molecola abbiamo usato il campo di forze Amber94, che è ottimizzato per le sequenze aminoacidiche. La dinamica si svolge in un ambiente canonico, dove cioè la temperatura è costante; tenendo conto che i tempi delle vibrazioni molecolari sono dell ordine del femtosecondo, e che i tempi di folding sono perlomeno dell ordine dei 100 picosecondi, abbiamo stabilito in il numero di iterazioni per ogni ciclo di dinamica. Gli altri parametri delle dinamica non sono stati cambiati; in particolare la temperatura è stata mantenuta a 300K, per conservare le tipiche condizioni dell ambiente cellulare. Le configurazioni campionate sono state 1000; tutte sono state minimizzate, e la migliore è stata utilizzata per il successivo ciclo di dinamica. I valori iniziali della molecola sono riportati in Tabella 1. Il calcolo dei parametri energetici della struttura 1DNG prima della minimizzazione rivela un valore di energia interna positivo, probabilmente imputabile al fatto che la struttura depositata in 1DNG è la struttura media di diverse soluzioni NMR. E str ang stb tor oop ele vdw sol E - sol Iniziale 182,676 35,025 15,473 0,060 82,593 0,060 0,060 44,070 5, ,341 Minimizzata -430,644 9,930 28,407 2,239 70,568 2, ,438-12, , ,280 Tabella 1 - Livelli di energia del peptide 1DNG In soli tre cicli abbiamo notato che l energia potenziale tende a stabilizzarsi, e quindi abbiamo interrotto l esperimento, ritenendo che in queste condizioni non ci sarebbero stati miglioramenti sostanziali. La serie di grafici che seguono (Figura 1, Figura 2 e Figura 3) mostrano l andamento dell energia nei tre cicli che abbiamo eseguito: per ogni campione viene mostrato in blu il livello di energia potenziale assunto durante la dinamica, e in giallo l energia della configurazione dopo la minimizzazione. Si può vedere come l energia della molecola si stabilizzi intorno a 250 Kcal/mol già al primo ciclo, e resti stabile sugli stessi valori anche nelle successive iterazioni.

6 Figura 1 Energie nel primo ciclo di dinamica e minimizzazione Figura 2 - Energie nel secondo ciclo di dinamica e minimizzazione Figura 3 - Energie nel terzo ciclo di dinamica e minimizzazione

7 La seconda serie di grafici mostra la relazione tra l energia potenziale e l energia minimizzata della molecola. Nel primo ciclo, Figura 4, è interessante notare come la maggior parte delle conformazioni campionate durante la dinamica siano compresse in un intervallo piuttosto ridotto di energia dopo la minimizzazione. Questa rappresentazione rafforza l idea che ci sia un grande bacino di attrazione in cui cadono moltissime conformazioni. Nel secondo e terzo ciclo il risultato della minimizzazione sembra essere indipendente dalla scelta del campione, e tutto ricade nello stesso minimo di energia. Figura 4 - Relazione tra energia potenziale e minimizzata al primo ciclo Figura 5 - Relazione tra energia potenziale e minimizzata al secondo ciclo

8 Figura 6 - Relazione tra energia potenziale e minimizzata al terzo ciclo La stabilità riscontrata potrebbe dipendere dalla scelta della temperatura a cui è stata condotta la simulazione: i 300K utilizzati potrebbero non essere sufficienti a superare una ipotetica barriera energetica della PES, e limitare il campionamento in un area diversa da quella del minimo globale. Per questo, abbiamo effettuato un ulteriore ciclo di meccanica e dinamica a 800K, ma i migliori risultati delle energie potenziali minimizzate sono risultate paragonabili ai precedenti, e quindi abbiamo abbandonato la ricerca. Ancora una volta i grafici mostrano che il punto stazionario trovato ha sempre lo stesso livello di energia, nonostante i livelli di energia potenziale dei campioni siano notevolmente più alti, come ci si aspettava data la notevole temperatura del sistema. Figura 7 - Energie nel ciclo di dinamica e minimizzazione a 800K

9 Figura 8 - Relazione tra energia potenziale e minimizzata al ciclo a 800K Anche se è difficile trarre delle conclusioni definitive usando queste metodologie, i nostri esperimenti ci portano a pensare di avere effettivamente trovato un bacino di attrazione molto forte, che forse non coincide con il minimo energetico assoluto da un punto di vista matematico, ma che certamente stabilizza notevolmente la proteina, rendendola insensibile anche a variazioni traumatiche del sistema. Di seguito mostriamo l evoluzione della struttura durante la sequenza di meccanica e dinamica molecolare. L apparente perdita di struttura visibile nelle immagini non contraddice i risultati numerici visti sopra, perché se una piccola variazione di posizione può influire sulla rappresentazione grafica della struttura eliminando la freccia che indica l α-elica, essa non determina variazioni fondamentali nella molecola reale. Figura 9 Struttura tridimensionale originale

10 Figura 10 Struttura tridimensionale dopo il primo ciclo Figura 11 Struttura tridimensionale dopo il secondo ciclo Figura 12 Struttura tridimensionale dopo il terzo ciclo

11 Figura 13 Struttura tridimensionale dopo il ciclo a 800K RICERCA DEI PUNTI STAZIONARI Dalla sequenza della proteina 1DNG abbiamo selezionato i cinque aminoacidi dell αelica Ala Glu Glu Leu Ala. Partendo dalla struttura lineare abbiamo usato la ricerca sistematica e la ricerca stocastica alla ricerca dei punti di minimo, possibilmente globale. La ricerca sistematica La ricerca sistematica è un algoritmo deterministico, la cui capacità di garantire il risultato ottimale dipende solo dalla risoluzione con cui si analizza la PES. Poiché la PES è una superficie continua, la ricerca può essere potenzialmente estremamente dispendiosa dal punto di vista del calcolo, quindi diventa indispensabile trovare il compromesso migliore tra i tempi di esecuzione dell algoritmo e la necessità di avere una buona risoluzione della PES: intervalli troppo ampi nella discretizzazione potrebbero fare mancare il minimo globale. Le conformazioni vengono generate dalle rotazioni degli angoli di torsione. Utilizzando dei passi di 60 o 120 gradi per i 17 angoli diedri della sequenza in esame, il numero di conformazioni generabili supera i 16 miliardi. Dal grafico di Ramachandran relativo ai cinque aminoacidi scelti, considerati all interno di 1DNG (Figura 14), si può vedere come gli angoli φ e ψ non sono multipli di 60º, e quindi non verranno mai individuati dall algoritmo con il passo dato.

12 Figura 14 Grafico di Ramachadran Inoltre, dati i limitati mezzi di calcolo, si è reso necessario un ulteriore aumento dei vincoli di ricerca: abbiamo usato la funzione di minimizzazione del passo offerta da MOE che incrementa gli angoli in modo da campionare il minimo locale dell energia potenziale per quel legame. Con questa euristica il numero di conformazioni trovate si è ridotto a poco più di Di tutte abbiamo calcolato l energia, e minimizzato il 10% con la minore energia. In Tabella 2 riportiamo le 10 migliori conformazioni. Struttura U (Kcal/mol) 1-135, , , , , , , , , ,67 Tabella 2 - Energia potenziale delle strutture minimizzate

13 In Figura 15 è riportata la struttura della conformazione a minore energia potenziale, dalla quale risulta immediatamente che il ripiegamento trovato non ha, purtroppo, alcuna somiglianza con l elica formata dalla sequenza da cui deriva il nostro pentapeptide. Probabilmente, quindi, l euristica utilizzata non permette la soddisfacente esplorazione della PES. Figura 15 Configurazione a minore energia potenziale risultante dalla ricerca sistematica La ricerca stocastica Il campionamento casuale della PES permette di ottenere una visione d insieme dello spazio delle conformazioni della molecola molto più velocemente rispetto alla ricerca sistematica; d altro canto, l algoritmo non è in grado di garantire che troverà la soluzione ottimale, se non in tempi molto lunghi (tendenti all infinito). A questo si aggiunge, come nel caso della dinamica molecolare, il problema della terminazione, perché non ci sono strumenti matematici in grado di valutare la probabilità di avere raggiunto effettivamente il minimo globale. Nella nostra ricerca abbiamo mantenuto i parametri proposti da MOE, escludendo però l inversione dei centri chirali nella generazione delle strutture, dal momento che in natura la conformazione del carbonio α è sempre levogira. Le strutture analizzate durante la ricerca sono state , da cui sono state selezionate sei configurazioni, che abbiamo minimizzato, e i cui livelli di energia sono riportati in Tabella 3.

14 Struttura U (Kcal/mol) 1-72, , , , , ,28 Tabella 3 Energia potenziale delle strutture minimizzate Della configurazione a minore energia potenziale è riportata la struttura in Figura 16, dalla quale risulta che il ripiegamento trovato non ha neppure in questo caso alcuna somiglianza con un α-elica. Il numero di strutture esplorate è decisamente troppo piccolo per poter pensare di ottenere risultati interessanti, e confrontando questo numero con quelli generati dalla ricerca sistematica l esplorazione della PES è decisamente superficiale. Ciononostante l ordine di grandezza dell energia delle conformazioni trovate è paragonabile a quello delle conformazioni trovate dalla ricerca sistematica. In più è interessante notare come le conformazioni generate con i due differenti algoritmi siano simili, almeno nella disposizione dello scheletro, che si ripiega a ferro di cavallo. Le differenti disposizioni delle catene laterali sono evidentemente le principali responsabili delle differenze energetiche tra le due molecole. Figura 16 Configurazione a minore energia potenziale risultante dalla ricerca stocastica

15 Dare una valutazione della qualità dei risultati non è semplice: in generale non si hanno informazioni sulla struttura che si dovrebbe ottenere, e quindi l esperienza del ricercatore diventa un fattore fondamentale per capire se la ricerca sta dando dei frutti, se si continuando l esplorazione si possono ottenere miglioramenti, e, in definitiva, quando interrompere la ricerca. Nel nostro caso constatiamo che due metodologie diverse convergono a risultati simili, e questo ci porta a pensare che con questo livello di dettaglio nella ricerca non si possono ottenere risultati migliori di quelli ottenuti.