RPR
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- Maria Villa
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1 RPR KIT PER LA RILEVAZIONE QUALITATIVA E SEMIQUANTITATIVA DI ANTICORPI ASSOCIATI ALLA SIFILIDE NON TREPONEMICI (REAGINE) NEL SIERO O NEL PLASMA UMANO MEDIANTE AGGLUTINAZIONE MACROSCOPICA SU CARTONCINI PER TEST MONOUSO /12
2 INDICE 1. USO PREVISTO RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST PRINCIPI DELLA PROCEDURA REAGENTI AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI CAMPIONI PROCEDURA LIMITAZIONE DEL TEST CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI [IT] 1
3 1. USO PREVISTO I kit RPR sono destinati all'uso per la rilevazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi associati alla sifilide non treponemici (reagine) nel siero e nel plasma umano come ausilio nella diagnosi dell infezione da sifilide. 2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST La sifilide è un'infezione cronica che progredisce attraverso stadi distinti di infezione: primario, secondario, terziario e quaternario. Questi stadi producono sintomi clinici di vario tipo, tipicamente causando delle ulcere iniziali (cancrena) e quindi eruzione sifilitica seguita da lunghi periodi di latenza. L'infezione non trattata può infine causare problemi cardiovascolari e neurosifilide. L'infezione è sostenuta dalla spirocheta Treponema pallidum e si acquisisce generalmente con il rapporto sessuale, ma la malattia può trasmettersi anche con la trasfusione di sangue infetto. Si verificano anche infezioni intrauterine. L'organismo si è dimostrato praticamente impossibile da coltivare su supporti artificiali, e la diagnosi di infezione dipende in genere dalla conferma della presenza di anticorpi nel sangue, che compaiono poco dopo l'infezione iniziale e possono persistere per molti anni. I test della sifilide rientrano in quattro categorie: esame microscopico diretto, test degli anticorpi anti-treponema, test non basati sugli anticorpi anti-treponema e test diretti dell'antigene. Il test RPR (Reagina Plasmatica Rapida) è un test non treponemico, in quanto gli anticorpi rilevati non sono specifici per il T pallidum, sebbene la loro presenza nel siero o nel plasma del paziente sia fortemente associata ad un infezione da parte di questo organismo. Questo tipo di test misura gli anticorpi (IgG e igm) prodotti come risposta al materiale lipoideo rilasciato dalle cellule ospite danneggiate, come pure il materiale analogo alle lipoproteine rilasciato dalle spirochete. Gli anticorpi tendono a scomparire dopo il trattamento efficace dell infezione. 3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA I kit RPR utilizzano particelle di carbone rivestite con una miscela di antigeni lipidici, che si combinano con l anticorpo reagina presente nel siero o nel plasma del paziente. Le particelle sono sospese in un supporto che contiene componenti in grado di eliminare reazioni non specifiche. Le reazioni positive sono contraddistinte dall agglutinazione macroscopica (aggregati) di particelle. Sebbene il kit abbia come destinazione d uso primaria l analisi qualitativa, i livelli di anticorpi possono essere titolati mediante diluizione al raddoppio. I pattern di agglutinazione vengono interpretati ad occhio nudo. [IT] 2
4 4. REAGENTI 4.1. Descrizione Identificazione sull'etichetta R1 RPR Antigen R2 Positive control R3 Negative control Descrizione Antigene RPR Particelle di carbone rivestite di antigene di cardiolipina, lecitina e colesterolo in tampone fosfato Controllo positivo Siero umano contenente anticorpi associati al T. pallidum,, negativo per antigene HBs, anticorpi anti-hiv1/2 e anti-hcv, diluito in tampone fosfato. Controllo negativo Presentazione test 500 test 1 fiala 2 ml 1 fiala 1 ml 1 fiala 10 ml 1 fiala 2 ml 1 fiala Siero di coniglio in tampone fosfato 1 ml Flacone dosatore (riutilizzabile) 1 1 Ago dosatore (riutilizzabile) 1 1 Cartoncini per test (10 pozzetti) fiala 2 ml 4.2. Requisiti di conservazione e trattamento Questo kit deve essere conservato a +2-8 C. Conservare le bottiglie in posizione verticale. Non congelare. Ogni articolo del kit conservato a +2-8 C può essere utilizzato fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti R1, R2 e R3 conservati a +2-8 C possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. 5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale Precauzioni per la salute e la sicurezza: Questo kit di test deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti e protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio. I materiali di controllo forniti sono derivati da siero umano. Sono stati testati a livello di donatore e sono risultati negativi per antigene HBs, anticorpi anti-hiv1/2 e anti-hcv. Nessun metodo di test conosciuto è in grado di garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi. Tutti gli emoderivati umani, i reagenti e i campioni umani, pertanto, devono essere manipolati con la consapevolezza che si tratta di sostanze in grado di trasmettere malattie infettive ed è necessario seguire le precauzioni generali per gli agenti patogeni ematici raccomandate nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. [IT] 3
5 Versamenti biologici: I versamenti di materiale di origine umana devono essere trattati come sostanze potenzialmente infettive. I versamenti non contenenti sostanze acide devono essere immediatamente decontaminati e asciugati. A questo scopo, disinfettare l'area in cui è avvenuto il versamento, i materiali ed eventuali superfici o apparecchiature contaminate utilizzando un disinfettante chimico appropriato efficace per i materiali a potenziale rischio biologico relativi ai campioni coinvolti (generalmente, una diluizione 1:10 di candeggina per uso domestico, 70-80% di etanolo o isopropanolo, uno iodoforo allo 0,5% quale Wescodyne Plus, ecc.). I versamenti contenenti sostanze acide devono essere adeguatamente assorbiti (asciugati con un panno) o neutralizzati, l'area deve essere lavata con acqua e asciugata; il materiale utilizzato per assorbire il versamento può richiedere lo smaltimento come rifiuto a rischio biologico. L'area deve essere quindi decontaminata con un disinfettante chimico. NOTA: Non collocare le soluzioni contenenti candeggina in autoclave. Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo Precauzioni relative alla procedura Preparazione L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle seguenti pratiche di laboratorio corrette. Non mescolare, né unire reagenti appartenenti a numeri di lotto differenti all'interno di un unico ciclo. Non utilizzare reagenti scaduti. Prima dell'uso attendere 30 minuti che i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente (18-30 C) Elaborazione Non modificare la procedura di dosaggio. Utilizzare una nuova distribuzione per ciascun campione. Non toccare la superficie di reazione dei cartoncini per agglutinazione. 6. CAMPIONI I campioni di siero o plasma (EDTA, citrato di sodio, eparina sodica e ACD) devono essere privi di cellule ematiche. Prima del test, possono essere conservati per un massimo di 7 giorni ad una temperatura di 2-8 C. I campioni che devono essere conservati per periodi di tempo più lunghi devono essere congelati a una [IT] 4
6 temperatura non superiore a -20 C. I campioni congelati devono essere scongelati e miscelati accuratamente prima del test. Non ripetere più di 5 cicli di congelamento/scongelamento. I campioni riscaldati a 56 C per 1 ora non compromettono i risultati. I campioni contenenti fino a 120 g/l di albumina, 200 mg/l di bilirubina, 33 g/l di trioleina e i campioni contenenti fino a 2 g/l di emoglobina non compromettono i risultati. Si sconsiglia tuttavia di utilizzare campioni iperemolizzati e iperlipemici. Per essere spediti, i campioni devono essere confezionati in conformità con le disposizioni vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici e trasportati preferibilmente congelati. 7. PROCEDURA 7.1. Materiali necessari Materiale fornito Flacone contagocce e ago contagocce monouso correttamente calibrati per dispensare le particelle di carbone Materiali necessari ma non forniti Rotatore per cartoncini di test a 100 rpm, in un cerchio del diametro approssimativo di 1 cm. Pipetta e puntali correttamente calibrati e mantenuti per erogare un volume di 50 µl. Soluzione salina allo 0,9% (per la procedura semiquantitativa) 7.2. Procedura di dosaggio I controlli positivo (R2) e negativo (R3) del test devono essere utilizzati ad ogni ciclo di test Test qualitativo 1. Collocare 50 µl di campione o di controllo in un cerchio sul cartoncino di test. 2. Stendere uniformemente il campione e i controlli nell area del cerchio. 3. Agitare la fiala di antigene RPR per garantire la corretta miscelazione immediatamente prima dell uso per evitare la sedimentazione. 4. Inserire l ago contagocce nel flacone contagocce e aspirare l antigene RPR. 5. Capovolgere il flacone contagocce e premere delicatamente per espellere l aria dall ago. 6. Reggendo il flacone contagocce in posizione verticale sopra il campione da analizzare, dispensare una singola goccia di antigene RPR. 7. Collocare il cartoncino di test sul rotatore e far girare a 100 rpm per 8 minuti. 8. Effettuare immediatamente la lettura e interpretare i risultati a occhio nudo in condizioni di buona illuminazione. (Fare riferimento alla sezione 7.4.) Nota: Se non è possibile effettuare la lettura immediatamente, i cartoncini devono essere lasciati sul rotatore per 15 minuti al massimo. 9. Ritrasferire l antigene inutilizzato dal flacone contagocce alla fiala di vetro. 10. Pulire accuratamente il flacone e l ago contagocce con acqua distillata e lasciare asciugare prima del successivo utilizzo. [IT] 5
7 Test semi-quantitativo 1. Eseguire diluizioni al raddoppio da non diluito a 1:16 in soluzione salina allo 0,9%. 2. Collocare 50 µl di ciascuna diluizione e dei controlli in un cerchio separato sul cartoncino di test. 3. Stendere uniformemente ogni diluizione sull area del cerchio. 4. Continuare come descritto nella sezione 3 del test qualitativo. Il titolo del campione si esprime come il reciproco della massima diluizione che ha manifestato l agglutinazione delle particelle di carbone. Se la massima diluizione testata (1:16) è reattiva, procedere con un ulteriore serie di diluizioni preparando diluizioni al raddoppio del campione da 1:32 a 1:512 utilizzando soluzione salina allo 0,9%. Miscelare accuratamente e continuare la procedura dalla sezione 2 del test semiquantitativo Controllo qualità Utilizzare i controlli positivo (R2) e negativo (R3) a ogni esecuzione del test per confermare il dosaggio Interpretazione dei risultati e criteri per la validazione del test Reattivo forte (RF): Ampi aggregati di particelle di carbone con sfondo chiaro. Reattivo (R): Ampi aggregati di particelle di carbone piuttosto dispersi rispetto al reattivo forte. Reattivo debole (RD): Piccoli aggregati di particelle di carbone con sfondo grigio chiaro. Reattivo in tracce (TR) Lieve aggregazione di particelle di carbone che di norma formano un bottone di aggregati al centro del cerchio di test o dispersi lungo il bordo del cerchio di test. [IT] 6
8 Non reattivo (NR): Tipicamente, un pattern di colore grigio tenue o un bottone di particelle di carbone non aggregate al centro del cerchio di test oppure un ampio anello di particelle di carbone senza alcuna aggregazione all interno. I campioni reattivi devono essere registrati come positivi all anticorpo e (a causa della natura non specifica degli anticorpi rilevati) devono essere sottoposti a ulteriori test per stabilire la presenza o l assenza di anticorpi anti-treponema specifici. Affinché il dosaggio sia valido, il controllo positivo deve avere come risultato un pattern reattivo forte, e il controllo negativo deve avere come risultato un pattern non reattivo. 8. LIMITAZIONE DEL TEST Non è disponibile un singolo test o uno standard di riferimento definitivo per ogni stadio della malattia. La diagnosi di sifilide si basa dunque prevalentemente sui test sierologici e richiede i risultati di metodi troponema-specifici e non. I risultati falsi positivi si riconoscono per il fatto che la lettura non si verifica immediatamente dopo la rotazione. Il test RPR al carbone non è specifico per la sifilide. Tutti i campioni reattivi devono essere sottoposti a ulteriori test con metodi treponemici, come ad esempio il TPHA, per confermare i risultati. 9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI 9.1. Studio di precisione Per lo studio della ripetibilità, un pannello di campioni costituito da 1 campione negativo, 1 campione basso positivo (titolo 1:4) e un campione positivo (titolo 1:16) è stato testato in 8 repliche durante lo stesso ciclo. Per gli studi della precisione intermedia e della riproducibilità interlotto, i campioni sono stati studiati in 2 repliche al giorno per 5 giorni (affidando la lettura a due diversi operatori) e su due lotti diversi Ripetibilità Tutte le repliche dei campioni negativi hanno dato risultati negativi e tutte le repliche dei campioni positivi hanno dato risultati positivi Precisione intermedia / riproducibilità interlotto Tutte le repliche dei campioni negativi hanno dato risultati negativi e tutte le repliche dei campioni positivi hanno dato risultati positivi, a prescindere dalle condizioni. [IT] 7
9 9.2. Prestazioni cliniche Specificità Lo studio retrospettivo della specificità è stato condotto su 102 campioni di siero congelati ottenuti dall attività di routine del laboratorio di un centro per le malattie a trasmissione sessuale, in Francia. I risultati del dosaggio RPR per la sifilide sono stati confrontati con un dosaggio RPR/VDRL a marchio CE. Numero totale di campioni Reattivo iniziale (RI) Reattivo ripetuto (RR) Specificità RR (%) IC 95% (equivoco) 0 100% 102/102 [96,4% 100,0%] Su 102 campioni, 2 campioni sono risultati equivoci. Dopo la ripetizione del test, tutti i campioni sono risultati negativi. La specificità diagnostica sui campioni retrospettivi è stata di 102/102 (100%) con un intervallo di confidenza al 95% di [96,4% - 100,0%] Sensibilità Lo studio retrospettivo della sensibilità è stato condotto su 101 campioni di siero congelati ottenuti dall attività di routine del laboratorio di un centro per le malattie a trasmissione sessuale, in Francia. I risultati del dosaggio RPR per la sifilide sono stati confrontati con un dosaggio RPR/VDRL a marchio CE. Numero totale di campioni Reattivo iniziale (RI) Reattivo ripetuto (RR) Specificità RR (%) IC 95% (1 equivoco) % 101/101 [96,4% 100,0%] Su 101 campioni, 1 campione è risultato equivoco. Dopo la ripetizione del test, tutti i campioni sono risultati positivi. La specificità diagnostica sui campioni retrospettivi è stata del 100% (101/101) con un intervallo di confidenza al 95% di [96,4% - 100,0%] Specificità analitica / studio di reattività crociata La specificità analitica del dosaggio RPR per la sifilide è stata valutata su un totale di 65 campioni con reattività crociata selezionati da pazienti con altre patologie infettive e/o altre condizioni che possono dare un risultato falso positivo a causa della non specificità (fattore reumatoide, malattia di Lyme, EBV, rosolia, leptospirosi, LES (lupus), epatite B, epatite C, HIV 1/2, donne multipare e donne in gravidanza). La specificità del dosaggio è stata del 100,0% (65/65), con un intervallo di confidenza al 95% di [94,5% - 100,0%]. [IT] 8
10 9.4. Effetto prozona Tre (3) campioni con livelli di positività molto elevati per sifilide Ab (>1:128) sono stati testati, diluiti e non diluiti, per verificare l assenza di effetto prozona. Tutti i campioni positivi non diluiti sono positivi. Non si riscontra nessun effetto prozona con titoli fino a 1: RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI. 1. Larsen SA.,Pettit, et coll., EDTA treated plasma in the Rapid Plasma Reagin card test and the toluidine red unheated serum test for serodiagnosis of syphilis. J Clin Microbiology 1983;17; Larsen S.A., Pope V., et coll., A manual of Tests for Syphilis. 9th Edition ;1998; Portnoy J. Modifications of the rapid plasma reagin (RPR) card test for syphilis, for use in large-scale testing.am J Clin Pathol;1963;40; Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev Apr; 12(2): Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med : [IT] 9
11 [IT] 10
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