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1 Struttura dei batteri

2 Forma(1/3) Organismi sferici la cui dimensione varia da 0.5 a 1 µm di diametro, si osservano spesso in gruppi a causa della incompleta separazione delle singole cellule, durante il processo riproduttivo. Forma sferica= cocco. Quando la divisione avviene lungo lo stesso piano si formano catene; 2 cocchi appaiati = Diplococchi Catene da 4 a 20 = Streptococchi. Quando la divisione avviene secondo 2 piani differenti = tetradi

3 Quando la divisione avviene secondo 3 piani in maniera regolare= Sarcine Quando la divisione avviene secondo 3 piani in maniera irregolare= Stafilococchi Forma(2/3) La forma bastoncellare è detta bacillo (lunghezza da 1 a 10 µm) Due bacilli insieme Diplobacilli Catene di diplobacilli vengono chiamate Streptobacilli

4 Forma(3/3) Palizzate formate da bacilli appaiati in forma ad X, V o Y Forme spiraliformi rigide sono chiamate spirilli. Se l organismo è flessibile ed ondulante viene chiamato Spirocheta. Forme squadrate sono gli Archebatteri. Pleomorfi- Forme differenti della stessa specie (Micoplasmi)

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6 - La varietà dei Batteri Esiste una limitata variabilità di forme batteriche Bastoncellare = bacilli (sing. bacillus). (Pseudomonas aeruginosa colorazione Gram)

7 Sferica = cocci (sing. coccus). Gram-positivi (roso/blu) cocchi, e una serie di Gram-negativi (rossi) cocchi. Il microrganismo che più frequentemente infetta la cute è lo Staphylococcus aureus, i microrganismi più giovani sono G+ i più vecchi G-

8 Spiraliformi = spirilli (sing. spirillum). Forme Filamentose. Comune tra gli actinomyceti. Possono crescere in forma filamentosa nota come mycelio.. Anche noti come cyanobatteri.

9 Struttura (1/2) La Capsula:rivestimento mucoso, il quale consiste di polisaccaridi e acqua che circonda molte cellule batteriche. Difficile da colorare, poiché è composta principalmente d acqua. Parete cellulare:rivestimento rivestimento rigido che circonda la cellula batterica. Fatta di peptidoglicano nei batteri, di altri componenti negli archaea. Membrana cellulare:flessible, barriera semi-permeabile con un centro lipidico che controlla la diffusione all interno ed all esterno della cellula.

10 Struttura (2/2) Citoplasma:lo lo spazio ripieno di fluido all interno della cellula. Contiene centinaia di differenti enzimi, unitamente a ribosomi, DNA, RNA, ed un pool di milioni di piccole molecole e ioni. Ribosomi:particelle fatte di proteine ed RNA, siti dell assemblaggio delle proteine. I Ribosomi possono occupare il 25% del volume di una tipica cellula batterica. Cromosoma:il DNA di una cellula, normalmente una molecola circolare unica. Le cellule in attiva divisione possono contenere 2 o anche 4 copie di questo cromosoma, replicato e pronto per essere diviso tra le future cellule figlie.

11 Matrice Extra Cellulare È adesa alla parete cellulare ed è composta di polisaccaridi o polipeptidi,, o di una combinazione di entrambi per formare un rivestimento viscoso. Quando questo strato aderisce con forza alla superficie della cellula ed è chiaramente differenziabile dall ambiente circostante, viene chiamata capsula. Se è disorganizzata e blandamente adesa è chiamata glicocalice Entrambe non sono osservabili con colorazioni semplici ma possono essere osservate con colorazioni negative.

12 Funzioni delle Capsule a) Aderire alle superfici per formare colonie b) Antifagocitaria c) Antigene d) Proteggere l organismo dalla disidratazione Non si trova in tutti i batteri. Varia in spessore e rigidità. Molti batteri perdono la capsula quando vengono coltivati in laboratorio. L adesione batterica promuove le formazione di biofilms, masse di batteri organizzati in larghi aggregati di matrice extracellulare. Molti batteri possono vivere principalmente in biofilms piuttosto che come forme libere. I Biofilms sono più difficili da eliminare e più resistenti agli antibiotici.

13 Batteri che posseggono una capsula con attività antifagocitaria: Streptococcus pneumoniae Clostridium perfringens (agente delle gangrene gassose) Bacillus anthracis (agente del carbonchio ematico) Klebsiella pneumoniae (agente della polmonite)

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15 Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae is a leading cause of pneumonia in all ages (particularly the young and old), often after "damage" to the upper respiratory tract (e.g. following viral infection). It also causes middle ear infections (otitis media). The organism often spreads causing bacteremia and meningitis. S. pneumoniae is α hemolytic

16 a- hemolytic optochin sensitive ALPHA HEMOLYSIS- a greenish discoloration of the blood agar in a zone surrounding or beneath the colonies. The word "viridans" means green and these a-hemolytic streptococci are often called "viridans" streptococci.

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18 It is difficult to distinguish normal alpha streptococci found in the mouth from the pathogenic Streptococcus pneumoniae. Both are alpha-hemolytic on blood agar and so must be distinguished using the "P" disk (optochin). S. pneumoniae (A) is sensitive while S. mitis (B) is resistant

19 Streptococcus pneumoniae virulence is multi-faceted. Important pneumococcal virulence factors include: the capsule; the cell wall; choline-binding proteins; pneumococcal surface proteins A and C (PspA and PspC); the LPXTGanchored neuraminidase proteins; hyaluronate lyase (Hyl); pneumococcal adhesion and virulence A (PavA); enolase (Eno); pneumolysin; autolysin A (LytA); and the metal-binding proteins pneumococcal surface antigen A (PsaA), pneumococcal iron acquisition A (PiaA) and pneumococcal iron uptake A (PiuA).

20 Parete cellulare Rivestimento rigido, preserva la forma cellulare. La funzione più importante è di proteggere fisicamente la cellula Si compone di peptidoglicano (mureina o mucopeptide) = un polimero di peptidi (tipicamente composti di 4-5 aminoacidi,, legati ad altre catene) e glicani (composti da aminozuccheri modificati) Aminozuccheri: N-acetil-glucosamina (NAG). N-acetil-muramico (NAM). NAG-NAM NAM sono uniti da legami ß-1,4.

21 Parete cellulare Rivestimento rigido, preserva la forma cellulare. La funzione + importante è di proteggere fisicamente la cellula è composta di sostanze presenti solo nel mondo microbico se proveniente da particolari batteri può indurre sintomi di malattia rappresenta il bersaglio di alcuni farmaci antibatterici permette la distinzione in G+ e G- Si compone di peptidoglicano (mureina o mucopeptide) = un polimero di peptidi (tipicamente composti di 4-5 aminoacidi, legati ad altre catene) e glicani (composti da aminozuccheri modificati) Aminozuccheri: N-acetil-glucosamina (NAG). N-acetil-muramico (NAM).

22 Il peptidoglicano (o mureina) costituisce uno strato nella parete cellulare dei batteri che è il principale responsabile della rigidità della cellula. È costituito da una ripetizione di lamine sottili composte di glican tetrapeptide legate insieme da legami crociati tetrapeptidici tra amminoacidi delle unità adiacenti. Il glican tetrapeptide è frutto di due derivati polisaccaridici, N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico e da un piccolo gruppo di aminoacidi.

23 Peptidoglicano: È presente solo nei batteri. L acido N-acetilmuramico e l acido diaminopimelico sono del tutto assenti nella parete cellulare degli Archea e degli Eucarioti. Considerazioni generali sulla struttura del peptidoglicano: La porzione glicanica è costante e contiene solo N-acetilglucosamina e acido N- acetilmuramico, collegati tra loro sempre da un legame β-1,4. Il tetrapeptide dell unità di ripetizione (L-alanina, acido D-glutammico, acido diaminopimelico, D-alanina) presenta essenzialmente una sola sostituzione amminoacidica, alternando la presenza dell acido diaminopimelico con la lisina. Si conoscono almeno 100 tipi diversi di peptidoglicano e la regione maggiormente variabile è il ponte peptidico. Che aminoacidi ci sono nel ponte peptidico? Sia quelli presenti nel tetrapeptide, sia la glicina, treonina, serina e acido aspartico. Alcuni non saranno mai presenti nel ponte: quelli a catena ramificata, quelli aromatici, quelli contenenti zolfo, l istidina, l arginina e la prolina. Il peptidoglicano rappresenta fino al 90% del materiale di parete nei Gram-positivi e il 10% della parete nei Gram-negativi

24 Il peptidoglicano è esclusivo del dominio dei Bacteria: sia l'acido N-acetilmuramico sia il DAP (acido diaminopimelico) sono del tutto assenti nella parete cellulare degli Eukarya e degli Archea. In questi ultimi è invece possibile trovare un costituente polisaccaridico molto simile, noto come pseudopeptidoglicano.

25 Struttura chimica del peptidoglicano (simboli: G = NAG, M = NAM)

26 NAG e NAM si alternano formando un polimero ad alto peso molecolare. A livello dell NAM si legano catene peptidiche laterali (L- alanina, acido D glutammico, L-lisina, D-alanina, D- alanina): si forma così ilmuramilpeptide. In Escherichia coli (G-) le catene peptidiche sono 4 aminoacidi (L-alanina, acido D glutammico e acido diaminopimelico). Le catene polipeptidiche si legano tra loro attraverso catene pentagliciniche nello Staphylococcus aureus (Gram +) oppure per legami semplici nei Gram -.

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28 FIGURE 2-8 Diagrammatic representation of peptidoglycan structures with adjacent glycan strands cross-linked directly from the carboxyterminal D-alanine to the e-amino group of an adjacent tetrapeptide or through a peptide cross bridge,n-acetylmuramic acid; N- acetylglucosamine.

29 Gram Positivi: Possiedono uno spesso strato di peptidoglicano e 2 classi di acidi teicoici: Acido Lipoteicoico che si trova in superfice, incluso nello strato di peptidoglicano ed è legato alla membrana citoplasmatica. L acido teicoico di parete si trova sulla superfice ed è legato solo allo strato di peptidoglicano L acido teicoico è responsabile per I determinanti antigenici di un organismo

30 The Gram Positive Cell Wall

31 Electron micrograph of a thin section of the Gram-positive M lysodeikticus showing the thick peptidoglycan cell wall (cw), underlying cytoplasmic (plasma) membrane (cm), mesome (m), and nucleus (n)

32 La parete dei G- Come i G+ PG costituente di parete ma Il PG è solo il 10% della parete Posseggono una pseudocapsula differenziabile in 2 strati al ME (membrana biologica tipica trilaminare) Si compone di un doppio strato fosfolipidico in cui sono proteine, lipoproteine e lipopolisaccaridi (le lipoproteine ancorano la pseudocapsula al peptidoglicano.

33 La parete dei G- Le proteine della matrice sono responsabili della permeabilità di tale membrana assumendo funzione di canale transmembrana (porine). I lipopolisaccaridi (LPS)) (40% della parete), conferiscono inportanti caratteristiche antigene e tossiche ai batteri G-

34 The Gram Negative Cell Wall G - cell walls have a more complicated structure. There are two separate areas with an additional membrane besides the cellular membrane. Outside of the cytoplasmic membrane (CM) is a open area called the periplasmic space. Beyond this is a thin layer of peptidoglycan. Finally, external to the peptidoglycan is an additional membrane, the outer membrane (OM).

35 Diagrams of the cell wall structure of Gram-negative (left) and Grampositive bacteria. Key: peptidoglycan layer (yellow); protein (purple); teichoic acid (green); phospholipid ( brown); lipopolysaccharide (orange).

36 The table summarizes the difference between G- and G+ cell walls Property Gram Positive Gram Negative Thickness of wall nm 10 nm Number of layers in wall 1 2 Peptidoglycan content >50% 10-20% Teichoic acid in wall + - Lipid and lipoprotein content 0-3% 58% Protein content 0% 9% Lipopolysaccharide 0 13% Sensitive to penicliiin + - (not as) Digested by lysozyme + - (not as much)

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38 Lipopolisaccaridi (LPS) Sono composti da : Una catena terminale polisaccaridica (catene oligosaccaridiche ripetute) che differendo tra i diversi batteri ne conferisce l antigenicità (antigene somatico o antigene O). Un core polisaccaridico (elemento costante per composizione) Molecola di legame (chetodesossizucchero KDO, molecola che ritrova esclusivamente nei batteri) molecola che si un lipide A (glicofosfolipide) parte di LPS responsabile dell attività tossica. Composto da acidi grassi (capronico, laurico, miristico, palmitico e stearico). Antigene O: tipizzazione sierologia (serovar) (esempio Salmonella antigene O ed H.) Lipide A: endotossine (febbre, shock, altri sintomi generali di malessere)

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41 Flagelli & Chemiotassi I flagelli sono lunghi filamenti proteici composti di flagellina consistono di un filamento e di una regione basale. L a regione basale possiede un uncino ed un corpo basale che è composta di un sostegno ed anelli. I G+ hanno due anelli, uno nella parete batterica ed uno nella membrana. I G- hanno 4 anelli, 2 nella parete e 2 nella membrana

42 Insertion of flagella into bacterial cells of different types Insertion of flagella into bacterial cells of different types

43 Typical arrangements of bacterial flagella

44 I flagelli hanno diversi tipi di organizzazione Monotrichi Peritrichi Flagello posizionato ad un polo:. Ex: Pseudomonas aeruginosa Peritrichi Ex: E. coli Lofotrichi Anfitrichi I batteri provvisti di flagelli possono muoversi secondo gradienti, VERSO SOSTANZE ATTRAENTI, LONTANO DA SOSTANZE REPELLENTI Il meccanismo alla base di tale fenomeno è complesso ed è legato alla membrana; (1) recettori proteici di membrana si legano a sostanze chimiche; (2) le proteine di membrana trasmettono il segnale.

45 Bacterial flagella. Le colonie di batteri mobili (Proteus) appaiono più grandi fenomeno dello swarming, sciamaggio

46 La rotazione in senso antiorario permette ai flagelli di riunirsi in un fascio coerente che permette il movimento in un'unica direzione verso la sostanza attraente. La rotazione in senso orario - i flagelli si allontanano l uno dall altro il batterio avrà movimenti disordinati e di retromarcia. Nel caso di flagelli peritrichi la rotazione in senso orario provoca movimenti improvvisi di cambio di direzione Filamenti si rinvengono nelle spirochete e sono simili ai flagelli ma localizzati sotto la parete cellulare e sono adese a ciascuna delle estremità del microorganismo

47 Fimbrie & pili Sono strutture piccole, composte di proteine analoghe a quelle dei flagelli ma non coinvolte nella mobilità (Gram -). Posseggono importanti funzioni nell adesione (e.g. gonnorhaea) ed essendo di natura proteica posseggono potere immunogeno Se ne distinguono due tipi: Pili Sessuali (coniugazione Pili F) per il trasferimento del DNA extracromosomiale tra un donatore ed un ricevente Pili comuni o di adesione o Fimbrie. Fimbrie. Ne esistono molti e sono utilizzati per l adesione alle superfici e sono fattori di virulenza. (E. coli enterotossigeni Neisseria gonorhoeae)

48 Electron micrograph of negatively stained E coli showing wavy flagella and numerous short, thinner, and more rigid hairlike structures, the pili.

49 Esame a fresco I preparati possono essere allestiti in vario modo: Preparati su vetrino porta-oggetti oggetti con copri-oggettooggetto Preparati a goccia pendente su cellula di Koch, per il rilievo della mobilità dei batteri Preparati a fresco su fondo scuro, con inchiostro di china Preparati a fresco colorati vitalmente, con coloranti scarsamente tossici, quali ad es. blu di metilene, rosso Congo, rosso neutro..

50 Esame su preparati colorati Tecnica di allestimento: Distensione: a seconda del materiale, quello non liquido va sospeso in una goccia di soluzione fisiologica; sangue o pus vanno strisciati su vetrino porta-oggettooggetto Distensione: Essiccamento: all aria o al calore Fissazione: chimicamente con alcool etilico assoluto (10 min), o alcool ed etere 1:1 (5 min), o alcool metilico (2-3 min) e lavaggio con acqua; fisicamente cioè sulla fiamma a gas ( C) Fissazione: Colorazione: secondo le esigenze, termina sempre con il lavaggio in acqua Asciugamento: con carta bibula o con calore moderato dopo aver allontanato per scuotimento la maggior parte dell acqua Asciugamento: Osservazione microscopica: se si usano obiettivi ad immersione deporre sul preparato una goccia di olio di legno di cedro. I preparati che si desidera conservare vanno ricoperti con vetrino copri-oggetto oggetto ed inclusi in balsamo del Canada.

51 FISSAZIONE A CALORE FISSAZIONE CHIMICA preserva la morfologia ma non le strutture interne ETANOLO ACIDO ACETICO CLORURO DI MERCURIO GLUTARALDEIDE FORMALDEIDE preserva le strutture subcellulari COLORAZIONE Colorare i batteri consente di: vedere maggiore contrasto tra l organismo e lo sfondo differenziare vari tipi morfologici osservare determinate strutture subcellulari

52 I composti utilizzati per colorare i microrganismi: - Contengono CROMOFORI (gruppi chimici che conferiscono alla sostanza il suo colore) - Si legano alle strutture cellulari mediante legami ionici, covalenti o idrofobici COLORANTI ACIDI: la porzione colorata della molecola ha una carica negativa. Affinità per il materiale citoplasmatico. EOSINA, FUCSINA ACIDA, ROSSO CONGO, FLUORESCEINA, ACIDO PICRICO COLORANTI BASICI: la porzione colorata della molecola ha una carica positiva. Affinità per le strutture nucleari della cellula. BLU DI METILENE, FUCSINA BASICA, SAFRANINA, CRISTAL VIOLETTO COLORANTI COMPOSTI: si ottengono mescolando gli acidi e i (O NEUTRI) basici, colorano le strutture cellulari in modo diverso a seconda se acidofile o basofile

53 Metacromasia Quando la sostanza colorante impartisce una colorazione diversa da quella propria Gli elementi che manifestano questa caratteristica si dicono cromotropi Sostanze mordenzanti sono quelle che facilitano la fissazione dei coloranti: Possono essere impiegate prima o dopo l uso della soluzione colorante, oppure mescolate alla stessa. acido fenico, soluzione iodo-iodurata iodurata di Lugol, tannino, acqua di anilina

54 SOSTANZE MORDENZANTI: aumentano l efficienza della colorazione permettendo al colorante di legarsi con maggiore affinità SOSTANZE FLUORESCENTI: hanno la capacità di emettere luce se illuminate ad una determinata lunghezza d onda (visibile o UV). ARANCIO DI ACRIDINA, ACRIFLAVINA, FLUORESCEINA Tecniche di colorazione Colorazioni semplici: richiedono l uso di un solo colorante Colorazioni complesse: applicazione successiva di più coloranti Colorazioni differenziali: consentono di distinguere tra loro microrganismi diversi

55 FISSAZIONE la fissazione può essere fatta al calore o con sostanze chimiche (etanolo, ac. acetico, formaldeide). Il calore preserva la morfologia cellulare ma può alterare le strutture interne. La fissazione chimica si usa per osservare le strutture intracellulari.

56 Colorazione semplice dopo la fissazione i campioni vengono colorati, lavati ed osservati i coloranti devono avere un gruppo cromoforo e devono legarsi ai campioni coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, cristal violetto) - composti cationici, carichi positivamente che legano strutture e molecole cariche negativamente (parete cellulare, DNA) coloranti acidi (eosina, fucsina acida, rosa bengala) - composti anionici, carichi negativamente che legano strutture e molecole cariche positivamente

57 Colorazioni semplici: impiego di un solo colorante, comunemente il blu di metilene, il cristalvioletto o la fucsina Alcuni coloranti, come il Blu di Loffler (blu di metilene addizionato con idrato di potassio) possono evidenziare certe particolarità strutturali di un batterio attraverso il fenomeno della metacromasia nel caso di Bacillus anthracis (agente eziologico del carbonchio ematico) determina la colorazione del corpo batterico in blu, mentre la capsula assume un colore rossastro

58 Colorazioni differenziali Colorazione di Gram Gram, ideato nel 1884 dal medico danese Hans Christian Gram che operava a Berlino e che cercava di scoprire una tecnica di colorazione capace di distinguere i batteri responsabili delle patologie polmonari dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti. Stesura, essiccamento e fissazione del materiale Violetto di genziana x 2-3 min Liquido di Lugol x2 min Decolorazione con alcool-acetone(4:1) acetone(4:1) x 1 min Lavaggio con acqua Colorazione di contrasto con fucsina diluita o eosina al 5% x1 min Lavaggio ed asciugamento

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61 Colorazione differenziale permette di classificare i batteri in base alla loro reazione alla colorazione Colorazione per acido-resistenza (o di Ziehl-Neelsen) si usa per riconoscere batteri delle specie Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae la colorazione viene fatta a caldo con fucsina basica e fenolo. dopo la colorazione le cellule vengono lavate con acido solforico e etanolo. tutte le cellule batteriche, tranne quelle di Mycobacterium, si decolorano.

62 Colorazione di Ziehl-Neelsen Per identificare i micobatteri, i quali hanno la proprietà di assumere e trattenere la fucsina resistendo anche al trattamento decolorante operato con acidi minerali e con alcool. Meccanismo dell acido-resistenza dovuto all alto contenuto lipidico, ed in particolare a quelle che non vengono estratte dall alcool o dagli acidi L acido-resistenza è una caratteristica del bacillo tubercolare (Tendenza alla aggregazione e al galleggiamento, impermeabilità ai coloranti, resistenza agli acidi)

63 Ziehl-Neelsen Staining Procedure 1 Flame slides to heat fix 2 Flood the entire slide with carbol fuchsin Ensure enough stain is added to keep the slides covered throughout the entire staining step. 3 Using a Bunsen burner, heat the slides slowly until they are steaming. Maintain steaming for 5 minutes by using low or intermittent heat (i.e. by occasionally passing the flame from the Bunsen burner over the slides)

64 3 Rinse the slide with water. Flood the slide with 3% acid-alcohol and allow to decolorize for 5 minutes. Throughout the 5 minutes, continue to flood the slides with 3% acid-alcohol until the slides are clear of stain visible to the naked eye. To the right are examples of slides insufficiently and sufficiently flooded with 3% acid-alcohol. 4 5 Rinse the slide thoroughly with water and then drain any excess from the slides.

65 6 Flood the slide with the counterstain, Methylene Blue. Keep the counterstain on the slides for 1 minute. 7 Rinse the slide thoroughly with water.

66 Colorazione di Ziehl-Neelsen modificata (MZN). Per la identificazione delle brucelle, che sono parzialmente acido-resistenti, viene impiegata una procedura modificata: si utilizza come primo colorante una soluzione di fucsina più diluita e, come decolorante, una soluzione di acido acetico allo 0,5%. Le brucelle trattengono la fucsina e appaiono quindi come coccobacilli rossi. Altri microrganismi patogeni cui si applica questa colorazione differenziale sono Nocardia asteroides e Chlamydia psittaci.

67 Colorazione delle spore Fra le diverse metodiche si può ricordare quella semplice e pratica consigliata da Schaffer e Fulton. La tecnica di esecuzione è la seguente: stesura, essiccamento e fissazione del preparato; colorazione con soluzione acquosa di verde di malachite al 5%, per 30 sec, scaldando fino a sviluppo di vapori; lavaggio con acqua; colorazione di contrasto con soluzione acquosa di safranina allo 0,5%, per 30 sec; lavaggio e asciugamento. Le spore si presentano di colore verde-azzurro, mentre le forme vegetative hanno colorazione da rosa a bruno

68 Colorazione delle capsule Tra i metodi utilizzabili per la colorazione delle capsule: - quello del blu di Loffler, che in B. anthracis per metacromasia colora la capsula in rosso porpora, mentre il germe assume colorazione bluastra; - quello di Gram, limitatamente ai microrganismi capsulati Gram-positivi, che si presentano bluastri con capsula rossa (in questo caso come colorante di contrasto si deve usare l'eosina). La capsula può essere evidenziata anche col metodo semplice dell'inchiostro di china, oppure con il metodo composto, qui oltre descritto: mescolare su un vetrino porta-oggetto una goccia del materiale in esame con una goccia di inchiostro di china, stendere ad asciugare all'aria. Colorare quindi con blu di metilene (1 min) o con violetto di genziana (10 sec), lavare e asciugare. Le capsule si presentano, sul fondo nero, come aloni biancastri attorno ai germi colorati di blu.

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70 Effetto del lisozima Le cellule in crescita devono interrompere il peptidoglicano in certe regioni, inserire nuovo materiale La parte contiene enzimi batterici chiamati autolisine per creare tali fratture controllate (spiegazione della perdita della Gram positività in colture vecchie). Il Lisozima = enzima che attacca il PG, interrompe le catene di glicani (NAG-NAM). NAM). Si ritrova nelle secrezioni animali, come saliva membrane mucose latte. Più attivo nei confronti dei Gram+ che nelle cellule Gram-.

71 Il lisozima, descritto la prima volta nel 1922 da A. Fleming, è un enzima di 14,4 kilodalton presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra l'acido N-acetilmuramico (NAM) e la N- acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale del peptidoglicano. È abbondantemente presente in numerose secrezioni animali e umane come le lacrime (fanno eccezione quelle dei bovini) e nella saliva. Si trova in concentrazioni elevate anche nell'albume d'uovo.

72 LISOZIMA in: leucociti polimorfonucleati neutrofili umani (o semplicemente neutrofili) che possiedono due differenti tipologie di granuli al loro interno visibili al microscopio ottico mediante la colorazione di May-Grunwald-Geimsa : I granuli azzurrofili o primari che contengono: idrolasi, mieloperossidasi e lisozima. I granuli secondari contenenti: lisozima e lattoferrina Granulocytes: Eosinophils

73 Il lisozima ci protegge dal continuo pericolo delle infezioni batteriche. Il lisozima mostrato qui sopra è stato estratto dall'albume di uovo di gallina, dove protegge le proteine e i grassi che sevono a nutrire il pulcino che si sta formando. Questo lisozima è stato il primo enzima di cui è stata risolta la struttura Il lisozima è un enzima piccolo e stabile che costituisce un modello ideale per la ricerca sulla struttura e la funzione delle proteine. Una mutazione ereditaria del gene del lisozima può essere causa di amiloidosi

74 RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI

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76 Meccanismi biochimici di resistenza Inattivazione dell antibiotico Alterazione della struttura bersaglio Espressione di un bersaglio alternativo Modificazione della permeabilità di membrana

77 Fenomeni di resistenza in netta crescita Individuazione di nuovi bersagli Sintesi di nuovi antibatterici

78 Sviluppo di antibiotici Vecchie strategie Sviluppo di antibiotici Nuove strategie

79 CARATTERISTICHE DI UN ANTIBIOTICO IDEALE 1. ALTA TOSSICITA SELETTIVA 2. EFFETTI COLLATERALI E INDESIDERATI TRASCURABILI 3. AMPIO SPETTRO D AZIONE 4. INATTIVO CONTRO I MICROBIOTI 5. ATTIVO SUI BIOFILM MICROBICI 6. INCAPACE DI PROVOCARE L INSORGERE DI RESISTENZA

80 Per l Organizzazione mondiale della sanità (Oms) l'antibiotico-resistenza è una delle tre più serie minacce alla salute pubblica globale. Capace di provocare ogni anno 25 mila morti nella sola Unione europea. Secondo gli ultimi dati del Centro europeo per la prevenzione delle malattie il nostro è tra i Paesi europei con i livelli più alti di resistenza Ne è un esempio la frequenza, in continua crescita, di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) uno dei superbatteri più pericolosi pari al 38 per cento nel 2011, contro una media europea inferiore al 20. Adesso gli scienziati hanno forse trovato un arma in più per arginare questa emergenza sanitaria.

81 Un equipe di ricercatori americani della University of North Carolina a Chapel Hill è riuscita a sintetizzare, come illustrato in uno studio pubblicato sui Proceedings of the national academy of sciences (Pnas), una molecola in grado di bloccare l attività dell enzima indispensabile ai batteri per scambiarsi informazioni, sottoforma di geni, su come bypassare l azione degli antibiotici. Ci siamo concentrati su alcuni ceppi di Staphylococcus aureus afferma Jonathan Edwards, che coordina il gruppo di ricerca perché in questo ceppo è stato isolato il primo elemento genetico in grado di conferire la resistenza. I geni per la resistenza agli antibiotici sono localizzati in piccole sequenze di Dna I geni per la resistenza agli antibiotici sono localizzati in piccole sequenze di Dna circolare, i plasmidi, che ibatteri sono in grado di trasferirsi l un l altro attraverso contatto diretto. Per farlo, però, hanno bisogno di mediatori. Gli studiosi hanno scoperto che un ruolo essenziale è svolto da un enzima, detto Nes, che opera una sorta di taglia e cuci nelle sequenze di Dna, consentendone lo scambio tra cellule batteriche differenti. Attraverso sofisticate tecniche di cristallografia e diffrazione ai raggi X, che consentono di ricostruire la struttura tridimensionale delle proteine, Edwards e colleghi sono riusciti a individuare due regioni chiave dell enzima. E, adoperandole come modello, sono stati in grado di disegnare un polimero sintetico capace di legarsi al Dna, creando un blocco che riduce del 90 per cento il trasferimento genico.

82 L incubo di un ritorno ai tempi antecedenti la scoperta della penicillina da parte dialexander Fleming, è stato alimentato negli anni dall uso indiscriminato di antibiotici, spesso adoperati per infezioni virali contro le quali sono inefficaci. Ma anche le case farmaceutiche non sono esenti da colpe. Il costo per la realizzazione di un nuovo antibiotico è, infatti, piuttosto elevato, all incirca 640 milioni di euro dall ideazione alla commercializzazione, per cui spesso le compagnie di Big Pharma preferiscono investire su altri tipi di farmaci. Difatti, dal 2009 solo due nuove molecole sono state immesse sul mercato. Un dato che ha spinto l Infectious diseases society of america (Idsa), l agenzia americana per le malattie infettive, a lanciare un progetto, la iniziative, per la realizzazione di dieci nuovi antibiotici entro il La nuova ricerca Usa potrebbe in futuro inserirsi in questo percorso. Il nostro risultato è davvero promettente sottolinea Edwards -, perché potrebbe portare nei prossimi anni allo sviluppo di nuovi metodi per bloccare la propagazione della resistenza agli antibiotici, inibendo così il trasferimento dei geni da un batterio all altro.

83 Saranno organismi marini che abitano negli abissi più profondi e inesplorati degli oceani, come spugne e batteri, a fornire le medicine del futuro. A dare la caccia ai nuovi composti nascosti fra fango e sedimenti delle fosse oceaniche sono gli scienziati del progetto PharmaSea, al lavoro in Italia, Gran Bretagna, Belgio, Norvegia, Spagna, Irlanda, Germania, Svizzera e Danimarca. Il progetto durerà quattro anni, ha ricevuto un finanziamento europeo di 9,5 milioni di euro e potrà contare su 24 organizzazioni partner fra università, industria e enti non profit, in 14 Paesi tra cui Cina, Nuova Zelanda, Sudafrica, Cile e Costa Rica. Uno degli scopi di PharmaSea è quello di arrivare a produrre nuovi antibiotici. Al momento c è una reale assenza di sviluppo di buoni antibiotici, non ne è stato registrato uno nuovo dal 2003 spiega Marcel Jaspars, docente dell università di Aberdeen in Gran Bretagna, che guida il team di scienziati. Secondo Jaspars se non viene fatto nulla in anni torneremo indietro all era pre-antibiotici, in cui quelle che oggi sono semplici infezioni potrebbero diventare malattie fatali.

84 L'uso prudente degli antibiotici in veterinaria è al centro delle politiche sanitarie internazionali. preoccupazioni delle autorità sanitarie mediche e veterinarie- internazionali Un parere del 30 agosto scorso della Commissione Agricoltura del Parlamento Europeo suggerisce che "entro il 2018 il ricorso ad antimicrobici per uso veterinario sia dimezzato nell'unione europea rispetto ai dati del attraverso nuove modalità gestionali in grado conciliare l'esigenza di presidi terapeutici con interventi di prevenzione e di biosicurezza in grado di abbattere l'incidenza delle patologie in allevamento.

85 Presso la sede centrale dell'istituto zooprofilattico sperimentale del Lazio e della Toscana è attivato il «Centro di referenza nazionale per l'antibioticoresistenza». (Dal D.M dalla Gazz. Uff. 22 maggio 2002, n. 118). Il Centro di Referenza ha inoltre l'obiettivo di avviare e mantenere un Sistema di Sorveglianza sull'antibioticoresistenza in medicina veterinaria. Lo scopo è quello di individuare l'emergenza e la diffusione di resistenze (e multiresistenze) di particolare rilevanza in determinate categorie di batteri di origine animale (patogeni animali, zoonosici ed indicatori) attraverso report periodici e pubblicazioni. Il Centro si propone di non limitare l'acquisizione di informazioni utili alle azioni di Sanità Pubblica nel solo campo della sorveglianza di laboratorio, ma di estendere le informazioni al campo delle problematiche relative all'uso dei farmaci antimicrobici nella pratica clinica veterinaria e nelle produzioni animali

86 Comp Immunol Microbiol Infect Dis Mar;36(2): Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonella in European wild boar (Sus scrofa); Latium Region - Italy. Zottola T, Montagnaro S, Magnapera C, Sasso S, De Martino L, Bragagnolo A, D'Amici L, Condoleo R, Pisanelli G, Iovane G, Pagnini U. Mol Biosyst Apr;8(4): Comparative proteomics to evaluate multi drug resistance in Escherichia coli. Piras C, Soggiu A, Bonizzi L, Gaviraghi A, Deriu F, De Martino L, Iovane G, Amoresano A, Roncada P. J Med Microbiol Mar;61(Pt 3): Streptococcus constellatus-associated pyoderma in a dog. De Martino L, Nizza S, de Martinis C, Foglia Manzillo V, Iovane V, Paciello O, Pagnini U.