PREMIO TESI S.I.P.I. 2013

Transcript

1 PREMIO TESI S.I.P.I Efficacia di un vaccino polivalente contro Listonella anguillarum e Photobacterium damselae subsp. piscicida in branzino (Dicentrarchus labrax) Effectiveness of a polyvalent vaccine against Listonella anguillarum and Photobacterium damselae subsp. piscicida in sea bass (Dicentrarchus labrax) Francesco Boschetto 1, Chiara Bulfon 2, Donatella Volpatti 2* 1 Corso di Laurea in Biotecnologie Medico-Veterinarie, Università degli Studi di Udine; 2 Sezione di Patologia Veterinaria, Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Udine. RIASSUNTO - Diverse formulazioni vaccinali di tipo bi- o polivalente vengono proposte per controllare le malattie batteriche in acquacoltura. Tali vaccini sono principalmente destinati ai salmonidi e in misura minore ad altre specie ittiche di rilevanza commerciale. L'obiettivo della ricerca descritta in questa tesi è stato quello di valutare in via sperimentale, nel branzino (Dicentrarchus labrax), l'efficacia di un vaccino polivalente contro Listonella anguillarum (sierotipi O1 e O2) e Photobacterium damselae subsp. piscicida (singolo ceppo), proposto da una azienda commerciale e somministrato per bagno (priming e richiami) o per via intraperitoneale (singolo trattamento) secondo diversi protocolli. Inoltre, è stato studiato l effetto di un estratto acquoso di Nicotiana benthamiana, in abbinamento alla vaccinazione per immersione, sull esito di tale trattamento immunizzante. L efficacia dei protocolli di vaccinazione è stata determinata mediante valutazione della risposta immunitaria innata (attività di burst respiratorio dei leucociti) e acquisita (titolo anticorpale specifico) e mediante prove di protezione in vivo (challenge) con entrambi i patogeni. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la somministrazione del vaccino multivalente (secondo diverse modalità) non ha influenzato significativamente il rilascio di radicali liberi dell ossigeno da parte dei leucociti, mentre l impiego dell estratto vegetale sembra aver limitato tale attività microbicida. Dopo il priming per immersione è stata osservata una modesta, ma significativa produzione di IgM contro L. anguillarum, ma non contro P. damselae subsp. piscicida. Il richiamo per immersione non ha indotto un ulteriore incremento del titolo anticorpale verso i due antigeni. Il trattamento intraperitoneale è risultato quello più efficace nel promuovere la sintesi di IgM specifiche, così come nel ridurre la mortalità post infezione. I trattamenti per immersione non hanno garantito livelli di protezione significativi. Un incremento di IgM specifiche è stato registrato nei pesci sopravvissuti ai challenge con entrambi i patogeni (14 gg post-infezione) e, in generale, è stata rilevata una maggiore efficienza in termini di siero conversione (µg/ml IgM specifiche) verso gli antigeni di P. damselae subsp. piscicida rispetto a quelli di L. anguillarum. SUMMARY - Up to now several bi- or polyvalent formulations have been proposed to prevent bacterial diseases in aquaculture. These vaccines are primarily addressed to salmonids and to a lesser extent to other commercially relevant fish species. The objective of the research described in this thesis was to evaluate, in sea bass (Dicentrarchus labrax), the effectiveness of a polyvalent vaccine against Listonella anguillarum (serotypes O1 and O2) and Photobacterium damselae subsp. piscicida (single strain), proposed by a commercial company and administered by immersion (priming and booster) or intraperitoneal injection, according to different immunization protocols. Furthermore, the effect of a Nicotiana benthamiana aqueous extract used in combination with immersion vaccination, on the outcome of immersion treatments, was investigated. The efficacy of vaccination protocols was assessed by the evaluation of the innate (activity of leukocytes respiratory burst) and acquired (specific antibody titer) immune response and by in vivo challenge trials with both pathogens. The results showed that the administration of the polyvalent vaccine (according to different routes) did not significantly affect the release of oxygen reactive species by leukocytes, whereas the use of the plant extract seems to have limited this microbicidal activity. After immersion priming a modest but significant synthesis of IgM against L. anguillarum but not against P. damselae subsp. piscicida was observed. The immersion booster did not induce a further increase in the antibody titer against these antigens. The intraperitoneal treatment was the most effective in promoting the synthesis of specific IgM, as well as in reducing post infection mortality. 5

2 Immersion treatments did not ensure significant levels of protection. An increase in specific IgM was recorded in fish surviving to both challenges (14 days post- infection) and, in general, a more efficient serum conversion (µg/ml specific IgM) against antigens of P. damselae subsp. piscicida compared to those of L. anguillarum was detectable. Key words: Sea bass; Dicentrarchus labrax; Polyvalent vaccine; Listonella anguillarum, Photobacterium damselae subsp. piscicida. * Corresponding Author: c/o DIAL, Università degli Studi di Udine, via Sondrio Udine. Tel Fax ; donatella.volpatti@uniud.it. INTRODUZIONE Diverse formulazioni vaccinali di tipo bi- o polivalente sono state sperimentate nelle specie ittiche allevate per la prevenzione delle malattie batteriche. Tali vaccini sono principalmente destinati ai salmonidi (Nikoskelainen et al., 2007; Bastardo et al., 2012) e in misura minore ad altre specie di rilevanza commerciale, quali branzino (Vigneulle et al., 1996; Gravningen et al., 1998; Paolini et al., 2005), sogliola (Arijo et al., 2005), carpa (Li et al., 2006), tilapia (Osman et al., 2009) e passera giapponese (Sun et al., 2011). L impiego di vaccini combinati può risultare particolarmente vantaggioso in quanto, se efficace in termini di protezione, consente di limitare i costi di vaccinazione e lo stress da manipolazione subito dai pesci, garantendo una copertura simultanea nei confronti di due o più malattie. Tuttavia, per promuovere lo sviluppo e ottimizzare le prestazioni delle formulazioni polivalenti destinate alle specie ittiche, è necessario approfondire le conoscenze riguardanti i meccanismi di risposta immunitaria dei pesci dopo stimolazione con antigeni multipli, l antigenicità e la dominanza relativa degli epitopi costituenti gli antigeni, nonché i possibili meccanismi naturalmente immunosoppressivi o i fenomeni di interferenza/concorrenza antigenica (Busch, 1997). I maggiori produttori di vaccini destinati alle specie ittiche allevate propongono sul mercato vaccini bivalenti per il branzino (Dicentrarchus labrax) mirati a contrastare alcuni dei principali patogeni batterici, quali Listonella anguillarum e Vibrio ordalii; Listonella anguillarum e Photobacterium damselae subsp. piscicida. Tuttavia tali prodotti risultano registrati ed autorizzati solo in alcuni Paesi europei tra i quali Norvegia, Spagna, Grecia, Turchia ed Regno Unito. L'obiettivo della ricerca descritta in questa tesi è stato quello di valutare in via sperimentale, nel branzino, l'efficacia di un vaccino polivalente contro L. anguillarum (sierotipi O1 e O2) e P. damselae subsp. piscicida (singolo ceppo), proposto da una azienda commerciale, allo scopo di studiare un protocollo che consenta di conferire protezione contro entrambi i patogeni e che sia facilmente attuabile nell ambito di un allevamento intensivo. In tale ottica sono stati confrontati diversi protocolli di immunizzazione che hanno previsto la somministrazione del vaccino sia per bagno (priming e richiami), che tramite iniezione intraperitoneale 6

3 (singolo trattamento). Un secondo obiettivo è stato quello di studiare l effetto di un estratto acquoso di Nicotiana benthamiana, in abbinamento alla vaccinazione per immersione, sull esito di tale trattamento immunizzante. L efficacia dei protocolli di vaccinazione è stata saggiata valutando aspetti di risposta immunitaria innata e acquisita, quali il burst respiratorio dei leucociti purificati da rene anteriore/milza e la sintesi di immunoglobuline specifiche per i due batteri, nonché la protezione contro i due patogeni mediante modelli di infezione sperimentale (challenge). MATERIALI E METODI Reagenti Acido citrico, acido solforico (H 2 SO 4 ), adiuvante completo di Freund (FCA), adiuvante incompleto di Freund (FIA), 5-amino-2,3-dihydro-1,4-pathalazinedione (luminolo), benzocaina, bicarbonato di sodio (NaHCO 3 ), carbonato di sodio (Na 2 CO 3 ), cloruro di sodio (NaCl), eparina (5 KU ml-1), gelatina, Histopaque 1077 e 1119, IgG di capra, perossido di idrogeno (H 2 O 2 ), phorbol myristate acetate (PMA), siero di capra, sodio acetato (CH 3 COONa), soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo, Ca 2+ and Mg 2+ (HBSS), poli-l-lisina, 3,3,5,5 - tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB), Tris-aminomethane, trypan blue, Tween 20 sono stati acquistati presso Sigma-Aldrich (MI, Italia). Trypticase Soy Broth (TSB) e Trypticase Soy Agar (TSA) sono stati forniti da biomérieux Italia S.p.a. (FI, Italia). Pesci e condizioni di allevamento Avannotti di branzino di 97 dph (days post hatching, giorni post schiusa), con peso medio 0,5 grammi, sono stati acclimatati per 2 settimane presso lo stabulario sperimentale del DIAL (Università di Udine). Successivamente sono stati selezionati al fine di ottenere 2250 esemplari di peso uniforme, suddivisi in maniera casuale in 15 vasche (150 soggetti/vasca). Le vasche in vetroresina (120 litri) erano inserite in un sistema a ricircolo dell'acqua marina (rinnovo giornaliero dell'acqua, 5%; durata del giorno artificiale, 12 ore; intensità della luce, 200 lux), con regolazione termostatica, filtro meccanico e biologico, sistema di disinfezione U.V. I parametri dell'acqua sono stati misurati periodicamente e mantenuti ottimali per il branzino (temperatura 23 ± 0,5 C, salinità 30,0 ± 2, ossigeno disciolto 6,4 ± 1,5 mg/l, ph 7,6 ± 0,5, azoto ammoniacale totale <0,15 mg/l, nitriti <0,05 mg/l). I pesci sono stati periodicamente pesati e alimentati con mangimi commerciali (Gemma 0.2/0.3, Excell I/II periodo, Skretting) secondo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. Tutte le procedure di stabulazione e successivo trattamento sono state svolte in conformità con le direttive nazionali ed Europee sulla protezione degli animali utilizzati a scopo scientifico (2010/63/EU). Protocollo di vaccinazione La prova ha previsto l'utilizzo di un vaccino polivalente denominato VAP (gentilmente fornito da Schering Plough, USA, costituito da: L. anguillarum serotype O1, L. anguillarum serotype O2, P. damselae subsp. piscicida). Uno dei protocolli di 7

4 vaccinazione per immersione ha previsto anche l'impiego di estratto acquoso di Nicotiana benthamiana (gentilmente fornito dalla Dr.ssa Franconi, ENEA, Roma) combinato al vaccino. In sintesi sono stati applicati 4 diversi approcci sperimentali (Figura 1). Il priming per bagno è stato effettuato a 112 dph, il richiamo a 147 dph. L immunizzazione per bagno (IM) ha previsto un immersione per 60 sec in VAP diluito 1:10 in acqua marina, eventualmente addizionata con 1% di estratto di N. benthamiana (IMA). L'immunizzazione intraperitoneale (IP) è stata condotta con un singolo trattamento a 147 dph somministrando 0,1 ml/sogg di VAP, previa sedazione dei pesci con benzocaina (0,03 g/l). Al termine dei trattamenti di vaccinazione i gruppi erano pertanto 5, ciascuno allestito in triplicato (150 soggetti/vasca), identificati come segue: control, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP. IMA IMA+IMA control IM IM+IM IM 97 dph acclimatazione control IP control 112 dph priming 147 dph richiamo 11 settimane post richiamo challenge con L. anguillarum 20 settimane post richiamo challenge con P. damselae piscicida Figura 1 - Schema riassuntivo che descrive la tempistica e i protocolli di vaccinazione. Figure 1 - Summary scheme illustrating the timing and the protocols of vaccination. Prelievo di sangue e organi linfatici Nel corso della prova sono stati effettuati prelievi di sangue e di organi linfatici (Tabella 1) da un numero statisticamente significativo di soggetti/gruppo, previa anestesia con benzocaina (0,03 g/l). Il prelievo di sangue è stato effettuato mediante taglio della coda e raccolta con capillare non eparinato nel caso dei soggetti prelevati fino ai 21 giorni post-richiamo, in seguito, con l aumento della taglia, si è provveduto al prelievo di sangue mediante l uso di siringa. Dopo coagulazione a 4 C e centrifugazione (2000 x g per 15 min), il 8

5 siero è stato aliquotato e mantenuto a -20 C per le successive analisi. Dopo soppressione mediante overdose di anestetico, i pesci sono stati sottoposti a prelievo degli organi linfatici, mantenuti in HBSS in ghiaccio fino al momento della purificazione dei leucociti. Tempo Prelievo sangue Prelievo rene anteriore e milza 111 dph (pre-priming) Gruppo: CTRL Gruppo: CTRL 7 giorni post-priming - Gruppi: CTRL, IM, IMA 21 giorni post-priming Gruppi: CTRL, IM, IMA - 7 giorni post-richiamo - 21 giorni post-richiamo 14 giorni post-challenge L. anguillarum 14 giorni post-challenge P. damselae subsp. piscicida 19 settimane postrichiamo Gruppi: CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP Gruppi: CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP Gruppi: CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP Gruppi: CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP Gruppi: CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA, IP Tabella 1 - Sintesi della tempistica e dei gruppi sperimentali sottoposti a prelievo. Table 1 - Time schedule and experimental groups submitted to sampling. Purificazione di immunoglobuline (IgM) di branzino Le IgM totali sono state purificate dal siero di branzini di controllo (non utilizzati nella prova di vaccinazione) al fine di allestire una curva standard di riferimento per il saggio E.L.I.S.A., finalizzato a titolare le IgM specifiche. L aumento delle IgM nel siero è stato indotto mediante immunizzazione con IgG di capra. Dieci soggetti adulti, sani e non vaccinati, sono stati stabulati in una vasca in vetroresina alimentata con acqua marina a ricircolo (condizioni ambientali descritte in precedenza) e immunizzati individualmente (priming) mediante iniezione intraperitoneale con 0,2 ml di IgG di capra (500 µg) miscelati con 0,2 ml di FCA. Quindici giorni dopo, è stato eseguito un richiamo con 0,2 ml di IgG di capra (1.000 µg) miscelati con 0,2 ml di FIA. Tale trattamento è stato ripetuto 37 giorni post priming. Quarantasei giorni post priming è stata effettuato un prelievo di siero da tutti i soggetti. Il siero è stato processato mediante colonna cromatografica di affinità con proteina A-sepharose presso l Università di Viterbo (Prof.ssa Romano, Dipartimento di Scienze 9

6 Ecologiche e Biologiche) e le IgM purificate sono state fornite all Università di Udine in aliquote alla concentrazione di 0,47 mg/ml in PBS. Titolazione delle IgM specifiche per Listonella anguillarum e Photobacterium damselae subsp. piscicida nel siero Il titolo anticorpale specifico per i due microorganismi è stato determinato mediante E.L.I.S.A. indiretto (Bakopoulos et al., 1997). Una micropiastra da 96 pozzetti (NUNC) è tata rivestita (coating) con 100 µl/pozzetto di poli-l-lisina 0,001% in tampone carbonato/bicarbonato 0,05 M, ph 9,6 a temperatura ambiente (RT). Dopo lavaggio con LSWB ph 7,3 (Tris aminomethane 20 mm, NaCl 380 mm, 0,05% Tween 20), stati aggiunti 100 µl/pozzetto di batteri [L. anguillarum sierotipi O1 e O2 (ceppi 77/I03 e 32/ITT, IZSVe) o P. damselae subsp. piscicida (ceppo 213/ITT3, IZSVe)] inattivati con formalina, lavati e risospesi in PBS (O.D. = 1 a 610 nm, corrispondenti a 1 x 10 9 UFC/ml per L. anguillarum e 8 x 10 8 UFC/ml per P. damselae subsp. piscicida). Dopo incubazione per 1 ora a RT, la piastra è stata lavata con LSWB, quindi rivestita con gelatina 1% in LSWB (200 µl/pozzetto) per 3 ore a RT e siero di capra 5% in LSWB (200 µl/pozzetto) overnight a 4 C. Dopo lavaggio con HSWB ph 7,7 (Tris aminomethane 20 mm, NaCl 500 mm, 0,1% Tween 20), sono stati aggiunti 100 µl/pozzetto di siero diluito (1:10, 1:20) in PBS con 0,1% Tween 20 (duplicato) ed incubati per 1 ora a RT. Dopo lavaggio con HSWB, sono stati aggiunti 100 µl/pozzetto di anticorpo monoclonale anti IgM di branzino (Aquatic Diagnostic Ltd., UK) diluito 1:33 in PBS con 0,1% Tween 20 per 1 ora a RT. Dopo lavaggio con HSWB, sono stati aggiunti 100 µl/pozzetto di anticorpo policlonale anti IgG di topo ottenuto da capra (DAKO) coniugato con perossidasi (1:500 in PBS). Dopo incubazione per 1 ora a RT, la piastra è stata lavata con HSWB ed è stato aggiunto il substrato TMB 0,42 mm in tampone substrato ph 5,4 (acido citrico 0,34 M e CH 3 COONa 60 mm) addizionato di H 2 O 2 5 mm (100 µl/pozzetto). La reazione colorimetrica è stata bloccata dopo 5 minuti aggiungendo 50 µl/pozzetto di H 2 SO 4 2M e la lettura della densità ottica (OD) è stata effettuata a 450 nm mediante spettrofotometro per micropiastre (Tecan Sunrise). Pozzetti bianchi, ovvero con omissione del siero, pozzetti di controllo positivo (siero di branzino iper-immune per ciascun patogeno) e di controllo negativo (siero di branzini sani, non precedentemente esposti al patogeno) sono stati inoltre contemplati nel saggio. Il titolo anticorpale, proporzionale al valore di OD, è stato espresso in termini quantitativi (µg/ml di IgM specifiche) mediante interpolazione da una curva standard (regressione lineare) ottenuta con diluizioni seriali delle IgM di branzino purificate. In questo caso, diluizioni seriali (94-0,7 µg/ml) di IgM purificate in tampone carbonato/bicarbonato sono state fatte adsorbire alla piastra overnight a 4 C, quindi sono state eseguite le incubazioni con anticorpi e substrato sopra citate. Purificazione dei leucociti La purificazione dei leucociti dagli organi linfatici (rene anteriore e milza) è stata effettuata come riportato da Bulfon et al. (2010) riunendo in pool i tessuti prelevati da soggetti diversi in modo da disporre di un numero sufficiente di leucociti (Tabella 1). Dopo pressatura degli organi in HBSS con pistone di siringa, la sospensione cellulare è stata raccolta in tubo conico, lasciata sedimentare in ghiaccio, quindi 10

7 centrifugata (200 x g per 10 minuti). Le cellule sono state risospese in HBSS e stratificate su gradiente discontinuo di Histopaque a densità 1119 e Dopo centrifugazione (480 x g per 25 minuti), i leucociti presenti nell interfaccia sono stati lavati e risospesi in HBSS. Le cellule vitali sono state contate mediante colorazione con Trypan blue e camera di Thoma, quindi risospese in HBSS a concentrazione 1 x 10 7 cellule/ml. L osmolarità di tutte le soluzioni utilizzate è stata adattata a quella dei fluidi biologici del branzino (360 mosm/kg) mediante aggiunta di NaCl e la temperatura è stata mantenuta costante nel corso della purificazione (+4 C), per evitare alle cellule fenomeni di shock termico. Attività di burst ossidativo dei leucociti La produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) indotta da PMA è stata misurata mediante saggio di chemiluminescenza in micropiastra con luminolo (Coteur et al., 2002, parzialmente modificata). In micropiastre da 96 pozzetti con fondo nero (NUNC) sono stati mescolati 100 µl/pozzetto di PMA (20 µg/ml), 50 µl/pozzetto di luminolo (2 mm) e 50 µl/pozzetto di sospensione leucocitaria. Ogni campione è stato valutato in duplicato in presenza e in assenza di PMA. La luminescenza sviluppata è stata misurata durante un incubazione di 1 ora ogni 10 minuti alla temperatura costante di 25 C, con l ausilio di un lettore per micropiastre (Tecan) (Integration time = 0,5 sec; photomultiplier gain = 180). La produzione di ROS è stata valutata in termini di risposta cumulativa (RLU/10 7 cellule/ml), intesa come somma delle singole letture effettuate nel corso di 1 ora. Infezione sperimentale (challenge) con Listonella anguillarum o Photobacterium damselae subsp. piscicida Entro 16 settimane dal richiamo sono state condotte due infezioni sperimentali (challenge) presso lo stabulario del DIAL (Università di Udine). Branzini prelevati dalle vasche di stabulazione (N = 30/gruppo sperimentale per challenge con L. anguillarum e N = 40/gruppo sperimentale per challenge con P. damselae subsp. piscicida) sono stati trasferiti in vasche cilindrico-coniche in vetroresina (140 litri) alimentate con acqua marina, per un periodo di acclimatazione di 10 giorni. I challenge sono stati effettuati con L. anguillarum sierotipo O1 (ceppo 77/I03, IZSVe) e con P. damselae subsp. piscicida (ceppo 213/ITT3, IZSVe) rispettivamente. I batteri sono stati coltivati in TSB con 2% NaCl fino alla fase logaritmica di crescita, quindi lavati e risospesi in PBS sterile. La dose batterica infettante (7,2 x 10 6 UFC/ml per L. anguillarum e 2,8 x 10 7 UFC/ml per P. damselae subsp. piscicida) è stata scelta in base a prove preliminari finalizzate alla determinazione della dose letale 70 (Council of Europe, 2010). I branzini sono stati anestetizzati con benzocaina (0,03 g/l) e sottoposti ad iniezione intraperitoneale (100 µl/soggetto) con la sospensione batterica. La mortalità è stata registrata per 15 giorni e espressa come mortalità cumulativa percentuale (Nordmo, 1997). La protezione conferita dai protocolli vaccinali è stata espressa come percentuale relativa di sopravvivenza, come proposto da Amend (1981) per la valutazione dell efficacia dei vaccini: 11

8 RPS = [1- (% mortality in vaccinated group / % mortality in control group)] x 100. Analisi statistica I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software SPSS I risultati relativi al saggio E.L.I.S.A. sono stati elaborati usando Student t-test e Mann-Whitney U-test (non parametrico) nel caso in cui la distribuzione dei dati non fosse normale. Valori P 0,05 sono stati considerati significativi per i dati rilevati post-priming e postrichiamo, mentre valori P 0,10 sono stati considerati significativi per i dati rilevati post-challenge (per il numero limitato di campioni/gruppo). I risultati relativi alla risposta di chemiluminescenza sono stati elaborati usando Student t-test, considerando significativi valori P 0,05. I dati di RPS dedotti dai challenge sono stati elaborati utilizzando il test di Fisher con P 0,05. RISULTATI Titolazione delle IgM specifiche per Listonella anguillarum e Photobacterium damselae subsp. piscicida nel siero La titolazione dei sieri dei soggetti di controllo, prima della vaccinazione, ha evidenziato un valore basale di IgM specifiche anti-l. anguillarum (O1 e O2) pari a 3,66 ± 0,37 µg/ml e di IgM anti-p. damselae subsp. piscicida pari a 5,03 ± 0,88 µg/ml. Dopo 21 giorni dal priming è stato rilevato un aumento della concentrazione di IgM anti-l. anguillarum nei soggetti vaccinati rispetto ai soggetti di controllo (CTRL). L analisi statistica ha evidenziato una differenza significativa tra il gruppo IM e il gruppo CTRL (P 0,05). Non sono state rilevate differenze statisticamente significative tra il gruppo IMA e i gruppi IM e CTRL (P>0,05). Dopo 21 giorni dal richiamo e dal trattamento per via intraperitoneale è stata evidenziata una concentrazione di IgM anti-l. anguillarum significativamente più alta nei soggetti del gruppo IP rispetto che nei pesci appartenenti a tutti gli altri gruppi sperimentali CTRL, IM, IM+IM, IMA+IMA (P 0,05). Questi ultimi gruppi, invece, non risultavano differenti tra loro dal punto di vista statistico (P>0,05). La titolazione delle IgM anti-l. anguillarum misurata in soggetti sperimentali mantenuti in stabulazione nell impianto principale per tempo prolungato (e non sottoposti al challenge), ovvero 19 settimane post-richiamo, ha evidenziato una diminuzione dei livelli in tutti i gruppi sperimentali (Figura 2). Un rilevante incremento di IgM specifiche è stato evidenziato in tutti i gruppi sperimentali dopo il challenge con il patogeno, in modo particolare nel gruppo IP. Differenze statisticamente significative sono state rilevate tra il gruppo IP e tutti gli altri gruppi sperimentali (P 0,10). Il titolo anticorpale rilevato nel gruppo IM è risultato significativamente maggiore rispetto a quello misurato nei gruppi IM+IM e IMA+IMA (P 0,10). Tutti i gruppi vaccinati per immersione non hanno presentato differenze significative (P>0,10) rispetto al gruppo CTRL (Figura 3). 12

9 CTRL IM IM+IM IMA/IMA+IMA IP IgM anti-l. anguillarum (ug/ml) priming richiamo 10 0 a b a ab b b b b dopo 21 gg dopo 21 gg dopo 90 gg Figura 2 - IgM specifiche anti-listonella anguillarum (µg/ml) in branzini di controllo e vaccinati 21 giorni dopo il priming, 21 giorni e 90 giorni dopo il richiamo o il trattamento intraperitoneale. Ciascuna barra rappresenta media ± deviazione standard. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali ad ogni campionamento (P 0,05). Figure 2 - IgM anti-listonella anguillarum (µg/ml) in control and vaccinated sea bass 21 days post-priming, 21 days and 90 days post-booster or intraperitoneal immunization. Data are expressed as mean ± standard deviation. Significant differences between treatment groups are indicated by different letters (P 0.05). CTRL IM IM+IM IMA+ IMA IP IgM anti-l. anguillarum (ug/ml) challenge a 10 bc b c c 0 dopo 14 gg Figura 3 - Concentrazione di immunoglobuline (IgM) specifiche anti-listonella anguillarum (µg/ml) in branzini sopravvissuti al challenge (14 giorni post infezione). Ciascuna barra rappresenta media ± deviazione standard. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali ad ogni campionamento (P 0,10). Figure 3 - IgM anti-listonella anguillarum (µg/ml) in control and vaccinated sea bass 14 days post challenge. Data are expressed as mean ± standard deviation. Significant differences between treatment groups are indicated by different letters (P 0.10). 13

10 Per quanto riguarda il titolo anticorpale specifico per P. damselae subsp. piscicida, non è stata evidenziata alcuna differenza significativa tra i gruppi sperimentali, dopo il priming (P>0,05). Dopo il richiamo è stata rilevata una concentrazione di IgM specifiche significativamente maggiore nei branzini del gruppo IP rispetto ai soggetti dei gruppi IM, IM+IM e IMA+IMA (P 0,05). I soggetti del gruppo IM hanno evidenziato un titolo anticorpale specifico significativamente minore rispetto ai pesci dei gruppi IMA+IMA e CTRL (P 0,05). Non sono state rilevate, invece, differenze statistiche tra i gruppi CTRL, IM+IM e IMA+IMA (P>0,05). A distanza di 19 settimane dal richiamo il livello di IgM anti-p. damselae subsp. piscicida nei branzini del gruppo IP è risultato significativamente più elevato rispetto a quello degli altri gruppi sperimentali (P 0,05). Inoltre, i pesci del gruppo IM+IM hanno mostrato un livello di anticorpi antigene specifici nel siero significativamente maggiore rispetto ai soggetti sottoposti solo al priming (IM) (P 0,05). Non sono state, invece, riscontrate differenze statisticamente significative tra i gruppi CTRL, IM+IM e IMA+IMA (P> 0,05) (Figura 4). CTRL IM IM+IM IMA/IMA+IMA IP IgM anti-p. damselae piscicida (ug/ml) priming richiamo a b bc bc c b bc c b a 0 dopo 21 gg dopo 21 gg dopo 90 gg Figura 4 - IgM specifiche anti-photobacterium damselae subsp. piscicida (µg/ml) in branzini di controllo e vaccinati 21 giorni dopo il priming, 21 giorni e 90 giorni dopo il richiamo o il trattamento intraperitoneale. Ciascuna barra rappresenta media ± deviazione standard. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali ad ogni campionamento (P 0,05). Figure 4 - IgM anti-photobacterium damselae subsp. piscicida (µg/ml) in control and vaccinated sea bass 21 days post-priming, 21 days and 90 days post-booster or intraperitoneal immunization. Data are expressed as mean ± standard deviation. Significant differences between treatment groups are indicated by different letters (P 0.05). Un aumento del titolo di IgM anti-p. damselae subsp. piscicida è stato rilevato dopo il challenge con il patogeno. I pesci vaccinati IP hanno mostrato un titolo 14

11 anticorpale significativamente maggiore rispetto ai gruppi CTRL e IM (P 0,10). Il gruppo IM ha evidenziato un livello di IgM specifiche significativamente più alto rispetto al gruppo CTRL (P 0,10), ma non significativamente diverso rispetto a gruppi IM+IM e IMA+IMA (P>0,10). Non sono state rilevate differenze statistiche tra i branzini sottoposti ai trattamenti IM+IM, IMA+IMA e IP, né tra branzini dei gruppi IMA+IMA e CTRL (P>0,10) (Figura 5). CTRL IM IM+IM IMA+IMA IP IgM anti-p. damselae piscicida (ug/ml) challenge c b ab abc a 10 0 dopo 14 gg Figura 5 - Concentrazione di immunoglobuline (IgM) specifiche anti-photobacterium damselae subsp. piscicida (µg/ml) in branzini sopravvissuti al challenge (14 giorni post infezione). Ciascuna barra rappresenta media ± deviazione standard. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali ad ogni campionamento (P 0,10). Figure 5 - IgM anti-photobacterium damselae subsp. piscicida (µg/ml) in control and vaccinated sea bass 14 days post challenge. Data are expressed as mean ± standa rd deviation. Significant differences between treatment groups are indicated by different letters (P 0.10). Attività di "burst ossidativo" Non sono state evidenziate differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali, sia 7 giorni post-priming che 7 giorni post richiamo (P>0,05). Tuttavia, la risposta di chemiluminescenza misurata nei leucociti dei branzini del gruppo IM è risultata più alta rispetto a quella misurata nei controlli a 7 giorni dal priming e al momento del richiamo. Analogamente, dopo il richiamo nel gruppo IM+IM l attività di burst ossidativo dei leucociti è risultata maggiore rispetto a quella dei controlli (Figura 6). Inoltre, nei branzini sottoposti a priming per immersione con aggiunta di estratto di N. benthamiana (IMA) l attività di burst ossidativo dei leucociti è risultata minore rispetto a quella osservata nei soggetti di controllo (CTRL) e nel gruppo di branzini immunizzati senza estratto (IM). Una risposta simile è stata 15

12 osservata dopo il richiamo nei soggetti del gruppo IMA+IMA rispetto ai pesci dei gruppi CTRL, IM e IM+IM (Figura 6). CTRL IM IM+IM IMA/IMA+IMA IP RLU priming richiamo dopo 7 gg dopo 7 gg Figura 6 - Attività di burst ossidativo dei leucociti (RLU/10 7 cellule/ ml) purificati da rene anteriore e milza di branzini di controllo e vaccinati, 7 giorni dopo il priming e 7 giorni dopo il richiamo o il trattamento intraperitoneale. Ciascuna barra rappresenta media ± deviazione standard. Lettere diverse indicano differenze statisticamente significative tra i gruppi sperimentali (P 0,05). Figure 6 - Respiratory burst activity of leukocytes (RLU/10 7 cells/ml) purified from head kidney and spleen of control and vaccinated sea bass, 7 days after priming and 7 days after booster or intraperitoneal immunization. Data are expressed as mean ± standard deviation. Significant differences between treatment groups are indicated by different letters (P 0.05). Infezione sperimentale (challenge) con Listonella anguillarum o Photobacterium damselae subsp. piscicida Nel challenge con L. anguillarum la mortalità è stata registrata a partire dal primo giorno post-infezione nel gruppo IM+IM, a partire dal secondo giorno post-infezione nei gruppi IM, IMA+IMA e CTRL. La mortalità si è protratta fino all ottavo giorno post-challenge nel gruppo CTRL, fino al sesto giorno post-challenge nel gruppo IM, fino al quarto giorno post-challenge nei gruppi IM+IM e IMA+IMA. I tassi di mortalità cumulativa sono risultati pari a 46,67% nei soggetti di controllo, 45,16% nel gruppo IM (RPS = 4%), 32,26% nel gruppo IM+IM (RPS = 31%), 39,29% nel gruppo IMA+IMA (RPS = 16%). Non sono state registrate mortalità nel gruppo IP durante l intero periodo di monitoraggio (RPS = 100%). L analisi statistica ha evidenziato differenze significative (P 0,0001) tra il gruppo di soggetti vaccinati per via intraperitoneale (IP) ed i restanti gruppi, i quali non presentavano, invece, differenze significative tra loro (P> 0,05) (Figura 7). 16

13 CTRL IM IM+IM IMA+IMA IP mortalità cumulativa % giorni post infezione Figura 7 - Mortalità cumulativa (%) registrata nei branzini di controllo e vaccinati durante i 15 giorni successivi all infezione con Listonella anguillarum sierotipo O1 (dose infettante 7,2 x 10 6 UFC/ml). Figure 7 - Cumulative mortality (%) in control and vaccinated sea bass after challenge with Listonella anguillarum serotype O1 (dose 7.2 x 10 6 CFU/ml). Nel challenge con P. damselae subsp. piscicida la mortalità è stata registrata a partire dal secondo giorno post-infezione nei branzini dei gruppi IM, IM+IM, IMA+IMA e IP, a partire dal terzo giorno post-infezione nei soggetti di controllo (CTRL). La mortalità è stata registrata fino all undicesimo giorno nel gruppo IP, fino al decimo giorno nei gruppi IM e IMA+IMA, fino al sesto giorno nei gruppi CTRL e IM+IM. I tassi di mortalità cumulativa sono risultati pari a 43,59% nei soggetti di controllo (CTRL), 55,00% nel gruppo IM (RPS = non calcolabile), 30,77% nel gruppo IM+IM (RPS = 30%), 38,46% nel gruppo IMA+IMA (RPS = 12%) e 30,77% nel gruppo IP (RPS = 30%). L analisi statistica effettuata su tali osservazioni ha mostrato una differenza significativa (P 0,05) solamente tra il gruppo IM ed il gruppo IP (Figura 8). 17

14 CTRL IM IM+IM IMA+IMA IP mortalità cumulativa % giorni post infezione Figura 8 - Mortalità cumulativa (%) registrata nei branzini di controllo e vaccinati durante i 15 giorni successivi all infezione con Photobacterium damselae subsp. piscicida (dose infettante 2,8 x 10 7 UFC/ml). Figure 8 - Cumulative mortality (%) in control and vaccinated sea bass after challenge with Photobacterium damselae subsp. piscicida (dose 2.8 x 10 7 CFU/ml). DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Nell ambito di questa tesi si è ritenuto utile dedicare un approccio sperimentale alla valutazione dell efficacia di una formulazione vaccinale polivalente sviluppata da una azienda farmaceutica contro L. anguillarum e P. damselae subsp. piscicida, in branzino. In commercio sono già disponibili vaccini (monovalenti) contro le malattie provocate dai due agenti microbici sopra riportati, anche se non ancora registrati ed utilizzati in tutti i paesi Europei (Sommerset et al., 2005), compresa l Italia (Bovo, contributo personale). Nel caso di L. anguillarum, le formulazioni risultano somministrabili principalmente per bagno o tramite iniezione intraperitoneale e constano di ceppi batterici inattivati (bacterin) del sierotipo O1 oppure di una miscela dei sierotipi O1 e O2 (Toranzo et al., 2005). I protocolli di vaccinazione comunemente attuati in allevamento prevedono un'immunizzazione per immersione degli avannotti a dph, raramente seguita da richiamo. Tuttavia, dati sperimentali indicano che un richiamo per immersione garantisce una protezione immunitaria più duratura, associata alla sintesi di anticorpi specifici e all attivazione di una risposta difensiva cellulare (Scapigliati et al., 2002; Angelidis, 2006; 18

15 Angelidis et al., 2006; Galeotti et al., 2013). La vaccinazione contro P. damselae subsp. piscicida comunemente prevede un priming per immersione in avannotti di circa 0,5-2 g seguito da richiamo per immersione. Attualmente in commercio sono disponibili vaccini contenenti batteri inattivati o frazioni batteriche, in alcuni casi addizionate con adiuvanti (oli), ma la loro efficacia (in termini di entità e durata della protezione) risulta ancora limitata (Ghittino et al., 2003; Toranzo et al., 2005). I dati in letteratura indicano che la vaccinazione tramite immersione induce una stimolazione locale del sistema immunitario associato alle mucose (branchie e intestino) e bassi livelli di anticorpi circolanti (Abelli et al., 1997; dos Santos et al., 2001; Bakopoulos et al., 2003a; 2003b). In questa tesi sono stati confrontati diversi protocolli di immunizzazione che hanno previsto la somministrazione del vaccino polivalente per immersione (priming e richiamo) e per iniezione intraperitoneale. La tempistica e le procedure di somministrazione del priming e dei richiami sono state scelte in coerenza con quelle che vengono applicate comunemente nell allevamento del branzino, relativamente alla somministrazione delle formulazioni commerciali monovalenti dirette contro le singole malattie. Inoltre, è stato studiato l effetto di un estratto acquoso di Nicotiana benthamiana, in abbinamento alla vaccinazione per immersione, sull esito di tale trattamento immunizzante. L efficacia del vaccino è stata quindi saggiata mediante valutazioni di risposta immunitaria e prove di protezione in vivo. L attività di burst ossidativo dei leucociti purificati da rene anteriore/milza 7 giorni dopo i trattamenti di priming o richiamo, stimolati in vitro con PMA, non ha subito variazioni significative rispetto a quella relativa ai controlli, suggerendo che tale attitudine aspecifica non viene influenzata dalla procedura di vaccinazione o dalla formulazione usata, perlomeno a 7 giorni di distanza dal trattamento. In una precedente prova sperimentale condotta in branzino, la somministrazione per immersione, seguita da richiamo, di un vaccino bivalente composto dai medesimi ceppi di L. anguillarum O1 e O2 aveva indotto una stimolazione significativa dell attività di burst ossidativo (Galeotti et al., 2013). Pertanto non si può escludere che il risultato ottenuto in questa tesi (in termini di differenze non significative tra i pesci di controllo e quelli vaccinati) dipenda dalla notevole variabilità intra-gruppo o individuale. L aggiunta di estratto di N. benthamiana in abbinamento alla vaccinazione per immersione (gruppi IMA e IMA+IMA) sembra aver limitato il rilascio di ROS da parte dei leucociti, rispetto a quanto rilevato nei controlli e nei soggetti trattati solo con vaccino (IM e IM+IM). Il laboratorio dell ENEA che ha fornito l estratto vegetale si dedica allo sviluppo di vaccini ricombinanti mediante piante di tabacco che esprimono proteine antigeniche (Franconi et al., 2010). L estratto proposto e somministrato ai branzini era di tipo acquoso, ottenuto da piante di tabacco non geneticamente modificate ed il suo utilizzo aveva come scopo di saggiarne, in un modello animale, l eventuale tossicità o effetto biologico (Di Bonito et al., 2009). I nostri risultati, molto preliminari, sembrano indicare un effetto negativo dell estratto somministrato in vivo in branzino sull attività in vitro dei leucociti, perlomeno in termini di rilascio di ROS. In letteratura non sono disponibili informazioni tossicologiche relativamente a questo estratto. Non è possibile sapere se i leucociti purificati da soggetti esposti all estratto vegetale abbiano recuperato la loro capacità microbicida nel periodo di tempo intercorso tra il 19

16 priming e il richiamo, né quale sia l effetto del secondo trattamento vaccinale rispetto al primo. La somministrazione del vaccino bivalente per via intraperitoneale (IP) non ha influito sulla capacità dei leucociti di produrre ROS. La valutazione delle IgM specifiche nel siero ha evidenziato una modesta, ma significativa risposta post-priming per immersione (IM) contro L. anguillarum, ma non contro P. damselae subsp. piscicida. L aggiunta di estratto vegetale al trattamento per immersione (IMA) non ha influenzato la risposta anticorpale nel caso di entrambi gli antigeni. Il richiamo tramite immersione sia in assenza che in presenza di estratto vegetale (IM+IM e IMA+IMA) non ha indotto un ulteriore incremento del titolo anticorpale verso i due antigeni. Il trattamento intraperitoneale (IP) somministrato in un unica soluzione è risultato quello di maggiore efficacia, determinando un significativo aumento delle IgM specifiche per entrambi i patogeni, rispetto al valore rilevato nei controlli e nei pesci sottoposti agli altri protocolli vaccinali. Il challenge con L. anguillarum O1 ha evidenziato che la vaccinazione più protettiva è quella IP (RPS = 100%), seguita dai protocolli IM+IM (RPS = 31%) e IMA+IMA (RPS = 16%), che hanno indotto una evidente diminuzione della mortalità rispetto a quella dei controlli non vaccinati, comunque non significativa. Il solo priming (IM) è risultato scarsamente protettivo (RPS = 4%). Galeotti et al. (2013) hanno evidenziato, per un vaccino bivalente anti vibriosi, una RPS superiore al 70% in branzini sottoposti a priming e richiamo per immersione. La minore protezione osservata nel corso della presente sperimentazione può essere imputata alla minore efficienza del vaccino contro due specie batteriche rispetto a quello specifico per la vibriosi (interferenza antigenica o inadeguata quantità degli antigeni costituenti). L utilità del richiamo per immersione nel caso dei vaccini per la vibriosi è sostenuta anche da altri autori (Angelidis, 2006; Angelidis et al., 2006). I trattamenti IP e IM+IM sono risultati i più efficaci nel proteggere i branzini anche nei confronti del challenge con P. damselae subsp. piscicida, pur non garantendo livelli di protezione significativi rispetto al controllo (RPS = 30%). Analogamente a quanto riscontrato dopo challenge con L. anguillarum la mortalità riscontrata nel gruppo trattato una volta per immersione è stata maggiore di quella rilevata nei pesci sottoposti anche a richiamo per immersione. I dati complessivi di mortalità (riferiti ad entrambi challenge) indicano che i gruppi trattati con l estratto vegetale sono più sensibili alle infezioni. La minore protezione rilevata in seguito all infezione con P. damselae subsp. piscicida rispetto a quella registrata dopo infezione con L. anguillarum, evidente soprattutto nei soggetti vaccinati per via intraperitoneale (IP), è probabilmente dovuta al differente tempo intercorso tra il termine della vaccinazione e il challenge (20 settimane versus 11 settimane). Ciò sembra plausibile visto che il titolo anticorpale specifico per entrambi i patogeni, determinato nei pesci vaccinati IP a distanza di 19 settimane dal termine della vaccinazione, era fortemente diminuito rispetto a quello rilevato 21 giorni dopo la stessa. I risultati ottenuti nella presente tesi sono in disaccordo con quelli descritti da Gravningen et al. (1997), relativi all impiego di un vaccino bivalente contro L. anguillarum e P. damselae subsp. piscicida in D. labrax. In questo caso il trattamento per immersione (IM+IM) ha conferito maggior protezione rispetto al 20

17 trattamento per via intraperitoneale (IM+IP). Analogamente a quanto da noi osservato, Paolini et al. (2005) riportano che l utilizzo nel branzino di un vaccino bivalente per le stesse malattie, mediante una singola somministrazione per bagno, non risulta protettivo nei confronti di un challenge con P. damselae subsp. piscicida. Un incremento delle IgM specifiche è stato misurato nei soggetti sopravvissuti alle infezioni sperimentali (in tutti i gruppi compreso il controllo, 14 giorni post challenge). In generale, sia dopo la vaccinazione che dopo il challenge, è stata rilevata una maggiore efficienza in termini di siero conversione verso P. damselae subsp. piscicida rispetto a L. anguillarum; ciò suggerisce di approfondire in futuro gli aspetti relativi alla diversa immunogenicità degli antigeni derivati dai due batteri e contenuti nella formulazione vaccinale usata. Inoltre, risulta opportuno indagare composizione, tipo di antigeni utilizzati e loro proporzione relativa, da cui potrebbero dipendere la scarsa copertura e la limitata efficacia del vaccino osservate. Infatti Nikoskelainen et al. (2007) affermano che il successo di un vaccino polivalente è spesso regolato dalla concentrazione dei singoli antigeni, dalla cross-reattività e della possibile concorrenza antigenica fra gli stessi. BIBLIOGRAFIA Abelli L., Pichietti S., Romano N., Mastrolia L. & Scapigliati G. (1997). Immunohistochemical detection of thymocyte antigenic determinants in developing lymphoid organs of sea bass Dicentrarchus labrax (L.). Fish Shellfish Immunol., 6: Amend D.F. (1981). Potency testing of fish vaccines. International Symposium on Fish Biologics: Serodiagnosis and Vaccines. Dev. Biol. Stand., 49: Angelidis P. (2006). Immersion booster vaccination effect on sea bass (Dicentrarchus labrax L.) juveniles. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 90: Angelidis P., Karagiannis D. & Crump E.M. (2006). Efficacy of a Listonella anguillarum (V. anguillarum) vaccine for juvenile sea bass Dicentrarchus labrax. Dis. Aquat. Org., 71: Arijo S., Rico R., Chabrillon M., Diaz-Rosales P., Martinez-Manzanares E., Balebona M.C., Magariños B., Toranzo A.E. & Marinigo M.A. (2005). Effectiveness of a divalent vaccine for sole, Solea senegalensis (Kaup), against Vibrio harveyi and Photobacterium damselae subsp. piscicida. J. Fish Dis., 28: Bakopoulos V., Pearson M., Volpatti D., Gusmani L., Adams A., Galeotti M. & Dimitriadis G.J. (2003a). Investigation of media formulations promoting Photobacterium damselae subsp. piscicida natural and novel antigen expression and recognition by sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) immune sera. J. Fish Dis., 26: Bakopoulos V., Volpatti D., Adams A., Galeotti M. & Richards R. (1997). Qualitative differences in the immune response of rabbit, mouse and sea bass, Dicentrarchus labrax L., to Photobacterium damselae subsp. piscicida, the causative agent of fish pasteurellosis. Fish Shellfish Immunol., 7: Bakopoulos V., Volpatti D., Gusmani L., Galeotti M., Adams A. &, Dimitriadis G.J. (2003b). Vaccination trials of sea bass, Dicentrarchus labrax (L.), against Photobacterium damselae subsp. piscicida, using novel vaccine mixture. J. Fish Dis., 26:

18 Bastardo A., Ravelo C., Castro N., Calheiros J. & Romalde J.L. (2012). Effectiveness of bivalent vaccines against Aeromonas hydrophila and Lactococcus garvieae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Fish Shellfish Immunol., 32: Bulfon C., Volpatti D., Contessi B., Bongiorno T. & Galeotti M. (2010). Preliminary evaluation of immune response in sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax) vaccinated against vibriosis. Ittiopatologia, 6: Busch R.A. (1997). Polyvalent vaccines in fish: the interactive effects of multiple antigens. In: Fish Vaccinology: development of biologicals standardization. Editors: Gudding R., Lillehaug R., Midtlyng A., Brown F., 90: Coteur G., Warnau M., Jangoux M. & Dubois P. (2002). Reactive oxygen species (ROS) production by amoebocytes of Asterias rubens (Echinoderma). Fish Shellfish Immunol., 12: Council of Europe (2010). Vaccines for veterinary use. Vibriosis vaccine (inactivated) for salmonids, Monograph In: European Pharmacopoeia, 7th ed., Strasbourg, France. Di Bonito P., Grasso F., Mangino G., Massa S., Illiano E., Franconi R., Fanales-Belasio E., Falchi M., Affabris E. & Giorgi C. (2009). Immunomodulatory activity of a plant extract containing human papillomavirus 16-E7 protein in human monocyte-derived dendritic cells. Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 22: dos Santos N.M.S., Taverne-Thiele J.J., Barnes A.C., Van Muiswinkel W.B., Ellis A.E. & Rombout H.W.M. (2001). The gill is a major for antibody secreting cell production following direct immersion of sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) in a Photobacterium damselae subsp. piscicida bacterin: an ontogenetic study. Fish Shellfish Immunol., 11: European Pharmacopoeia (2001). Vibriosis vaccine (inactivated) for salmonids. Supplement 2001: Franconi R., Demurtas O.C. & Massa S. (2010). Plant-derived vaccines and other therapeutics produced in contained systems. Expet. Rev. Vaccine, 9: Galeotti M., Romano N., Volpatti D., Bulfon C., Brunetti A., Tiscar P.G., Mosca F., Bertoni F., Marchetti M.G. & Abelli L. (2013). Innovative vaccination protocol against vibriosis in Dicentrarchus labrax (L.) juveniles: improvement of immune parameters and protection to challenge. Vaccine, 31: Ghittino C., Latini M., Agnetti F., Panzieri C., Lauro L., Ciappelloni R. & Petracca G. (2003). Emerging pathologies in aquaculture: effects on production and food safety. Vet. Res. Commun., 27: Gravningen K., Thorarinsson R., Johansen L.H., Nissen B., Rikardsen K.S., Greger E. & Vigneulle M. (1998). Bivalent vaccines for sea bass (Dicentrarchus labrax) against vibriosis and pasteurellosis. J. Appl. Ichthyol., 14: Guidelines of the European Union Council (2010/63/EU). Official Journal of the European Union. Li A., Yang W., Hu J., Wang W., Cai T. & Wang J. (2006). Optimization by orthogonal array design and humoral immunity of the bivalent vaccine against Aeromonas hydrophila and Vibrio fluvialis infection in crucian carp (Carassius auratus L.). Aquac. Res., 37:

19 Nikoskelainen S., Verho S., Jarvinen S., Madetoja J., Wiklund T. & Lilius E.M. (2007). Multiple whole bacterial antigens in polyvalent vaccine may result in inhibition of specific responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol., 22: Nordmo R. (1997). Strengths and weakness of different challenge methods. In: Fish Vaccinology. Gudding, Lillehaug, Midtlyng, Brown eds. Developments in Biologicals Standardize. Basel, Karger, 90: Osman K.M., Mohamed L.A., Rahman E.H.A. & Soliman W.S. (2009). Trials for vaccination of tilapia fish against Aeromonas and Pseudomonas infections using monovalent, bivalent and polyvalent vaccines. World J. Fish Mar. Sci., 1: Paolini A., Ridolfi V., Zezza D., Cocchietto M., Musa M., Pavone A., Conte A. & Giorgetti G. (2005). Prove di vaccinazione della spigola (Dicentrarchus labrax) contro la Pasteurellosi mediante somministrazione orale, intraperitoneale e per immersione. Vet. Italiana, 41: Scapigliati G., Romano N., Buonocore F., Picchietti S., Baldassini M.R., Prugnoli D., Galice A., Meloni S., Secombes C.J., Mazzini M. & Abelli L. (2002). The immune system of sea bass, Dicentrarchus labrax, reared in aquaculture. Dev. Comp. Immunol., 26: Sommerset I., Krossoy B., Biering E. & Frost P. (2005). Vaccines for fish in aquaculture. Expet. Rev. Vaccine, 4: Sun Y., Liu C. & Sun L. (2011). A multivalent killed whole-cell vaccine induces effective protection against Edwardsiella tarda and Vibrio anguillarum. Fish Shellfish Immunol., 31: Toranzo A.E., Magariños B. & Romalde J.L. (2005). A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture, 246: Vigneulle M., Gravningen K. & Abiven A. (1996): Vaccination of sea bass (Dicentrarchus labrax) against pasteurellosis and vibriosis: comparison of different vaccines. Program and book of abstracts, International Symposium on Fish Vaccinology. 5-7 June Oslo, Norway. Tesi 2 a classificata al Premio S.I.P.I