Il sistema immunitario di Dicentrarchus labrax.. e non solo

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1 Il sistema immunitario di Dicentrarchus labrax. e non solo

2 Lymphoid Organs of Teleosts trunk kidney Teleosts have innate and acquired defences

3 DIFESE INNATE: - Peptidi antibatterici - Complemento - Lisozima, Transferrina - Produzione di ROS - Fagocitosi - IFNα Rapide (1 s-1 min), aspecifiche, senza memoria Attivate da stimolanti (es. glucani) Inibite da stress

4 - Anticorpi DIFESE ACQUISITE: - Opsonine/Complemento - Linfociti killer e helper antigene- specifici - Produzione di citochine e fattori solubili Ritardate (da ore a giorni), specifiche, con memori Attivate da stimolanti (adiuvanti, probiotici) Inibite da stress

5 Cosa sappiamo delle difese immunitarie dei teleostei in acquacoltura? 1- Il sistema immunitario risponde, in quanto stimolando con un antigene tigene o vaccin genetica si possono misurare, dopo un certo tempo, anticorpi circolanti colanti specifici (casi a parte: Cod, Haddok, Icefish). 2- Il sistema immunitario può essere modulato positivamente da immunostimolan immunoadiuvanti, probiotici; ; negativamente da condizioni di stress ambientale. 3- Si può effettuare vaccinazione propedeutica massiva e preventiva in età giovan 4- La vaccinazione terapeutica ha poco effetto nel rallentare gli outbreaks 5- Alcuni patogeni sono ormai ubiquitari e, quindi, opportunisti. 6- Nonostante le somiglianze, e difficile applicare le conoscenze immunologiche mammiferi ai Teleostei,, e fra questi puo essere difficile da specie a specie. Futuro: vaccini polivalenti, modulazione positiva, parchi riproduttori geneticamen selezionati.

6 Metodi con i quali si studia il sistema immunitario Cellulari Molecolari Proliferazioni in vitro in risposta a stimoli allo e xeno Misurazione di anticorpi prodotti in vivo e in vitro Attività antibatterica e antivirale Citotossicità e killing killing Determinazioni delle concentrazioni leucocitarie

7 Metodi con i quali si studia il sistema immunitario Cellulari Molecolari Clonaggio di geni di interesse Presenza di espressione genica (RT-PCR e qrt- PCR) Determinazione dell antigene(i) riconosciuto(i) Espressione dei geni di interesse Trasfezione di geni di interesse Espressione di proteine ricombinanti Analisi extra- ed intracellulari delle interazioni ligando-

8 Lab of Animal Biotechnology: Cellular and molecular markers available for sea bass Mab anti- thymocytes and peripheral T cells Mab anti- immunoglobulins and B- cells Mab anti- complement (C3) Molecular probes for: IL-1β,, IL-1, CD8a, T-cell receptor (Vb,, Va), Immunoglobulin (IgLC), MHCI, MHCII, IFN, Ciclooxygenase-2, Mx Continuous embryonic cell line (DLEC) Riboprobes for in situ hybridisation Protocols for: Sea bass is,, at present,, the only marine teleo Leucocyte purification, leucocyte staining, cell proliferation, second messengers detection, transfection, markers are immunoenzymatic analysis, fish vaccination.. species for which all these markers In progress: EST libraries from fish challenged with various pathogens, Microarray chip(s) are avail

9 IMMUNITA UMORALE Produzione di anticorpi specifici in vivo Produzione di anticorpi specifici in vitro

10 Test the efficiency of a stimulant (e.g. a vaccine) through B-cell activities BcR Ag B-cell activities B-cell The binding of an antigen is enough to activate B lymphocytes for somatic ricombination of BcR and for antibody secretion Rationale: B-cells from immunised fish should produce antigen-specific antibodies and maintain a memory for the antigen. Methods: ELISA and In vitro production of specific antibody by HK leucocytes.

11 IMMUNITA UMORALE in vivo Antigene sintetico: aptene (DNP) e molecola carrier (KLH) 3,25 Abs. 492 nm 2,5 2 1,5 1,5 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 Log reciprocal serum dilution Abs. 492 nm,2,15,1,5 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 Log reciprocal serum dilution DNP-KLH KLH ELISA di Anticorpi specifici anti-dnp DNP-KLH e KLH nel siero di pesci immunizzati per via intraperitoneale (3 giorni).

12 Risposta antibatterica in vivo,45,4,35 Pre-immune Immune,3 A492 nm,25,2,15,1,5 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5 5,3 Log reciprocal serum dilution ELISA di Anticorpi specifici anti-vibrio nel siero di pesci dopo 2 giorni di immunizzazione i.p., senza richiamo

13 Risposta antibatterica in vivo 1,4 1,2 1,8 Immune Pre-immune Pesci di 2 g Abs 492 nm,6,4,2 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5 5,3 log reciprocal serum dilution ELISA di Anticorpi specifici anti-vibrio nel siero di pesci immunizzati un anno prima con vaccino commerciale per Il immersione siero di questo gruppo di animali è capace di agglutinare in vitro Vibrio anguillarum vitale

14 RISPOSTA ANTIBATTERICA in vivo La vaccinazione per immersione contro Photobacterium damselae richiede un richiamo dopo 2 giorni Abs. 492 nm,6,5,4,3,2 P. damselae, 64 days (3 days after boosting) preimmune immune Pesci di 1 g,1 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 Log reciprocal serum dilution ELISA di Anticorpi specifici anti-p. damselae nel siero di pesci immunizzati.

15 RISPOSTA ANTIBATTERICA in vivo, effetto di immunoadiuvante: E.coli LTK63 ricombinante,25 a,2 b (28*),5,4 c,8,7,6 7 (49*),15,3,5,4,1,2,3,5,1,2,1 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 ELISA assay. control Phda Phda + LTK63 Pesci di 1,5 g ELISA assay on pooled sera of young sea bass (1.5 G) vaccinated against Photobacterium damselae ba tested at day 21 (a), 49 (b), and 7 (c) after vaccination. Control rol fish= black bars, vaccinated fish = empty LTK63-treated fish = grey bars. X-axis X is the log of reciprocal serum dilution.

16 RISPOSTA in vivo, effetto di immunoadiuvante: : (IL-1β ricombinante) Abs 492 nm,6,5,4,3,2,1 PBS PBS+Vibrio PBS+Vibrio+IL-1beta 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 Log rec. serum dilution Immunizzazione intraperitoneale ELISA dopo 3 giorni Pesci di 15 g Abs 492 nm 1,8,6,4 PBS PBS+Vibrio PBS+Vibrio+IL-1-beta ELISA dopo 6 giorni,2 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 Log rec. serum dilution

17 RISPOSTA in vivo, effetto di probiotici 2 COX-2, espressione relativa 1,8 1,6 1,4 1,2 1,8,6,4,2 Espressione COX-2/actina RT-PCR su RNA estratto da cellule di intestino Pesci di 5 g control pro-car1 pro-car2 Cellule a 51 dph (cellule/mm 2 ) Controllo Pro-carrier 1 % EGC 19 ± 6 19 ± 3 Linfociti T 1158 ± ± Cellule a 74 dph (cellule/mm 2 ) Controllo Pro-carrier 1 % Pro-carrier 2 * p<.5 % EGC 18 ± ± 31 * ± Linfociti T 1374 ± ± 576 * ± Analisi immunoistochimica quantitativa

18 RISPOSTA in vivo, effetto di CpG-nucleotidi

19 RISPOSTA in vivo, effetto di immunostimolanti 15 giorni di trattamento Pesci di 5 g complemento HSP 7 lisozima HSP 7

20 RISPOSTA in vivo, effetto di immunostimolanti 45 giorni di trattamento complemento Pesci di 5 g lisozima Proteina totale sierica

21 RISPOSTA in vivo, effetto di immunostimolanti Conta dei linfociti B e linfociti T tramite analisi citofluorimetrica Pesci di 5 g PBL T-cells PBL B-cells Intestino T-cells Intestino B-cells

22 Effetto in vivo : concentrazione di ossigeno disciolto normossia iperossia normossia iperossia Quantità di immunoglobuline totali sieriche in spigola (1) e sarago pizzuto (2) determinate tramite ELISA

23 Effetto in vivo : concentrazione di ossigeno disciolto sulla conta linfocitaria Linfociti T (%) Linfociti B (%) normossia iperossia normossia iperossia timo aaa 78*** 54.5** rene ***,aaa milza * 38***,a intestino aaa 19 22***,a branchie aaa 76** 61*** sangue L analisi statistica del T di Student per dati non appaiati (a due code) risulta: significativamente differente da cellule positive per DLT15 (***) P<.1; (**) P<.1, (*) P<.5; da normossigenati ( aaa ) P<.1; ( aa ) P<.1, ( a ) P<.5. DLT15= anti-linfociti T; DLIg3= anti-linfociti B.

24 RISPOSTA ANTICORPALE in vitro vitro

25 RISPOSTA ANTIBATTERICA in vitro Immersion-vaccination against Photobacterium damselae and immunoadjuvanticity of E. coli rltk63 a,7,6 HK,6 b,5 Gills,5,4,4,3,3,2,2,1, control Phda Phda + LTK63 In vitro production of anti-phda immunoglobulins. Head kidney and gill leucocytes at indicated days incubated with the immunisation antigen (Photobacterium damselae bacterin) ) adsorbed onto plastic for 48 hours at 18 C. Cells were then removed and specific antibody detected by ELISA.

26 IMMUNITA UMORALE in vitro Produzione di anticorpi specifici anti: P.damselae da leucociti di branchie e rene cefalico,3,25 "In vitro" Ig, P. damselae Abs. 492 nm,2,15,1,5 Gills pre Gills post HK pre HK post 64 days after boosting

27 IMMUNITA CELLULARE

28 TcR Ag MHC T-cell activities CD4-8 T-cell APC Activation of T-cell populations trigger somatic ricombination of TcR, T-cells proliferation and cytokine production

29 Profilo linfocitario DLT15= T-cells Linfociti T (%) Linfociti B (%) DLIg3= B-cells normossia iperossia normossia iperossia timo aaa 78*** 54.5** rene *** ***,aaa milza * 38***,a intestino aaa 19 22***,a branchie aaa 76** 61*** sangue Questa distribuzione è correlabile allo uptake dell antigene?

30 Abundance of T-cells in the intestine T- cells B- cells relative cell number T-lymphocytes in the gut T-cells Epithelial cells anterior middle posterior May this be important for oral vaccination?

31 Relative density of T-immunoreactive cells in sea bass lymphoid organs (quantitative immunocytochemistry) number of cells/1 micron thymus days post-hatching num ber of cells/1 m icron kidney days post-hatching number of cells/1 micron intestine days post-hatching number of cells/1 micron spleen days post-hatching

32 Relative density of B-immunoreactive cells in sea bass lymphoid organs during development number of cells/1 micron2 1,9,8,7,6,5,4,3,2,1 thymus number of cells/1 micron2 1,2 1,8,6,4,2 number of cells/1 micron2 1,5 1 CON QUESTI DATI POSSIAMO AFFERMARE,5 CHE DICENTRARCHUS LABRAX E days post-hatching days post-hatching IMMUNOLOGICAMENTE COMPETENTE intestine days post-hatching number of cells/1 micron2 4,5 4 3,5 3 2,5 2,5 2 1,5 1,5 2 kidney A 3 MESI DI ETA spleen days post-hatching

33 Interleukin-1: an important regulator of immune respons T-cell MHC I MHC II Cytotoxicity Helper activity CD8 CD4 Th1 Th2 IFNγ IL-1 activation deactivation

34 B-cells and T-cells can be immunopurified with mab Purified B-cells have an enhanced proliferative capability 6 Proliferation index (arbitrary units) leucocytes DLIg3-purified HK leucocytes from Vibrio-immunised fish incubated in vitro with antigen. ATP- luminescence assay

35 A typical T-cell activity The one-way mixed leucocyte reaction (MLR) Blood Stimulator PBL (inactivated by irradiation or mitomycin) Effector PBL 1 PBL Effector PBL n 25 Effector / Stimulator ratio = 5:1 Effector PBL 2

36 in vitro MLR Metodo di indagine: Alloreazione di PBL contro PBL irradiati (MLR). Conta linfocitaria tramite FACS a 3 25 B cells= Empty bars T cells = solid bars b 3 25 B cells= Empty bars T cells = solid bars 2 2 Percent of positive cells * 2 4 Weeks Percent of positive cells Weeks Control PBL MLR

37 Flow cytometric analysis of MLR DMEM PBL MLR

38 2 weeks MLR: effects of cyclosporin-a (5 µg/ml) cyclosporin A is known in mammals to inhibit T-cell activities through the depression of T- cells growth factors production, by preventing activation of transcription factors involved in cytokine expression Control MLR MLR + Cs A

39 Cytotoxicity assay of MLR cultures PBL and MLR E 4 days E+T T SAF-1 fibroblasts (from sea bream) ATP-based luminometric assay Rationale: : target (damaged( damaged) cells should have less intracellular ATP Advantage: effector cells may be removed easily % cell viability = (E+T) E / T x 1

40 Xenogeneic reaction (PBL on mitomycin-treated treated SAF-1 cells) Assay: IIF and flow cytometry with mab DLIg3 and DLT15 Xenoreaction B-cells: 4 days Xenoreaction T-cells, 4 days Percent positive cells in PBL ANOVA test, p=.16 control xeno Percent positive cells in PBL ANOVA test, p=.13 control xeno

41 Cytotoxicity in xenoreaction at 4 days 2 E = PBL T = SAF-1 cells percent target survival Assay: luminometric determination of intracellular ATP 2;1 1;1 5;1 1;1 E:T ratio

42 Fish immunopharmacology Oncorhynchus mykiss IL-1 N-end C-end b-bulgebulge loop Dicentrarchus labrax IL-1 N-end C-end b-bulgebulge loop

43 N- end Dominio I C- end Trout IL-1 receptor (Il-1R I ) Dominio III Trout IL-1 bound to Il-1R I Dominio II A synthetic peptide derived from the bulge loop has good immunoadjuvant activity IL-1 OO EXPENSIVE, AT PRESENT, FOR APPLICATION IN FISH FARMING IL-1R

44 WP New vaccine strategies WP2.4 Immuno- Stimulants WP3.2 Antibody Response assays SIXTH FRAMEWORK PROGRAMME PRIORITY 5 FOOD QUALITY AND SAFETY Improved immunity of aquacultured animals WP1.1 Differential display Subtractive hybridisation Microarray WPs1-2 Disease models Vaccination Immunostimulation Challenge Stress WP Immune response analyses Histological studies (IMAQUANIM) Homology cloning New genes related to immune defense mechanisms Genomics of immunity - Qualitative and quantitative assays for gene expression - Functional analysis WP Previously characterised defense gene elements WP3.2+ WP13.1 Platform for better disease protection - Gene array assays for quantitative and qualitative determination of immuno competance and vaccine efficacy. - Assays for determination of pathogen-related immunological status Antibodies to Key molecules

45 Contributo alla divulgazione in acquacoltura: LA RICERCA SCIENTIFICA INNOVATIVA IN ACQUACOLTURA: LA GENOMICA PER IL MANTENIMENTO DELLA SALUTE DELLE SPECIE ALLEVA Elisa Randelli, Daniela Casani, Francesco Buonocore, Giuseppe Scapigliati Bollettino API, in stampa, 26

46 RINGRAZIAMENTI Lab di Biotecnologie Animal Univ.. Della Tuscia,, VT Scottish Fish Immunology Research Centre,, Aberdeen University, UK ICRAM, Roma M.I.P.A,, 4C, 5C EU 5FP FISHAID EU 6 FP IMAQUANIM Nuova Azzurro, Civitavecchia