L ESPERIENZA DEL PASSATO PER COMPRENDERE IL FUTURO Pier Mario Gerthoux

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1 40 ANNI STUPEFACENTI: LA TOSSICOLOGIA TRA PASSATO, PRESENTE E FUTURO L ESPERIENZA DEL PASSATO PER COMPRENDERE IL FUTURO Pier Mario Gerthoux Azienda Ospedaliera di Desio e Vimercate

2 40 ANNI STUPEFACENTI: LA TOSSICOLOGIA TRA PASSATO, PRESENTE E FUTURO L ESPERIENZA DEL PASSATO PER COMPRENDERE IL FUTURO Pier Mario Gerthoux Azienda Ospedaliera di Desio e Vimercate

3 Anni 80 Emergenza droga 1983 Istituzione dei Nuclei Operativi per le Tossicodipendenze (N.O.T) Necessita di conoscere lo stato di tossicodipendenza 10 laboratori sul territorio della Regione Lombardia

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7 Dosaggio Morfina in HPLC

8 HPLC Dosaggio morfina

9 1990 Istituzione dei Servizi per le Tossicodipendenze (Ser.T.)

10 Dosaggi effettuati dal Laboratorio dell Ospedale di Desio dal 1985 al morfina cocaina cannabinoidi

11 Attività del Laboratorio di Desio nel 1996 Dosaggio Morfina Metadone Cocaina Cannabinoidi Amfetamine Barbiturici Alcool 6677 Benzodiazepine Buprenorfina

12 Valore aggiunto dell informatica nel rapporto tra Ser.T e Laboratorio Richiesta diretta da parte del Ser.T Identificazione campioni con codici a barre Invio informatico di risposte singole e/o cumulative Creazione di un archivio informatico consultabile dal Ser.T

13 Vantaggi ottenuti da un sistema in linea Nessun errore nell identificazione del soggetto Scambio di informazioni in tempo reale Creazione di un archivio personale Informazioni epidemiologiche in tempo reale Possibilità di scambio di informazioni per la creazione di un Osservatorio Epidemiologico

14 Il rapporto tra i Ser.T e il Laboratorio Riunioni per organizzare l attività comune Scambi di informazioni Norme per la raccolta dei campioni Richiesta dati su ricerche da eseguire

15 Confronto delle positività (%) per morfina cocaina e cannabinoidi dal 1989 al % CANNAB. COCAINA MORFINA ng/ml

16 Il laboratorio deve, quale compito fondamentale, assicurare che il dato analitico sia corretto, ovvero che l assegnazione di positività o negatività ad un dato campione sia corrispondente alla effettiva presenza o assenza in quel campione di quella droga Alan I. Leshner NIDA Director

17 Problematiche analitico-interpretative Obiettivi dell indagine Cut-off analitici Scelta delle procedure e delle tecniche analitiche Interpretazione dei risultati

18 Prevenzione degli errori Adeguata conoscenza di: Concentrazione dei cut-off Eventuali reazioni interferenti Reazioni crociate Una corretta interpretazione clinica dei risultati dipende dalla conoscenza di queste variabili

19 +3 Dosaggio: MORFINA +2 * CQ Interno Strumento: ELAN * * Controllo: media = DS = * * * * * * * batch

20 VEQ

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22 Gas Cromatografia associata alla Spettrometria GC-MS di Massa Richiesta/accettata come tecnica di conferma rigorosa per le droghe d'abuso poichè fornisce un alto livello di specificità Indicazione all'uso contenuta nelle linee guida di Istituzioni e Società scientifiche statunitensi: Department of Health and Human Services National Institute on Drugs of Abuse American Association of Clinical Chemistry College of American Pathologists American Academy of Forensic Sciences

23 Gas Cromatografia associata alla Spettrometria di Massa GAS CROMATOGRAFO SPETTROMETRO DI MASSA

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25 6MAM GC-MS SIM D3M Codeine Morphine scan

26 Fine anni 90 Cromatografia liquida associata alla spettrometria di massa Vantaggi Permette di analizzare composti non volatili non adatti per GC-MS Permette di eliminare SPE ottenendo miglior sensibilità su analisi di droghe rispetto a GC- MS Per alcune applicazioni dove è necessario pre-purificare la matrice biologica è possibile eseguire una purificazione on-line direttamente sullo strumento

27 LC-MS, TRAPPOLA IONICA AUTOSAMPLER PUMP HPLC LTQ LINEAR ION TRAP MASS SPECTROMETER

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29 Regione Lombardia Vi è stato un notevole aumento del numero di laboratori che dosano queste sostanze. In Lombardia sono passati da 10 nel 1984 a 68 nel 1996

30 Necessità di: Linee guida Aggiornamenti Proficiency testing Esigenza di creazione di: Toxicology working group

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32 Anni 90 - SIBioC Creazione gruppo di studio sulla tossicologia ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Proposta di linee guida per l analisi di farmaci e sostanze d abuso nei capelli S. Pichini, A. Palmieri, M. Pellegrini, P. Zuccaro, R. Pacifici 1999

33 Per garantire una buona qualità del risultato: Validare metodologie analitiche Confrontare tra loro i laboratori Standardizzare i risultati

34 TEST DI SCREENING POSITIVI E NEGATIVI CUT-OFF TEST IMMUNOCHIMICI TEST QUALITATIVO, IMMUNOCHIMICO NO DISTINZIONE TRA USO OCCASIONALE E CRONICO FALSI POSITIVI E NEGATIVI CLASSI DI SOSTANZE

35 TEST DI SCREENING

36 Metodo EMIT

37 Confronto di risultati (n=50)

38 TEST DI CONFERMA principi chimici-fisici diversi dallo screening identificazione dei singoli analiti sensibilità > dei cut-off del test di screening dato quantitativo analisi di miscele complesse dosaggio di tracce di composti

39 E necessario raggiungere la ragionevole certezza che: Un risultato positivo sia effettivamente tale (e non dovuto, per esempio, ad una contaminazione del sistema). Un risultato negativo non sia dovuto ad un difetto nell applicazione del metodo.

40 Ogni analisi costituisce, al limite, un caso individuale Non esistono regole applicabili a tutte le droghe e in tutte le situazioni

41 CAMPIONE scelta essenziale in funzione alla finalità diagnostica differenza principale tra campioni è finestra temporale altre differenze: costi analisi, invasività prelievo, riproducibilità risultati, possibilità interferenze, difficoltà analitiche,.

42 Errori analitici Posono avere ricadute a livello sociale e giudiziario: Sulla qualità della vita Sulla libertà individuale Sui diritti civili

43 IL PROBLEMA DELL ABUSO ALCOLICO IN ITALIA CIRCA 32 MILIONI DI PERSONE CONSUMANO REGOLARMENTE BEVANDE ALCOLICHE MENTRE 3,5 MILIONI BEVONO IN MANIERA INADEGUATA IL 20% DEI RAGAZZI TRA 11 E 15 ANNI CONSUMA ALCOLICI

44 ALCOOLEMIA TEST DI SCREENING METODO ENZIMATICO alcool deidrogenasi ( ADH) NAD+ + ETANOLO NADH + ACETALDEIDE ad opera di alcool deidrogenasi

45 ALCOOLEMIA TEST DI CONFERMA GAS-CROMATOGRAFIA CON IONIZZAZIONE A FIAMMA Tecnica dello head space SPAZIO DI TESTA diffusione dell etanolo in un recipiente ermeticamente chiuso

46 ETANOLO CROMATOGRAMMA Butanolo

47 La droga invisibile ( dr. Riccardo Gatti) Non esiste piu` Emergenza droga Normalizzazione del fenomeno Aumento dei consumatori

48 Fenomeno Droga Intossicazioni acute Consumatori cronici Consumatori abituali Consumatorioccasionali

49 Dalla relazione annuale al Parlamento sullo stato delle Tossicodipendenze in Italia 2005 : italiani hanno fatto uso di cannabis (½ milione tra i 19 e i 21 anni) 11 milioni di italiani non disapprovano l uso di cannabis o lo ritengono non dannoso

50 PERCHÉ IL DRUG TESTING È OGGI DI VITALE IMPORTANZA NEL MONDO DEGLI AFFARI E DELL INDUSTRIA? Perché il 74% di tutti i tossicodipendenti ha un impiego Studi governativi (USA) rivelano che 1 lavoratore su 6 ha problemi di droga e mostrano che in media i tossicodipendenti: costano alle imprese 300% in più in spese mediche e assistenza sono assenti fino a 16 volte più spesso sono di 1/3 meno produttivi

51 ACCERTAMENTI DI NON DIPENDENZA Decreto legislativo 9 aprile 2008 n.81 recante disposizioni sulla sorveglianza sanitaria e C onferenza Stato-Regioni del 18/09/2008 Procedure per gli accertamenti sanitari di assenza di tossicodipendenza o di assunzione di sostanze stupefacenti o psicotrope in lavoratori addetti a mansioni che comportano particolari rischi per la sicurezza, l'incolumità e la salute di terzi

52 La validità dei risultati di laboratorio non dipende solo dall adeguatezza del processo analitico, ma anche dalla prova dell integrità del campione dal momento in cui e stato raccolto fino a quando l analisi viene completata

53 LA CATENA DI CUSTODIA Procedura che garantisce l autenticità del campione Documentazione che accompagna il campione e che tiene traccia del prelievo, trasporto e conservazione

54 Azienda Ospedaliera di Desio e Vimercate PRESIDIO DI DESIO SERVIZIO DI PATOLOGIA CLINICA Direttore: Prof Paolo Brambilla Tel /273/391 - Fax Raccolta urine per sostanze stupefacenti Rev. 2 01/05/2009 VERBALE DI PRELIEVO Nome.. Cognome riconosciuto con documento di identita n.. Ha raccolto il giorno.. mese anno.. alle ore. tre campioni di urine. Il paziente è stato informato che il test per la ricerca di sostanze stupefacenti in caso di positivita sarà sottoposto a test di conferma e che una aliquota sarà conservata per eventuali controanalisi. Eventuali farmaci assunti... Data.. ora.. Firma del paziente Firma del prelevatore

55 PERCENTUALI DI POSITIVITA % 148 LAVORATORI POSITIVI SU % % 3% 2% Cannab. Cocaina Morfina Bupren. Metad

56 Il numero di lavoratori positivi ai test di conferma dai nostri primi dati si colloca intorno al 1,4 % Il numero delle positività più consistente è per i cannabinoidi I test di screening on-site hanno presentato un elevato numero di false positivita

57 EVOLUZIONE LC-MS Eseguire multi analisi di droghe in una singola corsa cromatografica mantenendo le stesse performance delle singole analisi

58 LC-MS, TRIPLO QUADRUPOLO HPLC SPETTROMETRO DI MASSA PURIFICAZIONE ON-LINE GRAZIE A TECNICA TURBOFLOW

59 METODO MULTI-DRUG: VANTAGGI 1. Un unica corsa cromatografica permette di analizzare circa 20 analiti contemporaneamente 2. Metodo quantitativo 3. Durata della corsa solo 15 minuti 4. Riconoscimento delle sostanze in libreria 5. Non necessaria SPE 6. Risparmio di solventi, tempi, costi

60 THC-COOH METODO MULTI- DRUG

61 Std urina oppiacei I 100 ng/ml

62 Std urina cocaina 100 ng/ml

63 Campione di capello positivo per oppiacei MORFINA CODEINA 6-MAM MORFINA D3 CODEINA D3

64 EVOLUZIONE MS: ALTA RISOLUZIONE Nelle misure ad alta risoluzione la massa è misurata con una precisione di 4 cifre decimali Il massimo errore accettabile è di 5 parti per milione La formula molecolare è quella che rientra in questo margine di errore tra tutte quelle possibili Le formula molecolari per ogni massa intera sono tabulate Uso della misura di massa ad alta risoluzione per la determinazione della formula molecolare

65 Orbitrap e qualità in tossicologia forense? Aumento della specificità ORBITRAP Aumento del potere di informazione Aumento del potere discriminante Come aumentare la specificità in spettrometria di massa? Determinare la composizione elementare degli ioni (HRMS) Produrre frammenti specifici (MSn) Orbitrap = alta risoluzione e tandem massa HS/MSn

66 ORBITRAP SPETTROMETRO DI MASSA HPLC

67 ESEMPIO THC-COOH NEI CAPELLI FORMULA BRUTA C21H29O4 DELTA PPM < SPETTRO MSn SPETTRO FULL-SCAN

68 Sensitivity, Trueness, and Precision 1960 Manual techniques Automated analyzer FUTURE Colorimetric assay Radioimmunological Immunoenzymatic Chemiluminescence assay Molecular methods PCR / Real time PCR MicroArray, 2D-PAGE GC-MS, MALDI-TOF, LC-MS, SELDI g mg mg ng pg ( ) 1 molecule

69 Grazie per l attenzione

70 Grazie per l attenzione

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72 NORMATIVE Codice della Strada, articolo 186 e 187 Decreto legge sul controllo di lavoratori Delibera regionale sul controllo dei lavoratori Delibera regionale per autorizzazione a svolgere attività tossicologica legale Delibera regionale per Commissioni Patenti

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76 Relative Abundance CROMATOGRAMMI RT: SM: 15G RT: AA: SN: 381 RT: AA: SN: 1127 RT: AA: 1058 SN: 16 RT: AA: 628 SN: 13 NL: 4.24E2 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC NL: 2.57E3 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC RT: SM: 15G RT: AA: 5449 SN: 354 RT: AA: SN: 1454 RT: AA: 2265 SN: 57 RT: AA: 1266 SN: 71 NL: 1.72E2 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC NL: 5.55E3 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC RT: AA: SN: Time (min) NL: 1.10E3 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC RT: AA: SN: 501 RT: AA: 1106 SN: Time (min) NL: 7.22E2 TIC F: ITMS + c APCI corona Full ms @ @0.00 [ ] MS ICIS TAC

77 RICONOSCIMENTI GC-MS Controllo tossicologico in urina contenente THC-COOH SPETTRO CAMPIONE SPETTRO SOSTANZA RIFERIMENTO THC-COOH 99%

78 Rete di Ser.T collegata con il Laboratorio dell Ospedale di Desio Desio e Seregno Monza e Carate Cernusco S.N. Trezzo d Adda e Vimercate

79 IL PROBLEMA DELL ABUSO ALCOLICO SOCIALE MEDICO-LEGALE

80 ORBITRAP

81 Orbitrap e qualità in tossicologia forense? Aumento della specificità Aumento del potere di informazione Aumento del potere discriminante Come aumentare la specificità in spettrometria di massa? Determinare la composizione elementare degli ioni (HRMS) Produrre frammenti specifici (MSn) Orbitrap = alta risoluzione e tandem massa HS/MSn

82 Campione di capello positivo per oppiacei MORFINA CODEINA 6-MAM MORFINA D3 CODEINA D3

83 Campione di capello positivo per cocaina e benzoilecgonina ECGONINA METIL-ESTERE BENZOILECGONINA COCAINA COCAETILENE BEC D3

84 Campione di urina positivo per oppiacei

85 Campione di urina positivo per oppiacei MORFINA CODEINA MORFINA D3 CODEINA D3

86 RICONOSCIMENTI GC-MS Campione di urina positivo per cocaina e benzoilecgonina SPETTRO CAMPIONE SPETTRO SOSTANZA RIFERIMENTO COCAINA 99%

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89 HPLC Autosampler and injector HPLC column HPLC Solvent Reservoirs Detector Pump

90 Anni 80

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92 Variazioni percentuali di positività multiple per gli anni % BZDP/COCA BZDP/COCA/ERO BZDP/ERO BZDP/THC COCA/THC COCA/ERO THC/ERO COCA/THC/ERO ALTRE

93 Diventa estremamente importante dare l opportunità a tutti di crescere per potere rendere alla fine un migliore servizio all utente

94 Variabili nel dosaggio di sostanze stupefacenti Preanalitiche Quantità Frequenza di assunzione Poliassunzione Modalità di raccolta Analitiche Numerosità delle sostanze Strutture chimiche Intervalli dose-conc Conservazione No studi metabolici

95 TEST DI CONFERMA Gas cromatografo fiale autocampionatore

96 Azienda Ospedaliera di Desio e Vimercate PRESIDIO DI DESIO SERVIZIO DI PATOLOGIA CLINICA Direttore: Prof Paolo Brambilla Tel /273/391 - Fax Raccolta urine per sostanze stupefacenti Rev. 2 01/05/2009 RACCOLTA URINE PER DOSAGGIO SOSTANZE STUPEFACENTI PER MOTIVI MEDICO LEGALI Identificare il paziente mediante documento di identità Far lasciare borse o giacche in uno spazio fuori dal bagno Far lavare le mani prima della raccolta Non aprire acqua dei rubinetti non far scorrere l acqua del water Tenere la porta del bagno aperta durante la raccolta Spiegare al paziente come avviene la raccolta Dare al paziente il contenitore apposito per la raccolta delle urine

97 Std urina amfetamine 100 ng/ml

98 Std urina oppiacei II 100 ng/ml

99 Campione di urina positivo per cocaina e benzoilecgonina ECGONINA METIL-ESTERE BENZOILECGONINA COCAINA COCAETILENE BEC D3

100 ESEMPIO: THC-COOH NEI CAPELLI ANALISI FULL SCAN ANALISI MSn IONE PARENTE CON 4 CIFRE DECIMALI