LE FLOGOSI PELVICHE I consigli del microbiologo

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1 LE INFEZIONI IN GINECOLOGIA Mestre, 19 febbraio 2010 LE FLOGOSI PELVICHE I consigli del microbiologo Dott. Stefano Grandesso U.O.C. di Laboratorio Analisi Ospedale dell Angelo Mestre Azienda ULSS 12 Veneziana

2 Criticità del campione microbiologico Fase pre-analitica Fase analitica Fase post-analitica

3 LA FASE PREANALITICA IN MICROBIOLOGIA Rappresenta un momento cruciale nell ambito del processo di Laboratorio, durante la quale si compie il 46% degli errori Rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate al processo Significa occuparsi di come il laboratorio è in grado di rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge

4 Prelievo del campione ZONE NORMALMENTE STERILI Sangue e midollo Liquido cefalo rachidiano (LCR) Liquido articolare o della cavità pleurica Tessuti profondi Vie respiratorie inferiori Urine (se il campione è opportunamente raccolto) ZONE CON POPOLAZIONE BATTERICA RESIDENTE Bocca, naso, vie respiratorie superiori Cute Tratto gastrointestinale Tratto genitale femminile Uretra

5 Modalità di raccolta del campione Raccogliere il campione in quantità sufficiente Scegliere un campione rappresentativo del processo morboso facendo in modo che esso contenga il patogeno da identificare Raccogliere il campione nella fase acuta di malattia e comunque prima dell inizio del trattamento antibiotico Se il trattamento antibiotico è invece già stato iniziato segnalare al laboratorio quale terapia è stata somministrata Evitare contaminazioni da parte di microrganismi esterni

6 Modalità di trasporto del campione Usare contenitori idonei e opportuni terreni di trasporto Etichettare adeguatamente i campioni Completare la richiesta di esame con la diagnosi presunta Inviare rapidamente il campione al laboratorio in appropriate condizioni di temperatura (+4 C o al massimo a temperatura ambiente, mai a 37 C).

7 Il tampone Dacron e rayon: OK Cotone: NO (ac. grassi tossici per certi microrganismi) Calcio alginato: NO (interferenza con reagenti di estrazione o ricerche virali o Chlamydia) Sopravvivenza: a secco: 0-20% 0 a 4 ore sistemi di trasporto: ore Stuart/Amies Amies/Cary-Blair: : OK

8 Campioni dall apparato apparato genitale maschile e femminile

9 Eziopatogenesi Microrganismi più frequentemente implicati: Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Mycoplasmi/Ureaplasmi Gardnerella vaginalis (solo in caso di vaginosi) Batteri anaerobi (ma chi ci pensa?? Chi li richiede? Trasporto?) Escherichia coli ed altre Enterobacteriaceae Streptococcus agalactiae (solo in gravidanza) Staphylococcus aureus (TSS?) Haemophilus influenzae (età pediatrica) Mycobacterium tuberculosis Actinomyces israelii Listeria spp (solo in gravidanza) Streptococcus pyogenes (età pediatrica) Miceti Trichomonas vaginalis Nella maggior parte dei casi l eziologia è polimicrobica

10 ITER DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DELLE INFEZIONI DELLE BASSE VIE GENITALI FEMMINILI

11 Iter diagnostico Dosaggio ß-hCG Valutazione con speculum per la valutazione di eventuali perdite cervico-vaginali vaginali muco-purulente Prelievo Prelievo cervicale per la ricerca di Neisseria e Chlamidia Prelievo Prelievo vaginale per la ricerca dei germi comuni e del Trichomonas Prelievo Prelievo uretrale per Chlamidia (analisi mediante amplificazione del ( DNA Esami ematochimici (emocromo con formula, VES, ( PCR Valutazione pelvica bimanuale La negatività degli esami di laboratorio non esclude la PID

12 Punti critici Modalità di prelievo Valutazione del secreto vaginale Trasporto e conservazione dei campioni Mancanza di informazioni sulla paziente Mancanza di informazioni sul secreto vaginale Interpretazione dei risultati

13 Nella pratica quotidiana Diagnosi clinica presunta Esame microscopico a fresco raramente eseguito in ambulatorio Prelievi inadeguati (tecnica, conservazione, trasporto) Specie microbica non identificata Antibiogramma/antimicogramma spesso eseguito in routine

14 Modalità di prelievo Tampone di secrezione vaginale Utilizzare uno speculo bivalve sterile monouso Introdurre il tampone fino al collo dell utero Evitare di toccare le zone esterne 1. Cervice 2. Vagina 3. Retto 4. Vescica 5. Tampone 6. Speculo 7. Utero

15 Modalità di prelievo Vaginale Norme a cui attenersi per rendere attendibile l esito dell esame: Non essere in periodo mestruale Non eseguire irrigazioni vaginali nelle 24 ore precedenti l esame Aver cessato qualsiasi terapia da almeno 5 giorni Introdurre il tampone fino al collo dell utero, evitando di toccar le zone esterne

16 Secreto cervicale: potenziali agenti eziologici Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Anaerobi Micoplasmi (> 10 4 UFC/ml)

17 Tampone cervicale Come si effettua? Si esegue prelevando del materiale dalla cervice uterina, applicando prima lo speculum. E' un prelievo assolutamente indolore.

18 Modalità di prelievo Cervicale Prelievo effettuato a livello endocervicale previa introduzione di uno speculum bivalve sterile inserire il tampone nell endocervice endocervice per circa 1 cm per la ricerca di Chlamydia trachomatis il tampone va inserito per 1.5 cm oltre la giunzione squamosa

19 Secreto uretrale: potenziali agenti eziologici Gardnerella vaginalis Streptococcus agalactiae Staphylococcus aureus Enterobacteriaceae Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Micoplasmi Miceti Trichomonas vaginalis

20 Modalità di prelievo Uretrale Prelievo effettuato introducendo un tampone sottile nell uretra non aver urinato da almeno 3 ore il tampone deve essere introdotto per circa 1 cm

21 Informazioni necessarie al Laboratorio Età Sintomatologia Gravidanza Interruzioni di gravidanza Contraccettivi Farmaci assunti nell ultimo mese ph vaginale Fishy odor test Esame microscopico a fresco

22 Esami in ambulatorio a fresco Fishy odor test Test del ph

23 Esame microscopico a fresco stemperare subito il tampone in 0.5 ml di soluzione fisiologica sterile porre 2 gocce su un vetrino e coprire con copri-oggetto osservare con obiettivo 40X

24 ESAME A FRESCO DELLE SECREZIONI VAGINALI

25 Fishy odor test emulsionare la secrezione vaginale con una soluzione di KOH al 10% se positivo: sviluppo del caratteristico odore di pesce

26 Test del ph Va misurato prima dell inserimento dello speculum sulle pareti vaginali laterali utilizzando cartine indicatrici con range 3.5-5

27 VALUTAZIONE DEL ph VAGINALE

28 Ruolo del laboratorio di Microbiologia Ricevere il campione con richiesta specifica di sospetto clinico Esaminare i campioni biologici Isolare e identificare il microrganismo Valutarne il ruolo eziologico Eseguire il saggio di sensibilità in vitro agli antimicrobici solo se necessario (secondo le Linee guida CLSI/ EUCAST)

29 Esami in laboratorio Colorazione di Gram Esami colturali Biologia molecolare (?)

30 Colorazione di Gram Fasi della colorazione Struttura della parete Gram-positivi Gram-negativi

31 Esame microscopico Gardnerella vaginalis (??) Colorazione di Gram

32 Coccobacilli (Gardnerella vaginalis su clue cell ) Gold standard!!

33 Esame colturale per batteri Gram-negativi agar McConkey (Enterobatteri) agar sangue (G. vaginalis) agar cioccolato (Gonococco) Gram-positivi agar sale mannite (Stafilococchi) agar sangue (Streptococchi )

34 Eziologia micotica Candida albicans Candida glabrata Candida krusei Candida spp. Saccharomyces cerevisiae

35 Lieviti: esame colturale Sabouraud dextrosio agar (Incubazione a 37 per 2-5 gg)

36 Chlamydia : generalità Le Chlamydie sono un gruppo di microrganismi, obbligatoriamente intracellulari, che hanno perso la capacità di produrre autonomamente l energia l a loro necessaria, divenendo parassiti energetici delle cellule ospiti. La famiglia delle Chlamydiaceae comprende il genere Chlamydia,, con tre specie di interesse medico C. psittaci C.pneumoniae C.trachomatis le prime due sono responsabili di infezioni polmonari, la terza responsabile del linfogranuloma venereo, del tracoma e di numerose infezioni a prevalente trasmissione sessuale.

37 Chlamydia Reported rates: Total and by sex: United States, 1987 Rate (per 100,000 population) Men Women Total Note: As of January 2000, all 50 states and the District of Columbia had regulations requiring the reporting of chlamydia cases.

38 Conseguenze cliniche dell infezione da C. trachomatis DONNE % Infezione cervicale ed uretrale 30 % Solo infezione cervicale 5-30 % Solo infezione uretrale Cerviciti Uretriti Endometriti Malattia infiammatoria pelvica (PID) Ascesso ghiandola del Bartolini Gravidanza extrauterina Salpingiti Sterilità UOMINI Uretriti Epididimiti Artrite Sindrome di Reiter NEONATI Congiuntivite neonatale Polmoniti

39 C. trachomatis Infections in Cervicitis Women Majority are asymptomatic Local signs of infection, when present, include: Mucopurulent endocervical discharge Edematous cervical ectopy with erythema and friability Urethritis Usually asymptomatic Signs/symptoms, when present, include dysuria, frequency, pyuria

40 Normal Cervix Source: STD/HIV Prevention Training Center at the University of Washington/Claire E. Stevens

41 Chlamydial Cervicitis Source: STD/HIV Prevention Training Center at the University of Washington/Connie Celum and Walter Stamm

42 Cervicitis Source: St. Louis STD/HIV Prevention Training Center

43 C. trachomatis Complications in Women Pelvic Inflammatory Disease (PID) Salpingitis Endometritis Perihepatitis (Fitz-Hugh Hugh-Curtis Syndrome) Reiter s s Syndrome

44 Normal Human Fallopian Tube Tissue Source: Patton, D.L. University of Washington, Seattle, Washington

45 C. trachomatis Infection (PID) Source: Patton, D.L. University of Washington, Seattle, Washington

46 Acute Salpingitis Source: Cincinnati STD/HIV Prevention Training Center

47 Test diagnostici

48 1 - Esame colturale Crescita su cellule Mc Coy Non produce effetto citopatico Evidenziazione mediante uso di anticorpi monoclonali fluorescenti Sensibilità : % Specificità : 100 % Vantaggi: Svantaggi: test di riferimento impiego in Medicina Legale Risposta tardiva (72 ore) Laboratorio attrezzato per colture cellulari Rispetto dei tempi di consegna trasporto dei campioni Non idoneo per indagini di screening

49 2 - TEST PER LA DETERMINAZIONE DELL ANTIGENE 2A - Immunofluorescenza diretta (IFD) 2B - Test immunoenzimatici (EIA) 2C - Test rapidi (EIA)

50 2a - Immunofluorescenza diretta (IFD) Antigene : MOMP (Proteina maggiore presente sulla membrana esterna del batterio) Sensibilità : uomini % donne % Specificità : uomini % donne % Vantaggi: Svantaggi: rapido eseguibile in tutti i laboratori verifica dell idoneità del campione applicabile a vari tipologie di campioni soggettivo diversi cut-off applicabile per un basso numero di campioni

51 2b - Test immunoenzimatici (EIA) Antigene : LPS (Lipopolisaccaride genere-specifico) più abbondante e solubile della MOMP Sensibilità : uomini % donne % Specificità : > 90 % Vantaggi: rapido Lettura oggettiva applicabile per un gran numero di campioni eseguibile in tutti i laboratori Svantaggi: falsi positivi

52 2c - Test rapidi (point of care) LA TECNOLOGIA UTILIZZATA è QUELLA EIA Vantaggi: - possono essere eseguiti direttamente presso l ambulatorio medico - risposta disponibile in circa 30 minuti - nella stessa seduta, in caso di positività, viene data direttamente la terapia Svantaggi: - falsi positivi - non possono essere usati in popolazione a bassa prevalenza o in soggetti asintomatici

53 3 - TEST PER LA DETERMINAZIONE DELL ACIDO NUCLEICO 3A - Test di ibridizzazione 3B - Test di amplificazione genica

54 3a - Test di ibridizzazione Sensibilità : 85 % Specificità : 98 % Rispetto all esame colturale Sensibilità : 77 93% Rispetto ai metodi di amplificazione genica Vantaggi: rapido Svantaggi: necessita di un test di conferma

55 3b - Test di amplificazione genica Sensibilità : altissima Specificità : > 99% Vantaggi: sensibilità specificità Svantaggi: laboratorio attrezzato per biologia molecolare falsi positivi falsi negativi per la presenza di inibitori

56 Serology Rarely used for uncomplicated infections Comparative data between types of serologic test are lacking Criteria used in LGV diagnosis Complement fixation titers >1:64 can support diagnosis in the appropriate clinical context Serologic test interpretation for LGV is not standardized

57 Conclusioni Tutta la più recente produzione scientifica indica nei test di amplificazione genica i metodi di scelta per la diagnosi di infezione da C.trachomatis negli uomini e nelle donne, nella popolazione a bassa ed alta prevalenza. L utilizzo di campioni diversi da quelli tradizionalmente saggiati (urine( urine) ) permette di effettuare screening anche su gruppi di pazienti che altrimenti sarebbe difficile esaminare, con un analisi del rapporto costi-benefici a favore dello screening. L ostacolo all uso di questi test è rappresentato dal costo, anche se destinato a diminuire con l aumento l dei prodotti commerciali a disposizione. Tuttavia, le urine possono costituire un campione difficile da gestire, la presenza di inibitori può compromettere il test.

58 GONORREA Agente eziologico: Neisseria gonorrhoeae, diplococco Gram- negativo a sede prevalentemente intracellulare Epidemiologia: rara nelle nazioni industrializzate (incidenza: casi/ abitanti/anno), rimane frequente nei paesi in via di sviluppo (incidenza 5000 casi/ abitanti/anno) Fonte di contagio: : contatto interumano diretto ed indiretto Tempo di incubazione: : giorni Diagnosi: : clinica, esame microbiologico (la ricerca del gonococco deve essere effettuata in 4 sedi: la cervice uterina, l uretra, l la faringe e l ano ed è più difficile che nell uomo per la ricchezza della flora cervicovaginale normale - sensibilità: : 20-30%) Terapia: : ceftriaxone, cefixime, ciprofloxacina, spectinomicina ( (da effettuarsi anche da parte del partner se pur asintomatico)

59 Diagnosi microbiologica della N. gonorrhoeae Esame microscopico: dopo colorazione Gram (patognomico nell uomo) Esame colturale: terreno selettivo Thayer-Martin-agar cioccolato in CO2 5% x 48 h Ricerca antigeni: metodi immunologici (risposta anticorpale non oltre 3 4 mesi) Ricerca acidi nucleici

60 Diagnosi microbiologica delle N.gonorrhoeae Essudato uretrale colorato con metodo GRAM

61 GONORREA UROGENITALE NELLA DONNA Sedi più colpite: cervice - canale cervicale Nel 75% si può associare uretrite Sintomi: secrezioni purulente, disuria, spotting se interessamento endometriale EOD: secrezione purulenta, eritema ed edema cervice, facile sanguinamento Oltre il 50% donne infettate è asintomatico

62 GONORREA: complicazioni salpingite: : febbre, dolore, può essere bilaterale con possibili ostruzioni condizionanti la sterilità e favorenti le gravidanze extrauterine pelviperitonite bartolinite interessamento delle ghiandole di Skene infezioni della prostata e del condotto spermatico epididimiti oftalmia gonococcica - per autoinoculazione nell adulto - per il contagio durante il parto (più frequenti) artrite gonococcica del ginocchio,, in genere monolaterale, a possibile evoluzione anchilosante setticemia: : rara. Colpisce l adulto l giovane e la donna non trattati per infezioni silenti o scarsamente sintomatiche. Il quadro clinico: febbre intermittente, dolori articolari e algie in altre sedi, tenosinoviti e manifestazioni cutanee (tipo pustole lenticolari effimere e scarse, circondate da un alone eritematoso, localizzate alle estremità e nelle regioni para-articolari). articolari). Altre localizzazioni: : splenomegalia, epatite, meningite, miocardite, endocardite.

63 Mycoplasma ed Ureaplasma I Micoplasmi, i, oggi inquadrati nella classe Mollicutes, sono i più piccoli microrganismi ( 200 nm ) dotati di autonomia riproduttiva. Hanno DNA bielicoidale circolare e si distinguono dai batteri per l assenza l di una parete rigida, sostituita da una membrana di unità con triplice stratificazione e contenente steroli. La mancanza di una parete cellulare rigida gli conferisce una naturale insensibilità alla penicillina e un grande pleomorfismo e plasticità cellulare. Altra caratteristica rilevante dei Mollicutes è la resistenza alla Rifamicina,, dovuta alla particolare configurazione del sito, a livello della subunità beta della RNA polimerasi, al quale detto antibiotico si lega.

64 Patologie causate da M.homimis e U.urealyticum. M.hominis e soprattutto U.urealyticum, sono chiamati in causa in un ampio range di patologie del tratto urogenitale. Nella donna sono responsabili di : uretriti, cerviciti e aborto precoce. Si ritiene che giochino anche un ruolo molto importante come microrganismi associati alla vaginosi batterica: inibendo i lattobacilli favorirebbero lo sviluppo di G. vaginalis e di batteri anaerobi. Nell uomo possono causare uretriti,prostatiti e prostato-vescicoliti subacute(25-50% dei casi) spesso accompagnate da emospermia. Sono stati descritti anche casi di epididimiti e balaniti; frequenti sono anche le forme asintomatiche o subacute.

65 Diagnosi di laboratorio La ricerca di Mycoplasma/Ureaplasma viene eseguita su secreto cervicale o uretrale. Metodo di riferimento per l identificazione è l esame colturale in terreni selettivi, che comportano una lunga incubazione ( in caso di negativi anche 25/30 gg. ). L identificazione deve essere sempre accompagnata dalla valutazione semiquantitativa del cut-off di carica ( UFC / ml ), al di sopra del quale si può attribuire un ruolo patogeno al microrganismo.

66 Coltura, identificazione e test di sensibilità dei Micoplasmi

67 Diagnosi di laboratorio Kit disponibili in commercio per l identificazione dei Mycoplasmi/Ureaplasmi, permettono una lettura rapida ( 48 h ), accompagnata sempre dalla carica batterica del microrganismo e il relativo antibiogramma. Recentemente sono state messe a punto sonde molecolari per la ricerca di questi microrganismi, mediante tecniche di ibridizzazione degli acidi nucleici.

68 Antibiotico - sensibilità dei Micoplasmi Ureaplasma urealyticum Mycoplasma hominis Numero di ceppi 298 9% Azitromicina 60.4% 0% Claritromicina 78.2% 0% Eritromicina 56% 0% Josamicina 95.9% 100% Ofloxacina 13.1% 44.4% Ciprofloxacina 2% 33.3% Tetraciclina 93.6% 55.6% Doxiciclina 96.9% 77.8% Pristinamicina 99.3% 100% Fonte: Microbiologia OdA Mestre

69 SHOCK TOSSICO DA STAFILOCOCCO AUREO (TOXIC SHOCK SINDROME= TSS) (1) Rara sindrome che colpisce donne in fase mestruale con esito mortale nel 2-13% 2 dei casi; si associa frequentemente all uso di tamponi vaginali, alla presenza nelle secrezioni vaginale dello Staphylococcus aureus,, all uso di diaframmi vaginali o corpi estranei in genere lasciati in situ.

70 SHOCK TOSSICO DA STAFILOCOCCO AUREO (TOXIC SHOCK SINDROME= TSS) (2) SINTOMATOLOGIA: TEMPERATURA >39 C IPOTENSIONE CON PS <90 mmhg ESANTEMA MACULARE DIFFUSO, SEGUITO DA DESQUAMAZIONE PALMARE E PLANTARE VOMITO, DIARREA, MIALGIE SEGNI DI INSUFFICIENZA EPATICA E/O RENALE PLT< /mm³; ; DIC TERAPIA: antibiotici resistenti alle ßlattamasi (oxacillina)

71 L antibiogramma Linee guida Non farlo in routine E necessario farlo solo in casi particolari (es. S. agalactiae in donne in gravidanza)

72 Rilevanza clinica dell antibiogramma ABG R S Risposta clinica Quasi certamente fallimento Risposta clinica/fallimento SDD Sensibile dose/dipendente ABG corretto ABG a disposizione Very major error R S Major error S R

73 Analisi di sensibilità adeguate MIC vere MBC, tolleranza Sinergia Meccanismi di resistenza MPC

74 Analisi di sensibilità adeguate ESBL, AmpC MRSA, hvisa, VISA, VRSA Metalloenzimi Porine, pompe di efflusso

75 MRSA Staphylococcus aureus meticillino-resistente

76 Evolution of Antimicrobial Resistance Penicillin Methicillin Penicillin-resistant Methicillin-resistant S. aureus [1950s] S. aureus [1980s] S. aureus (MRSA) [1997] Vancomycin [1990s] Vancomycin- Resistant S. aureus [? ] Vancomycin (glycopeptide) - intermediate Vancomycin-resistant enterococcus (VRE) resistant S. aureus

77 Staphylococcus spp e Oxacillino-Resistenza Impatto clinico rilevante R a tutti i beta lattamici Penicilline Cefalosporine Carbapenemi R associata anche ad altre classi di antibiotici Clindamicina Cotrimossazolo Fluorochinoloni Glicopeptidi spesso unica opzione terapeutica Vancomicina Teicoplanina Synercid Linezolid

78 CID 2005;41:S

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80 Ceppo VISA Agar Sangue dopo 48 h a 35 C Morfologia eterogenea Crescita più lenta (48 h) Formano aggregati in terreni liquidi

81 23 giugno 2004 FDA (Food and Drug Aministretion) CDC (Center for Dis.Control and Prev.) MMWR 23 Aprile 2004: terzo caso di S. aureus Vancomicina resistente Secondo le indagini condotte su questo isolato, i sistemi automatici utilizzati non sono stati in grado di rilevare la resistenza alla vancomicina. Il CDC raccomanda ai laboratori di avvalersi di metodi di riferimento in MIC non automatici, come la microdiluizione in brodo o la diluizione in agar in alternativa si consiglia di utilizzare BHI agar arricchito con 6 µg/ml di vancomicina (JCM 1998; 36:1020-7) Poichè la mancata rilevazione di VRSA è un problema di salute pubblica, l FDA l ha richiesto a tutti i produttori di test per antibiogramma di notificare ai propri clienti questo problema unitamente alle raccomandazioni del CDC

82 Gram negativi

83 Betalattamasi nei gram negativi Tem 1 Ampicillina R Amoxi-clav S Ceftazidime S Iperproduttore Tem 1 ESBL Ampicillina R Amoxi-clav R Ceftazidime S Ampicillina R Amoxi-clav R Ceftazidime R Piper/tazob.S/R Cefepime S/R Imipemen S

84 ESßL Per ogni antibiotico, dopo l introduzione nell uso terapeutico, si sono selezionati ceppi batterici resistenti, in grado di esprimere nuove funzioni di difesa con modalità differenti ABUSO DI CEFALOSPORINE Meticillino Resistenza Induzione di ESβL Resistenza in pneumococco e enterococco ABUSO FLUOROCHINOLONI Resistenza ai fluorochinoloni Diffusione ESβL ABUSO MACROLIDI Resistenza in pneumococco e SβEGA

85 ESßL Uso-Abuso Cefalosporine INFEZIONI DA PATOGENI ESβL TRATTAMENTO CON CARBAPENEMI Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia MDR

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