Liquido cefalorachidiano

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1 Liquido cefalorachidiano E un liquido biologico prezioso dal punto di vista laboratoristico - prelevabile in quantità limitate e con minore frequenza rispetto a sangue ed urine -prelevato con una manovra invasiva

2 Pertanto: - Richiede una maggiore attenzione sia da parte del neurologo che da parte del laboratorista: A. decisione preliminare degli esami da richiedere, che influenza a sua volta B. la quantità di liquido prelevato e C. le modalità di raccolta e conservazione del campione

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4 Proteine liquorali Concentrazione 0.5-1% rispetto al plasma Nel liquor lombare l 80% di proteine è di origine plasmatica ed il 20% è prodotto localmente Il liquor ventricolare ha una ridotta concentrazione proteica per ridotto apporto della componente plasmatica La concentrazione liquorale di proteine dipende da: Concentrazione plasmatica Sintesi intratecale Alterazioni del flusso liquorale Stato della barriera ematoencefalica

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7 Liquor: EBM? Numerosi test proposti pratica pochi test nella Molti studi condotti su base retrospettiva e in piccola scala, con popolazioni di pazienti preselezionate Valutazione della sensibilità e specificità problematiche

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9 Esame del Liquor Meningiti e meningoencefaliti: urgente Sclerosi Multipla e enecefalomieliti demielinizzanti Poliradicolonevriti disimmuni Carcinomatosi meningea Malattia di Creutzfeldt- Jacob Interessamento neurologico in malattie infiammatorie /autoimmuni sistemiche Pseudotumor cerebri Emorragia subaracnoidea non definibile tramite TC Blocco del flusso liquorale Malattia di Alzheimer? Oto/rino liquorrea

10 La transferrina beta2 è attualmente considerata il miglior marker per mettere in evidenza la presenza di liquor nelle secrezioni nasali IEF transferrina 1-4 sieri normali 5 siero di paz. con patologia SNC 6 liquor 7 rinorrea di origine liquorale

11 Esame del liquido cerebrospinale PROCEDIMENTI PREANALITICI La puntura lombare è di norma effettuata al mattino, con paziente a digiuno. L effettuazione in orari diversi, per motivi di urgenza o di opportunità, è segnalata sul referto. L utilizzo del campione liquorale (tipologia degli esami richiesti, aliquote conseguenti, modalità di invio a centri esterni e di conservazione per utilizzi differiti etc.) andrebbe concordato preventivamente tra clinico e laboratorista. Il liquor è raccolto in provette sterili in vetro siliconato o polipropilene, evitando quelle in vetro (i monociti vi aderiscono) Sarebbe opportuno che il volume di liquor estratto fosse standardizzato (4-5 ml) e che le aliquote di liquor fossero effettuate da una provetta di raccolta unica: i) Il gradiente di concentrazione causa differenze in contenuto proteico tra il primo millilitro di liquor prelevato e gli ultimi millilitri ii) Aliquotare da un unica provetta minimizza una possibile fonte di errore preanalitico e permette di raccogliere il massimo numero di cellule liquorali (centrifugazione e recupero del pellet da utilizzare per citocentrifuga o camera di sedimentazione) da destinare a scopi diagnostici o di ricerca. Per liquor destinati ad

12 Esame del liquido cerebrospinale PROCEDIMENTI PREANALITICI Un prelievo di sangue deve essere sempre effettuato contestualmente alla puntura lombare. I campioni appaiati di sangue e liquor sono da inviare al più presto in laboratorio. Gli ospedali o enti esterni al laboratorio dovrebbero organizzare l invio dei campioni in tempi brevi, preferibilmente facendo in modo da recapitarli entro due ore dai prelievi, senza congelare. Puntura lombare traumatica e sospetto di emorragia subaracnoidea: i) Si raccomanda la raccolta del liquor in tre provette consecutive. ii) Le determinazioni si effettuano sulla terza, la meno inquinata in caso di puntura traumatica.

13 Esame del liquido cerebrospinale PROCEDIMENTI ANALITICI Valutazione visiva e analisi spettrofotometrica Il campione liquorale deve essere valutato per aspetto e colore prima e dopo centrifugazione: 10 minuti a un numero moderato di giri ( rpm, circa 500 g). Si raccomanda di usare scale qualitative di valutazione per l aspetto e per il colore (ad esempio, limpido, sublimpido, torbido per l aspetto e incolore, xantocromico, eritrocromico per il colore). La spettrofotometria andrebbe effettuata solo nel sospetto di emorragia subaracnoidea. I picchi tipici delle proteine (415 e 460 nm) sono indicativi di danno della barriera emato-liquorale. I picchi dei prodotti di degradazione dell emoglobina (ossi- e meta-hb: 415, 540 e 580 nm, metaboliti precoci che persistono per 4-8 giorni; bilirubina e composti bilirubinici:350, 400 e 460 nm, metaboliti tardivi che persistono per giorni) segnalano un emorragia subaracnoidea recente o pregressa.

14 Esame del liquido cerebrospinale Cellule liquorali La lettura delle cellule liquorali è da effettuare entro due ore dalla puntura lombare. Dal liquor centrifugato si ottiene un pellet cellulare da destinare all eventuale analisi mediante citocentrifuga o camera di sedimentazione. L analisi morfologica di base delle cellule liquorali è effettuata colorando con il May-Grünwald-Giemsa. L analisi morfologica delle cellule liquorali è obbligatoria nel sospetto di carcinomatosi meningea. È inoltre effettuata quando sussista un indicazione clinica Si segnala l opportunità, nel sospetto di criptococcosi cerebrale, di effettuare una semplice colorazione (India ink) in grado di mettere in evidenza il criptococco

15 Le cellule del liquor Le cellule nel liquor sono in un ambiente ostile a causa della bassa concentrazione di proteine che ne altera la stabilità di membrana entro un ora Camera di conta Centrifuga Risospensione del pellet in una goccia di formaldeide 5% Risospensione in siero Citocentrifuga Colorazione (MG-Giemsa)

16 Le cellule del liquor Linfoblasti in meningosi leucemica

17 Esame del liquido cerebrospinale Esame biochimico L esame biochimico si effettua su surnatante di liquor centrifugato Le determinazioni, di norma, sono da effettuate su campioni appaiati di siero e liquor. Analiti di base (glucosio, albumina, IgG). Il glucosio deve essere determinato in campioni appaiati di siero e liquor, esprimendone il rapporto percentuale (glucosioliquor/glucosiosiero x 100; valore di riferimento, > 45%) La determinazione dell albumina nel siero e nel liquor è l indice più accurato del grado di permeabilità della barriera emato-liquorale (danno di barriera) e deve sostituire il solo dosaggio delle proteine totali liquorali. Il danno di barriera è esprimibile sia come rapporto tra albumina nel siero e albumina nel liquor (Albsiero/Albliquor, valore di riferimento, > 130) o come quoziente albumina (Albliquor/Albsiero) x 1000 (valore di riferimento, < 7.0), oppure x 100 (valore di riferimento, < 0.7) La determinazione delle proteine totali liquorali andrebbe ristretta ai casi nei quali l esame biochimico deve essere effettuato in urgenza (sospetto di meningite/meningoencefalite), se non sia possibile determinare l albumina.

18 Quoziente Albumina ETA (anni) Valori Normali Q (alb) 10 3 x < 15 < < < < 8.0 > 61 < 9.0

19 Esame del liquido cerebrospinale Esame biochimico L espressione quantitativa della sintesi intratecale di IgG si ottiene utilizzando funzioni nonlineari, come le formule di Reiber, oppure, numericamente

20 Esame del liquido cerebrospinale Esame biochimico L espressione quantitativa della sintesi intratecale di IgG si ottiene utilizzando funzioni nonlineari, come le formule di Reiber, oppure, numericamente

21 Esame biochimico Esame del liquido cerebrospinale La determinazione liquorale del lattato è utile nel sospetto di meningite/meningoencefalite settica La concentrazione del lattato liquorale è indipendente da quella sierica. La determinazione liquorale di IgA e IgM può essere utile nella diagnosi di neurotubercolosi (IgA) e di neuroborreliosi (IgM), sebbene tali patologie possano essere diagnosticate con test più specifici. La determinazione di anticorpi antigene-specifici nel siero e nel liquor nelle meningoencefaliti virali o in altre patologie infettive del sistema nervoso centrale si effettua valutandone il razionale Altri esami di più stretta pertinenza neurologica (ad esempio: proteina, proteina iperfosforilata, proteina , amiloide 1-42, NSE, asialo-transferrina), necessitano di standardizzazione nel prossimo futuro.

22 Le determinazioni quantitative Sensibilità Specificità cut-off Glicorrachia (% trasferimento siero/liquor) 91% 96% < 40% Lattato (rimane elevato anche dopo terapia antibiotica) 94% 95% > 4.2 mm/l Nel differenziare meningiti settiche dalle asettiche

23 Sierologia liquorale il quoziente anticorpale totale QIgtot = L Ig / S Ig quantità di immunoglobuline liquorali rispetto alle sieriche quoziente anticorpale specifico QIgspec = L AbSpec / S AbSpec quantità di anticorpi liquorali specifici rispetto ai sierici L indice anticorpale specifico IAspec = Q Igspec / Q Igtot (v.n. = 0,5-1,5) attività anticorpale specifica liquorale rispetto alla sierica

24 Parametri liquorali nella sclerosi multipla Nel 1971 Hans Link evidenziò che, nella maggior parte dei casi di pazienti affetti da sclerosi multipla, la zona gamma del tracciato elettroforetico liquorale presentava numerose bande, assenti nel tracciato sierico dello stesso paziente

25 Le linee-guida riguardanti l analisi del liquido cerebrospinale L analisi del liquido cerebrospinale ruota attorno alla diagnosi di sclerosi multipla, malattia che entra in diagnosi differenziale con la maggior parte delle altre malattie neurologiche che richiedono la puntura lombare Bibliografia di riferimento Andersson M, Alvarez-Cermeño J, Bernardi G, et al. Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis: a consensus report. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994;57: Reiber H. External quality assessment in clinical neurochemistry: survey of analysis for cerebrospinal fluid (CSF) proteins based on CSF/serum quotients. Clin Chem 1995;41: Watson MA, Scott MG. Clinical utility of biochemical analysis of cerebrospinal fluid. Clin Chem 1995;41:343-60

26 Le bande oligoclonali liquorali sono presenti sia nella sclerosi multipla sia nelle encefaliti infettive Qual è il valore predittivo positivo per sclerosi multipla delle bande oligoclonali? Laboratorio di profilo neurologico Laboratorio di profilo infettivologico Valore predittivo per sclerosi multipla elevato Valore predittivo per sclerosi multipla quasi nullo Restringere il campo delle possibilità diagnostiche e collocare il paziente in una popolazione nella quale la malattia sospettata è sufficientemente prevalente

27 Le determinazioni qualitative Le bande oligoclonali liquorali sono formate da immunoglobuline, generalmente IgG, che migrano nella regione in elettroforesi o nella regione catodica in isoelettrofocusing Identificano la sintesi immunoglobulinica intratecale con maggiore sensibilità rispetto agli indici calcolati (Link e Reiber): informazione essenziale per confermare o escludere un attivazione immunitaria all interno del SNC La tecnica separativa raccomandata per la determinazione delle bande oligoclonali IgG è l isoelettrofocusing (Consensus europeo, 1994)

28 The Principle of Isoelectric Focusing. A ph gradient is established in a gel before loading the sample. (A) The sample is loaded and voltage is applied. The proteins will migrate to their isoelectric ph, the location at which they have no net charge. (B) The proteins form bands that can be excised and used for further experimentation.

29 Le determinazioni qualitative Metodica di riferimento Isoelettrofocusing siero e liquor in gel di agarosio Passive transfer delle proteine su nitrocellulosa Immunodetezione per IgG Consensus europeo (1994) Affiancare silver staining all immunodetezione per IgG Colorare bande non-igg (catene kappa e lambda, IgA, frammenti di IgM) La procedura non è cost-effective

30 Le determinazioni qualitative Campioni Pareggiare siero e liquor per il contenuto di IgG seminare campioni appaiati di siero e liquor Non è ammessa la concentrazione del liquor bandite le colorazioni poco sensibili, come il Blue Coomassie

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34 Interpretazione: le bande oligoclonali (OCB) nel siero (S) e nel liquor (LCS) si combinano in cinque pattern tipo 1 tipo 2 tipo 3 tipo 4 tipo 5 Distribuzione policlonale delle IgG, assenza di sintesi intratecale OCB solo liquorali, presenza di sintesi intratecale (processi immuno-infiammatori cronici del SNC) OCB solo liquorali + OCB S=LCS, presenza di sintesi intratecale (processi immuno-infiammatori acuti del SNC) OCB S=LCS (mirror pattern), assenza di sintesi intratecale (processi immuno-infiammatori sistemici) OCB S=LCS, spaziat. regolare e intensità decresc. assenza di sintesi intratecale (gammapatie monocl.) S LCS ph (Consensus europeo, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994;57: )

35 Panencefalite totalità sclerosante subacuta Sclerosi multipla quasi totalità M. infettive del SNC molto frequenti * Neurosarcoidosi frequenti Collagenopatie con interessamento SNC abbastanza frequenti Encefalomieliti postinfettive/vacciniche poco frequenti Sd. di Guillain-Barrè poco frequenti M. cerebro-vascolari poco frequenti M. degenerative SNC rare Tumori del SNC rare Le bande oligoclonali nelle malattie neurologiche Dati non univoci in letteratura Studi collaborativi: mettere insieme dati liquorali in numero idoneo Malattie da prioni Altre m. neurologiche Popolazione generale assenti occasionali occasionali * dipende dal momento in cui si effettua la puntura lombare in rapporto alla fase di malattia e dalla natura dell agente patogeno