QUALITA E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI Prof. DANILA MOSCONE Chimica Analitica Dip. di Scienze e Tecnologie Chimiche

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1 QUALITA E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI Prof. DANILA MOSCONE Chimica Analitica Dip. di Scienze e Tecnologie Chimiche 1

2 ALIMENTI Si definiscono alimenti i prodotti commestibili che l uomo deve assumere per assicurare, insieme con la respirazione, il normale svolgimento delle funzioni fisiologiche dell organismo. L assunzione di alimenti risponde ad uno dei bisogni elementari di ogni essere vivente, compreso l uomo. Ai Ai consumatori consumatori devono devono essere essere offerti offerti alimenti alimenti di di ALTA ALTA QUALITA QUALITA e e SICURI. SICURI. La catena di produzione alimentare diviene sempre più complessa ed ogni singolo anello della catena deve essere altrettanto forte per salvaguardare la salute dei consumatori. Ciò indipendentemente se l alimento è prodotto in loco oppure importato da paesi terzi. Il principio guida deve essere: from field to fork 2

3 ALIMENTI Lo studio degli alimenti può essere condotto tenendo presenti quattro aspetti fondamentali: chimico generale (chimica dei principi alimentari: proteine, carboidrati, lipidi, vitamine) analitico (chimica analitica applicata all esame degli alimenti) tecnologico (descrizione dei processi di preparazione, trattamento e conservazione dei prodotti alimentari) chimico-igienico (contaminazione chimica degli alimenti) Non si può contare solo su questi parametri per sapere se un alimento è sicuro e di qualità! Odore Sapore Aspetto 3

4 Cosa significa Alta Qualità dell Alimento? Qualità Nutrizionali Pesticidi Metalli pesanti Micotossine etc + Sicurezza Sicurezza Chimica Sicurezza Microbiologica Stima di malattie di origine alimentare negli Stati Uniti ogni anno 76 milioni di persone si ammalano 5,000 persone muoiono! Sono stati identificati più di 250 tipi diversi di malattie a trasmissione alimentare. 4

5 Anche un piccolo assaggio non ci mette al sicuro. Solo 10 batteri possono causare alcune malattie di origine alimentare! Mal di stomaco Diarrea Febbre OOPS! Disidratazione (a volte severa) 5

6 Condizioni gravi meno comuni, ma possibili Meningite Paralisi Morte Persone con un elevato rischio per malattie a trasmissione alimentare Donne in attesa Bambini ed anziani persone con sistema immunitario indebolito e persone con alcune malattie croniche 6

7 Costo delle malattie a trasmissione alimentare miliardi di $ ciascun anno Costi specifici: Spese mediche Azioni legali Affari persi Cosa proponiamo noi? Nuovi metodi di analisi della qualità e salubrità degli alimenti tramite l utilizzo dibiosensori 7

8 CHE COS E UN BIOSENSORE? Un biosensore è un strumento analitico in cui è presente un elemento biologico strettamente connesso o integrato con un trasduttore di segnale. Che cos è un trasduttore di segnale? Sensore: un dispositivo che converte una forma di energia in un altra altra, cioè che trasforma una grandezza fisica che si vuole misurare in un segnale di natura diversa (tipicamente elettrico) più facilmente misurabile o memorizzabile. sensori di luce (o sensori ottici): fotocellule, tubi fotoelettrici sensori di calore: calorimetri. sensori di radiazione: contatori Geiger. sensori di corrente elettrica: galvanometri, amperometri. Quali sono gli elementi biologici? I più diversi Enzimi Anticorpi DNA Batteri Fettine di tessuto animale o vegetale Analita Componente biologico Trasduttore di segnale Registratore 8

9 Biosensore Cosa hanno in comune? Naso Analita/biorecettore/trasduttore/processore di segnale Piccole molecole/membrana olfattiva/cellule nervose/cervello Occhi Luce Visibile /bastoncelli e coni/ cellule nervose/cervello Analiti piccole molecole glucosio, alcool, CO, CO 2, agenti nervini, urea, pesticidi, aspirina, paracetamolo, penicillina, TNT, colesterolo, amminoacidi bio-macromolecole DNA, RNA, enzimi, proteine, ormoni, virus batteri antrace, E. coli, Salmonella 9

10 Interazioni Biologiche Recettori Biologici Interazioni deboli, non-covalenti Spontanee (self-assembly) Altamente specifiche (differenze anche di un singolo atomo) Complementare (chiave/serratura) Enzima Anticorpo Acido Nucleico Trasduttore di segnale Fibre Ottiche Sempre più usate grazie allo sviluppo di fibre che possono trasportare fotoni a siti remoti. Assorbimento, reflettanza, fluorescenza, scattering, chemiluminescenza, etc. Quantum dots (cristalli semiconduttori di dimensioni nanometriche). Cristalli Piezoelettrici Generano correnti elettriche grazie alla vibrazione di quarzi quando piccole quantità di analiti si legano a recettori biologici immobilizzati. Promettenti per interazioni anticorpo/antigene, DNA 10

11 Misuratore Termico Trasduttore di segnale Formazione/rottura di legami chimici in reazioni enzimatiche che provocano variazioni di entalpia. Inoltre, variazioni di calore di soluzione specialmente con formazione di specie cariche (p. es. protoni). Tipicamente possono essere misurate millesimi di K di variazione di temperatura. Sensori elettrochimici (elettrodi) Amperometrico: Il più comunemente usato in reazioni enzimatiche che implicano ossidasi e riduttasi. Glucosio ossidasi, Colesterolo ossidasi, etc. Potenziometrico: reazioni che implicano variazioni significative di ph Es. penicillinasi, ureasi. Esempi di biosensori Strumento per la misura del Glucosio nel sangue (per pazienti diabetici) 11

12 Il Padre dei Biosensori Enzima Glucosio Ossidasi. + Trasduttore elettrochimico Professor Leland C Clark Jnr ELETTRODO + ENZIMA = biosensore CAMPIONE STRUMENTO 12

13 Glucosio Acido Gluconico Glucosio Ossidasi Ossigeno Acqua ossigenata Elettrodi Stampati 1 cm Produzione di massa Basso costo Monouso Piccoli volumi di campione 13

14 14

15 ELETTRODI STAMPATI ELETTRODO + ENZIMA 15

16 Potentiostato - Galvanostato PG580 Uniscan Instruments 16

17 Esempi di biosensori Biosensore per CO dei vecchi minatori di carbone test di gravidanza Misura l ormone hcg nelle urine. ANTRACE BIACORE Applicazioni in analisi degli alimenti: Composizione Carboidrati, vitamine, acidi organici, Pesticidi, antibiotici, tossine, ormoni Analisi Sensoriale Freschezza dei pesci Maturazione del formaggio Controllo del confezionamento Controllo della cottura Determinazione dei Patogeni Salmonella spp. Clostridium botulinum E. coli 17

18 ANALIZZATORE BIOCHIMICO YSI 2700 SELECT CARATTERISTICHE TECNICHE : Ammontare di campione : da 5 a 65 microlitri. Tempo di Risposta: circa 90 secondi APPLICAZIONI Destrosio Saccarosio Destrosio in patate Destrosio e Saccarosio in latte concentrato Lattate nella carne Etanolo in birra e vini Lattosio in formaggi Glutammati in brodi Colina in mangimi Destrosio e Saccarosio in gelati 18

19 SENZYTEC 1 è un analizzatore in grado di determinare diversi analiti negli alimenti, come zuccheri, acidi, etanolo; è sufficiente scegliere l appropriato sensore usa e getta, inserirlo nella sonda ed aggiungere poche gocce di campione per una rapida misura ANALISI DEL VINO ANALISI DELLA FRUTTA Glucosio Zuccheri (glucosio + fruttosio) Etanolo L-Malico L-Lattico D-Lattico Fruttosio Saccarosio Polifenoli Glucosio Zuccheri (Glucosio + Fruttosio) Etanolo 19

20 Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pesca Indicatore di freschezza: la degradazione dei nucleotidi, nel muscolo di pesce Dopo la morte del pesce: ATP ADP AMP IMP HXR HX X U DEGRADAZIONE dove ATP, ADP, AMP = adenosina trifosfato, adenosina difosfato, adenosina monofosfato IMP, HXR = inosina monofosfato,, inosina HX, X, U = ipoxantina, xantina, acido urico 20

21 Poiché l'atp, ADP ed AMP scompaiono circa 24 ore dopo la morte, per potere valutare la freschezza del pesce, è stato introdotto un parametro K 1 basato sulla degradazione dei rimanenti composti, che può essere definito come segue: K 1 = (HXR + HX) / (IMP + HXR + HX) * 100 All aumentare del K 1 diminuisce il grado di freschezza del pesce: K 1 < 20 è molto fresco, 20 < K 1 < 40 deve essere cucinato, K 1 > 40 non è l alimentazione umana. consigliabile per Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pesca E' quindi possibile stimare la freschezza del pesce misurando soltanto tre dei sei metaboliti. Le reazioni enzimatiche coinvolte nella degradazione dell'imp ad acido urico sono le seguenti: IMP -- NT > HXR + Pi HXR + Pi -- NP ---> > HX + ribosio-1-fosfato HX + 2O 2 -- XO ---> > UA + 2H 2 O 2 Dove NT, NP, XO e Pi rappresentano rispettivamente la 5 -nucleotidasi, la nucleoside fosforilasi, la xantina ossidasi ed il fosfato. 21

22 Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pesca Trote iridee conservate in differenti condizioni di temperatura: T = ambiente, 4 o C, 4 o C con ghiaccio -20 o C per 1 mese, poi scongelate e mantenute a 4 o C -80 o C per 3 mesi, poi scongelate e mantenute a 4 o C Punti K% giorni 18 C 4 C 4 C con ghiaccio Scong. dopo 30d a -20 C Scong. dopo 90d a -80 C A T ambiente la conducibilità elettrica scende al di sotto di 10 già al primo giorno A 4 o C la conducibilità elettrica scende al di sotto di 10 dopo il terzo giorno A 4 o C con ghiaccio la conducibilità elettrica scende al di sotto di 10 dopo il 5 giorno Per i pesci congelati non si è osservata conducibilità elettrica Monitoraggio della fermentazione alcolica in relazione a diverse tecniche di vinificazione in rosso 22

23 Solopaca (BN) 650 Q di Aglianico fermentato in un fermentore verticale volume 800 Hl SO 2 5 g/hl yeast S.cerevisiae 20 g/hl T C Di Majo Norante (CB) 400 Q di Montepulciano d Abruzzo in fermentore verticale termocondizionato volume 270 Hl SO2 4 g/hl yeast S.cerevisiae 20 g/hl T C Torrevento (BA) 140 Q di uve Montepulciano e Troia in botti d acciaio rotanti volume 300 e 150 Hl SO 2 5 g/hl yeast S.cerevisiae 25g/Hl T C MONITORAGGIO DI METABOLITI DETERMINANTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA Applicazione in enopolio di biosensori elettrochimici (FIA) per il dosaggio di glucosio, fruttosio, glicerolo ed etanolo durante la fermentazione alcolica al fine di controllarne il decorso ed eventuali anomalie. Glucosio + O 2 GOD acido gluconico +H 2 O 2 Fruttosio + 2 PMS + FDH chetofruttosio + 2 PMSH PMSH----->2 PMS + + 2e Etanolo + O 2 AO acetaldeide +H 2 O 2 Glicerolo + ATP (Mg 2+ ) GK glicerolo-3-p + ADP Glicerolo-3-p +O 2 + H 2 O GPO glicerone-3-p+h 2 O 2 23

24 Azienda viti-vinicola Di Majo Norante(CB) 400 Q.li di uve Montepulciano d Abruzzo divise in due partite da 200 Q.li e vinificate in fermentatori verticali termocondizionati: capacità 270 Hl cicli di innaffiatura a pioggia del cappello 3 /4h SO 2 4 g/hl lieviti S.cerevisiae 20 g/hl temperatura C g/l Tesi triplice delestage Delestage Delestage Delestage glucosio fruttosio etanolo Tesi duplice delestage Svinatura % vol La fermentazione alcolica termina prima nella tesi triplice delestage (65 ore) rispetto alla tesi duplice delestage (75 ore) e presenta una fase lag minore g/l glucosio fruttosio etanolo Delestage Delestage Svinatura Tempo (ore) % vol Il delestage aggiuntivo a 20 ore dall inizio ha favorito la crescita dei lieviti incrementando la velocità di fermentazione 24

25 Tesi rimontaggi (ogni 2 ore) g/l Svinatura glucosio fruttosio etanolo % vol Tempo (ore) Fase lag breve (rapido adattamento dei lieviti al mezzo) e difficoltà a consumare completamente il fruttosio 0 L elevata temperatura raggiunta (38 C), in sinergia con l effetto tossico dell etanolo, può aver modificato, nei lieviti, la funzionalità dei sistemi di trasporto di membrana degli zuccheri g/l g/l Di Majo N.-Tesi duplice delestage Glicerolo Delastage Etanolo Delastage Torrevento-Tesi unico delestage Glicerolo Etanolo Tempo (ore) Delestage Svinatura % vol %vol Rapido incremento della concentrazione di glicerolo ed etanolo e della velocità di fermentazione subito dopo l operazione di svuotamento Il fenomeno è attribuito all accumulo dei due alcoli nella cellula durante la fase di stress anaerobico ed al loro rilascio nel mezzo in seguito alla ripresa della funzionalità della membrana dovuta alla ossigenazione spinta 25

26 Cosa significa Alta Qualità dell Alimento? Qualità Nutrizionali Pesticidi Metalli pesanti Micotossine etc + Sicurezza Sicurezza Chimica Sicurezza Microbiologica Pesticidi derrate alimentari acqua Concentrazioni ammissibili in (µg/l) delle sostanze tossiche nelle acque di uso potabile Parametro Concentrazione massima ammissibile Antiparassitari 0.1 per componenti totali 0.5 Idrocarburi policiclici aromatici 0.2 Cianuri 50 Arsenico 10 Cadmio 5 Mercurio 1 Piombo 50 26

27 PESTICIDI ORGANOFOSFATI CARBAMMATI TRASMISSIONE DELL IMPULSO NERVOSO 27

28 Biosensore: BIOSENSORE PER LA MISURA DI PESTICIDI -enzima Acetilcolinesterasi SPE AChE Acetiltiocolina + H 2 O Tiocolina + acido acetico elettroattiva MISURA 3 Steps Step 1: misura dell attività enzimatica iniziale (i 0 ) Step 2: inibizione Step 3: misura dell attività enzimatica residua (i i ) Step 1 Tampone + substrato misura dell attività enzimatica prima dell esposizione al pesticida (i 0 ) 28

29 Step 2 tempo di incubazione lavaggio Soluzione con Pesticida Step 3 Tampone + substrato I%=[( i 0 -i i )/i 0 ] 100 misura dell attività enzimatica dopo dell esposizione al pesticida (i i ) STUDIO DEL DESTINO DEI PESTICIDI DURANTE LA FERMENTAZIONE ALCOLICA Paraoxon Aldicarb 29

30 Determinazione del Piombo nel latte Massimo livello ammissibile Acqua potabile 10 µg/l Aria 0.5 µg/m 3 Alimenti 0,02-1 mg/kg Latte = 0.02 mg/kg (Dir. 92/46/CEE) 30

31 Il Piombo si misura.. ASSORBIMENTO ATOMICO ICP-MS Strumento Elettrochimico SPE Sensor 31

32 Analisi di Stripping 1 STEP di PRE-CONCENTRAZIONE Il Pb 2+ è ridotto a Pb e accumulato sulla superficie del sensore su cui è stato depositato un film di bismuto 2 STEP di STRIPPING Il Pb viene ridisciolto riossidandolo e si osserva un picco la cui altezza è proporzionale alla concentrazione del Pb nel latte Current ,0-0,8-0,6-0,4 Potential (V) METODO UFFICIALE AOAC DI TRATTAMENTO DEL LATTE ❶ Seccare i campioni per tutta la notte a 120 C ❷ Collocare il campione in forno a 250 C ed aumentare lentamente la temperatura a 350 C fino a quando cessano i fumi prodotti ❸ Aumentare la temperatura lentamente a 500 C Lasciar incenerire per tutta la notte a 500 C ❹ Se la cenere è grigia invece che bianca: HNO h di forno PROBLEMI: METODO LUNGO E TEMPERATURE MOLTO ALTE 32

33 Trattamento del LATTE Precipitazione delle Proteine Acidi latte 1. Addizione di H 2 O 2 e Sonicazione per 30 min 2. Addizione di HClO 4 e Sonicazione per 15 min 3. Addizione di HCl e Centrifugazione a 48000g per 10 min 4. Filtrazione del supernatante 5. Diluzione 1:4 6. Filtrato a ph 2 TEMPO TOTALE = 1 h Sviluppo di un programma ad hoc 33

34 Procedura di misura 20 ppb 10 ppb milk 20 ppb 10 ppb milk S REAZIONE ENZIMATICA P SEGNALE ELETTROCHIMICO Y Y Y Y Y Y 34

35 TRICOTECENI TIPO-A ED AFLATOSSINA B 1 Tricotecene di tipo-a TDI*: 0.06 µg/kg: T-2 + HT-2 Fusarium T-2 2 HT-2 Livello Massimo Circa 200 ppb ppb (baby food) * t-tdi: Temporary-Tolerable Daily Intake Aflatossina B 1 O O Livello Massimo O 2 ppb Maize, cereal, etc. O O OMe 5 ppb Unprocessed food Aspergillus AFB 1 MISURA AFLATOSSINA B 1 Trattamento del campione 25.0 g di grano macinato g di NaCl 500 µl di AFB 1 o PBS Estrazione per 3 min ad alta velocità di agitazione con 50 ml di metanolo/acqua (80/20) Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min Current (µa) EC 50 = 1.2 ng/ml LOD = 0.2 ng/ml WR = ng/ml Diluzione 1:5 v/v in PBS 1 Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min Misura elettrochimica TEMPO TOTALE DI ANALISI (incluso trattamento) MENO di 25 min!!! AFB 1 (ng ml -1 ) curva standard in PBS Misura AFB 1 nel solvente di estrazione AFB 1 in estratti di grano 35

36 Analisi di BATTERI PATOGENI negli alimenti Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and E. coli sono considerati la maggior causa di tossinfezioni alimentari nei paesi industrializzati. I metodi colturali standard richiedono fino a 5-6 giorni per dare un risultato. Metodo colturale standard per la Salmonella (ISO 6579:2002) Pre-arricchimento per permettere la riattivazione e la multiplicazione delle cellule danneggiate; Arricchimento Selettivo per aumentare il rapporto tra il batterio in esame e i microrganismi competitori; Isolamento su agar selettivo delle colonie caratteristiche; Conferma tramite tests biochimici e sierologici. Tempo: fino a 5 giorni Il nostro obiettivo è stato lo sviluppo di immunosistemi elettrochimici semplici e rapidi per la misura specifica della Salmonella. Secondo la legislazione Europea, la Salmonella deve essere assente in 25g di prodotto alimentare. 36

37 Immunosensore Elettrochemico Principio di misura MISURA HRP PAB salmonella MAb - anti-mouse IgG IMB Elettrodo Screen Printed magnete CURVA DI CALIBRAZIONE USANDO LE MBs Salmonella 2 0 Corrente (µa) e e e e e e e + 9 S. E n te ritid is LOD = 3 x 10 3 CFU/ml 37

38 CAMPIONI SPERIMENTALMENTE CONTAMINATI 18 PORK 20 CHICKEN Current (µa) Current (µa) Pre-enrichment Time (h) BEEF Pre-enrichment Time (h) 25 TURKEY Current (µa) Current (µa) Pre-enrichment Time (h) Pre-enrichment Time (h) Campioni sperimentalmente contaminati (1-10 cell/25g) Campioni non-contaminati (negativi al test microbiologico) Il tempo minimo di pre-arricchimento è risultato variabile, probabilmente a causa della presenza di microrganismi competitori naturalmente contenuti nei campioni di carne. Tuttavia un massimo di 6h di pre-arricchimento è stato sufficiente per rivelare la presenza di salmonella in tutti i casi. Analisi dei campioni di carne non sperimentalmente contaminati con metodo elettrochimico, PCR e metodo colturale classico Samples ELIME PCR Cultural Method pork Agglutination method pork pork S. infantis turkey chicken chicken S. Enteritidis chicken beef beef beef S. Anatum 10 campioni di carne non sperimentalmente contaminati sono stati analizzati e solo tre di questi campioni sono risultati positivi per Salmonella con il metodo classico culturale, la PCR (dopo 5 ore di pre-arricchimento) ed il metodo elettrochimico (dopo 6 ore di pre-arricchimento). 38

39 B.E.A.T. BioElettroAnalitica Tor Vergata Prof. G. Palleschi Prof. D. Moscone Dr G. Volpe Dr L. Micheli Dr F. Ricci Dr F. Arduini Dr F. Valentini Dr S. Piermarini Visiting Prof. A.Amine Il gruppo: gli studenti in tesi Dr J. Calvo Quintana Dr D. Neagu Dr V. Biagiotti Dr D. Romanazzo Dr G. Adornetto Dr F. Caprio Dr F. Dell Unto Dr A. De Stefano Dr D. Migliorelli Dr A. Porchetta Dr U. Sozzo 39