RILEVAMENTO DI OGM NON AUTORIZZATI ED AGGIORNAMENTO DELLE ATTIVITA DEL CROGM

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1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana 3 WORKSHOP DEI LABORATORI DEL CONTROLLO UFFICIALE DI OGM Roma Novembre 2011 DANIELA VERGINELLI RILEVAMENTO DI OGM NON AUTORIZZATI ED AGGIORNAMENTO DELLE ATTIVITA DEL CROGM Centro di Referenza Nazionale per la ricerca di OGM Laboratorio Nazionale di Riferimento per gli alimenti e mangimi GM

2 Argomenti trattati OGM NEL MONDO OGM AUTORIZZATI OGM NON AUTORIZZATI DIFFICOLTA DI RILEVAZIONE OGM NON AUTORIZZATI RASFF SISTEMI DI RILEVAZIONE OGM NON AUTORIZZATI CROGM E GLI OGM NON AUTORIZZATI

3 OGM nel mondo Negli ultimi 10 anni le piante GM sono aumentate in media del 10% Ad oggi sono state approvati 195 eventi nel mondo (fonte ISAA) Attualmente 90 nuovi eventi sono in stati avanzati di sviluppo, autorizzazione ed in via di commercializzazione (

4 OGM autorizzati Le procedure di immissione di OGM sul mercato differiscono da Paese a Paese Questo comporta anche differenze nel tempo necessario per la procedura di autorizzazione

5 Autorizzazione asincrona Potremmo avere un evento GM autorizzato in un Paese mentre in un altro potrebbe non essere ancora autorizzato Oppure potrebbe essere autorizzato per un uso limitato in un Paese mentre in un altro potrebbe essere autorizzato per altri usi

6 OGM non autorizzati (UGM) Nessuna soglia di tolleranza Gli UGM nell ambiente od in commercio possono avere due differenti origini: Un OGM autorizzato in un Paese per motivi commerciali può trovarsi in un Paese con un diverso stato di autorizzazione o essere autorizzato per usi diversi Immesso sul mercato senza essere stato autorizzato in nessun Paese

7 UGM: Reg.. 619/2011 (del 24/06/2011) Limite tecnico allo 0,1% Autorizzazione in corso o scaduta Si applica ad alimenti destinati agli animali Definisce metodi di campionamento ed analisi se X%-U > LMRR (0,1%) notifica immediata al RASFF

8 Eventi ricadenti nell ambito del Reg.619/2011 (Da DG SANCO GM FOOD AND FEED yna/gm_register/index_en.cfm) Name of the product LL RICE62 Bayer CropScience / Cotton Dow Agro Sciences Unique identifier ACS-OSØØ2-5 DAS x DAS-21Ø23-5 EFSA Application Number EFSA-GMO-UK EFSA-GMO-NL Date of valid EFSA application or opinion published EFSA Opinion Published 30/11/2007 EFSA Opinion Published 15/06/2010 Date EURL method published Certified Ref. Material 09/06/2006 AOCS 21/04/2006 IRMM 3272 maize Syngenta SYN-E EFSA-GMO-UK Valid EFSA application 6/07/ /11/2008 IRMM soybean Optimum GAT soybean Pioneer DP EFSA-GMO-UK ESA Opinion published 26/07/ /02/2009 IRMM soybean High Oleic soybean GM- FAD2-1 Pioneer DP EFSA-GMO-NL Valid EFSA application 22/10/ /02/2009 IRMM A soybean Bayer ACS-GM006-4 EFSA-GMO-NL EFSA Opinion published 10/05/ /01/2009 AOCS maize GAT maize Pioneer DP EFSA-GMO-UK Valid EFSA application 12/11/ /01/2009 IRMM MIR162 maize Syngenta SYN-IR162-4 EFSA-GMO-DE Valid EFSA application 24/08/ /03/2011 AOCS MON87701 soybean Monsanto MON-877Ø1-2 EFSA-GMO-BE EFSA Opinion published 26/07/ /07/2011 AOCS

9 Impatto sul mercato europeo Il numero sempre maggiore di nuovi semi GM intensificherà gli effetti dell autorizzazione asincrona (nel 2015 supereranno i 120 eventi!) Quindi in futuro il numero di eventi non approvati diventerà molto alto Avremo un numero elevato di respingimenti di semi con eventi non autorizzati rilevati a bassa concentrazione (LLP=low level presence) Impatto negativo sul commercio internazionale (Newsrelease JRC Bruxelles 3 September 2009)

10 Storia degli UGM in alimenti e mangimi UGM Mais Starlink (Ott. 2000) AS INCIDENTI Autorizzato per uso mangimistico trovato negli alimenti AS= Autoriz. asincrona NA=Non autoriz. (Ruttink et al., Anal. Bioanal.Chem Mar;396(6): ) Papaya GM (Feb.2004) AS Mais Bt10 (Mar. 2005) NA Patata GM (Dic.2005) NA Riso Bt63 (Ag. 2006) NA Mais ev. 32 (Feb.2007) NA Riso LL62 (Mag.2007) AS Soia A (Ag. 2007) AS Importata dagli USA trovata in Germania priva di autoriz. Syngenta vendeva in USA Bt10 al posto del Bt11 (autoriz.). Trovato in Giappone ed in Europa Trovata in Polonia proveniente dagli USA, priva di autoriz. Trovato in Germania proveniente dalla Cina, privo di autorizzazione Dow Agroscience ha volontariamente ritirato alcuni ibridi contenenti l evento Trovato in EU proveniente dagli USA, privo di autoriz. Trovata in Austria proveniente dagli USA, priva di autoriz. Lino FP967 (Sett.2007) NA Riso Kefeng6 KMD1 (2011) NA Autorizzato in USA e Canada, trovato in EU Trovati in vari paesi Europei provenienti dalla Cina, privi di autorizzazione

11 Quali eventi non autorizzati abbiamo trovato? La maggior parte degli UGM sono eventi autorizzati in una giurisdizione o per un tipo di uso (mais Starlink, MIR604, DAS59122, MON810; papaya 55 1 /63 1; soia A ) Solo alcuni sono privi di autorizzazione (mais 32 sister, mais Bt10, riso LL601, riso Bt63, Kefeng6, KMD1)

12 RASFF: RAPID ALERT SYSTEM FOR FOOD AND FEED Il sistema di allerta rapido (Reg. 178/2002) Il RASFF è il sistema di allerta rapido europeo che raccoglie, settimanalmente, le notifiche, presentate dagli Stati membri, dei casi non conformi dal punto di vista della sicurezza alimentare.

13 RASFF Si distinguono due tipi di notifiche: 1. Notifiche di allerta che riguardano prodotti che presentato un rischio serio e per i quali è richiesta un azione immediata (es. ritiro/respingimento) 2. Notifiche di informazione che riguardano prodotti che presentano un rischio, ma per i quali non è necessaria un azione immediata da parte degli altri membri del network

14 RASFF Portal INSERIRE PAG RASF

15 Difficoltà di rilevazione degli UGM Mancanza di notizie riguardanti l evento Mancanza di materiale di riferimento Assenza di metodi per la rilevazione Scarsa armonizzazione

16 La rilevazione degli UGM APPROCCIO INDIRETTO: Si basano su sistemi di screening di routine ricercando elementi in comune con gli autorizzati (P35S, TNOS, PAT, BAR ) che necessitano di ulteriori analisi evento specifiche che escludano la presenza degli eventi autorizzati

17 Approccio matrice Si intende l applicazione della combinazione di vari metodi di screening e la verifica dei risultati ottenuti con i dati tabulati per la presenza/assenza di singoli eventi autorizzati. Nel caso in cui i risultati non concordino con i dati tabulati, si può ipotizzare la presenza di eventi non autorizzati (A. Holst-Jensen Biotecnology Advances 27 (2009) )

18 Un esempio di approccio matrice (1) (A. Holst-Jensen Biotecnology Advances 27 (2009) )

19 Un esempio di approccio matrice (1) (A. Holst-Jensen Biotecnology Advances 27 (2009) )

20 Un esempio di approccio matrice (2) A=Autorizzato P=Autoriz in corso wp=segnale debole S=teorico R=Mater. di riferimento (Waiblinger et al., Anal Bioanal Chem 396(6): )

21 Approccio matrice CROGM (1) SPECIE Eventi P35S F3 NOS NPTII PAT CP4- EPSPS CTP- CP4EPSP S BAR P-UBI CRYA 1Ac CRYA 1Ab NA NA (reg. 619/2011) M a i s S o i a BT BT BT DAS DAS GA MIR MON MON M863xM MON MON NK T MIR LY DAS A A DP DP MON MON MON

22 Approccio matrice CROGM (2) *Wang at., Eur Food Res Technol (2011) 232: *Reiting at., Journal of Consumer Protection and Food Safety vol n SPECIE Eventi P35S F3 NOS NPTII PAT C o t o n e R i s o C o l z a CP4- EPSPS CTP- CP4EPS PS BAR P-UBI CRYA1A c CRYA1A b 3006x GHB LL MON MON MON MON LLrice LLrice Bt63* Kefeng6* KMD1* GT MS RF T Rf Rf Ms TOPAS 19/2 (HCN10, HCN92) Patata EH Barbab. H

23 Errori possibili: ERRORE DI TIPO I: FALSI POSITIVI IMPURITA BOTANICHE ORGANISMO DONATORE (virus, batteri ) ERRORE DI TIPO II: FALSI NEGATIVI Elemento in comune con eventi autorizzati Elemento con risposta diversa nei vari OGM (es. cryiab per Bt176, Mon810 e Bt11) Evento sconosciuto Da: Overview on the detection, interpretation and reporting on the presence of unauthorised genetically modified materials EUROPEAN COMMISSION JOINT RESEARCH CENTRE 1/09/2011

24 Da: Overview on the detection, interpretation and reporting on the presence of unauthorised genetically modified materials EUROPEAN COMMISSION JOINT RESEARCH CENTRE 1/09/2011 Albero decisionale

25 Limiti dell approccio matrice L evento sconosciuto deve contenere almeno un elemento di screening L evento sconosciuto può rimanere nascosto da quelli autorizzati se possono spiegare i risultati dello screening I risultati ottenuti potrebbero indicare la presenza multipla di più eventi autorizzati nel campione Può fornire risultati di difficile interpretazione se l evento è presente a bassi livelli Non permette l evidenza finale della presenza di eventi non autorizzati/autorizzati Necessità di identificare e quantificare l evento

26 Sistemi di rilevazione OGM non autorizzati APPROCCIO DIRETTO: Metodi evento/costrutto specifici (riso Kefeng6, riso KMD1, riso BT63, riso LL601, mais BT10) SONO MOLTO LIMITATI

27 Strategie per ovviare i limiti approccio matrice: PCR QUANTITATIVE DIFFERENZIALI Si paragona il numero delle molecole rilevate di un elemento di screening al numero di copie genomiche misurate per gli eventi autorizzati rilevati che lo contengono (determinati mediante PCR evento-specifica) Una differenza significativa potrebbe indicare un evento sconosciuto Approccio utile per trovare eventi sconosciuti mascherati da quelli autorizzati (Cankar, K., et al., (2008). Anal. Biochem.376 (2): )

28 Strategie per ovviare i limiti approccio matrice: Anchor PCR Analisi di screening (P35S, TNOS) Amplificazione di sequenze che fiancheggiano P35S e TNOS mediante una prima Anchor PCR Tre PCR successive ognuna marcata con una sonda fluorescente diversa Successivo sequenziamento dei tre ampliconi Caratterizzazione mediante elettroforesi capillare Comparazione dei profili trovati con una collezione di eventi noti (Ruttink et al., Anal Bioanal Chem 2010 Mar;396(6): )

29 Fluorescent Anchor PCR

30 Alternative possibili Analisi dei microarray Sequenziamento del DNA

31 Analisi dei microarray ad alta densità (1) Vengono scaricate le sequenze dei vettori più comunemente usati negli OGM (es. con P35S, NPTII, TNOS ) Le sonde sono disegnate contenenti le sequenze complementari a quelle individuate Il DNA genomico totale dopo essere stato marcato viene messo a contatto con i microarray (amplificazione non selettiva) Analisi bioinformatica per identificare i positivi

32 Microarray a DNA o DNA chip

33 Analisi dei microarray ad alta densità (2) I positivi vengono identificati in 3 step successivi: 1.Si selezionano le sonde con il segnale più alto (probabili positivi) 2.Si selezionano finestre contenenti più sonde positive (veri positivi) 3.Conferma delle finestre mediante PCR o sequenziamento (Tengs et al., (2007) BMC Biotechnology 7: 91)

34 Sequenziamento del DNA e Sottrazione computazionale Si isola mrna da un campione, si converte in cdna mediante trascrizione inversa Si sequenzia il cdna Si sottrae la sequenza ottenuta da tutte le sequenze conosciute (o da una libreria di cdna non GM o da un database di sequenze non GM) Si lascia una piccola collezione di sequenze che non appartengono all organismo Eventualmente si conferma mediante PCR e sequenziamento (Tengs et al., (2009) BMC Biotechnology 9: 87)

35 Il nostro lavoro

36 RILEVAZIONE RISO LL601/LL62 Estrazione con metodica del CTAB precipitante Monitor Phospholipase D (PLD) Screening P35S::bar (dopo eventuale P35S; TNOS) PCR real time qualitativa LL601 PCR real time qualitativa LL62 (

37 RILEVAZIONE RISO Bt63 Estrazione con metodica del CTAB precipitante Monitor Phospholipase D (PLD) Screening P35S; TNOS PCR real time qualitativa costrutto-specifica Bt63 (modificato rispetto al metodo originale) (Maede et al., Eur Food Res Technol. 224; ) (

38 RILEVAZIONE RISO KEFENG6/KMD1 Estrazione con metodica del CTAB precipitante Monitor Phospholipase D (PLD) Screening P35S::BAR; (P35S; TNOS;NPTII); PUBI-CRY; PCR real time qualitativa evento-specifica Kefeng6 (Per evento KMD1 non abbiamo mat. Riferimento) (Event-specific qualitative and quantitative detection of transgenic rice Kefeng-6 by characterization of the transgene flanking sequence. Wang et al., Eur Food Res Technol (2011) 232: ) (Development of an event-speciwc Real-time PCR detection method for the transgenic Bt rice line KMD1 Babekova et al., Eur Food Res Technol 2008)

39 RILEVAZIONE LINO FP967 Estrazione con Fast ID Genomic DNA Extraction Kit Monitor Stearoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase 2 (SAD) PCR real time qualitativa TNOS costrutto specifica per il lino FP967 (

40 RILEVAZIONE MAIS LY018, DAS (E32) Estrazione con metodica del CTAB precipitante Monitor High Mobility Group (HMG) Screening P35S; TNOS; PAT; (CP4-EPSPS; CTP-CP4EPSPS) Tipizzazione in PCR Real Time evento specifiche (

41 CROGM: le nostre procedure (1) SCHEMA DI ACCREDITAMENTO FLESSIBILE! POS VIR 031 INT REV.3 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: MONITOR PCR POS VIR 032 INT REV.1 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: SCREENING POS VIR 033 INT REV.2 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE MAIS POS VIR 034 INT REV.2 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE SOIA POS VIR 035 INT REV.2 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE COTONE POS VIR 036 INT REV.1 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE COLZA POS VIR 037 INT rev.1 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE BARBABIETOLA DA ZUCCHERO

42 CROGM: le nostre procedure (2) SCHEMA DI ACCREDITAMENTO FLESSIBILE! POS VIR 040 INT rev.0 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: QUANTIFICAZIONE MAIS POS VIR 041 INT rev.0 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE RISO POS VIR 042 INT rev.0 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: TIPIZZAZIONE PATATA POS VIR 061 INT rev.6 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI: QUANTIFICAZIONE SOIA PG VIR 001 rev.9 RICEVIMENTO, ANALISI, CONSERVAZIONE E SMALTIMENTO DI CAMPIONI UFFICIALI PRELEVATI PER LA RICERCA DI ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM) PG VIR 007 rev.1 VALIDAZIONE E VERIFICA DI METODI PCR PER LA RICERCA QUALITATIVA E QUANTITATIVA DI ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM)

43 RIEPILOGO POS CROGM PROVE TOTALI PROVA PCR specie-specifica (7 AC + 1 in AC) 8 target PCR di screening (6 AC + 2 in AC) 8 TIPIZZAZIONE mais GM (12 AC + 5 in AC) TIPIZZAZIONE soia GM (3 AC + 4 in AC) 7 TIPIZZAZIONE colza GM (4 AC) 4 TIPIZZAZIONE cotone GM (4 AC + 1 in AC) 5 TIPIZZAZIONE barbabietola da zucc. GM (1 AC) 1 PCR QUANTITATIVA mais GM (11 AC+ 1 in AC) 12 PCR QUANTITATIVA soia GM (1 AC + 2 in AC) 3 PCR QUANTITATIVA colza GM (4 non AC) 4 PCR QUANTITATIVA cotone GM (4 non AC) 4 PCR QUANTITATIVA barbab. zucc. GM (1 non AC) 1

44 CONCLUSIONI Gli OGM sono sempre più numerosi sul mercato, con un numero sempre maggiore di eventi sconosciuti o parzialmente conosciuti Gli scambi commerciali tra paesi con iter legislativi diversi fa aumentare la presenza di UGM Si dovrebbe incrementare la ricerca degli UGM Le analisi attuali sono spesso troppo costose e talvolta poco specifiche (approccio matrice) E necessario lo sviluppo di nuove tecniche analitiche più efficienti (microarrays, sequenziamento, sensori elettrochimici, spettrometria di massa) E necessario un armonizzazione dei metodi e un maggiore scambio di informazioni.per diminuire le conseguenze negative sul mercato internazionale

45 Bibliografia (1) Cankar, K., et al., (2008). Detection of nonauthorizedgenetically modified organisms using differential quantitative polymerase chain reaction: application to 35S in maize. Anal. Biochem.376 (2): ; Holst Jensen A. Biotecnol Adv. (2009) Testing for genetically modified organisms (GMOs): Past, present and future perspectives. Nov Dec;27(6): Kleter et al., (2009) Identification of potentially emerging food safety issues by analysis of reports published by the European Community's Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) during a four year period May; 47(5): Grohmann et al., (2011) Collaborative trial validation of aconstruct specific realtime PCR method for detection of genetically modified linseed event CDC Triffid FP967. vol. 232, no3, pp Maede et al., (2006) Detection of genetically modified rice: aconstruct specific real time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice. Eur. Food Res. Technol., 224, Newsrelease JRC Bruxelles 3 September 2009 Reiting R., Grohmann L., Dietrich Maede D. (2010) Journal of Consumer Protection and Food Safety Vol.5 N 2, , Testing cascade for the detection of genetically modified rice by real time PCR in food and its application for detection of an unauthorized rice line similar to KeFeng6 Ruttink et al., (2010) Molecular toolbox for the identification of unknown genetically modified organisms. Anal Bioanal Chem 396(6): Ruttink et al., (2010) Knowledge technology based discovery of unauthorized genetically modified organisms. Anal Bioanal Chem 396(6):1951 9

46 Bibliografia (2) Tengs et al., (2007) Microarray based method for detection of unknown genetic modifications. BMC Biotechnology 7:91 Tengs et al., (2009) Characterization of unknown genetic modifications using high throughput sequencing and computational subtraction BMC Biotechnology9:87 Tengs et al., (2010) Non prejudiced detection and characterization of genetic modifications. Food Anal. Methods 3: Waiblinger HU et al., (2010) Anal Bioanal Chem A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants. 396(6): Wang et al., (2011) Eur Food Res Technol Event specific qualitative and quantitative detection of transgenic rice Kefeng 6 by characterization of the transgene flanking sequence. 232: ; crl.jrc.ec.europa.eu/doc/flax CDCTriffidFlaxJRC pdf crl.jrc.ec.europa.eu/bt63update.htm crl.jrc.ec.europa.eu/llrice601update.htm crl.jrc.ec.europa.eu/e32update.htm crl.jrc.ec.europa.eu/bt10update.htm crl.jrc.ec.europa.eu/doc/ %20ENGL%20UGM%20WG%20Final.pdf

47 Grazie per l attenzione! l RINGRAZIAMENTI Cinzia Quarchioni Cristiana Fusco Cristian Alimonti Marisa Misto Pamela Bonini Stefania Peddis daniela.verginelli@izslt.it