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1 170 GIMMOC Vol. VIII N 3, 2004 Giornale Italiano di Microbiologia Medica Odontoiatrica e Clinica Vol. VIII, N 3, 2004 p Organo ufficiale della S.I.M.M.O.C. Copyright 2004 Analisi di caratteri di patogenicità e antibiotico-resistenza in ceppi di Salmonella Characters of pathogenicity and antimicrobial resistance of Salmonella strains isolated from reptiles M. Corrente 1, M. Totaro 1, G. Greco 1, E. Tarsitano 1, A. Madio 1, K.G. Friedrich 2, M. Campolo 1, C. Buonavoglia 1 *Autore di riferimento: M. Corrente Riassunto: Nel presente studio 22 ceppi di Salmonella del Giardino Zoologico (Bioparco) di Roma e di proprietà privata sono stati sierotipizzati e testati per la sensibilità a 15 antibiotici. Inoltre sono stati ricercati mediante PCR i geni di patogenicità fim, inva e spvc e i geni che codificano per le integrasi (int 1, 2, 3 e 4). Diciassette sierotipi sono risultati appartenere a Salmonella enterica subspecie enterica e 4 ceppi alla sottospecie IIIa, mentre 1 ceppo è risultato non tipizzabile. Diciotto ceppi sono risultati resistenti a 2 o più antibiotici. In particolare, la maggior parte dei ceppi è risultata resistente al sulfametossazolo (21 su 22) alla streptomicina (14) e alla colistina solfato (11). Per quanto concerne la PCR, è stato evidenziato che tutti i ceppi erano in possesso dei geni fim e inva e 3 ceppi, appartenenti a Salmonella subsp. IIIa, del gene spvc. Inoltre 11 ceppi sono risultati positivi per int 1, 2 stipiti per int 2, nessun ceppo per int 3 e 4. La presenza di caratteri di patogenicità nei ceppi analizzati conferma la potenzialità dei rettili a trasmettere l infezione all uomo e ribadisce la necessità di una corretta informazione sulle norme igieniche da osservare durante la manipolazione di tali animali. Inoltre la diffusione di elementi di antibiotico-resistenza sottolinea che il trattamento antibiotico degli animali, che raramente dà la sterilizzazione batteriologica, è da considerarsi dannoso. Summary: In this survey 22 Salmonella strains isolated from reptiles housed in the Bioparco in Rome or belonging to private owners were serotyped and tested for susceptibility to 15 antimicrobials. Pathogenicity and antimicrobial resistance genes such as fim, inva, spvc and int 1, 2 3 and 4 were investigated by PCR. Seventeen Salmonella enterica subsp. enterica and 4 serotypes Salmonella subsp. IIIa were found. One strain was untypeable. Eighteen strains were found to be resistant to two or more antimicrobials. Most strains were resistant to sulfamethoxazole (21 out 22 strains) to streptomycin (14) and to colistin sulfate (11). The genes fim and inv A were found in all the strains, while 3 strains were positive to the PCR for the gene spvc. Eleven strains were shown to possess int 1 gene, and 2 strains int 2. Int 3 and 4 were not found. The presence of pathogenicity genes highlights that the strains isolated from reptiles are able to transmit the infection to humans. Furthermore, as some characters of antimicrobial resistance are diffused among those strains, antibiotic treatment of Salmonella carriers should be avoided and good hygiene practices during animal handling should be recommended. INTRODUZIONE La salmonellosi è considerata uno dei più importanti problemi di salute pubblica. L uomo si infetta principalmente attraverso il consumo di alimenti di origine animale [Turnbull, 1979]; tuttavia, il contatto con i rettili sta assumendo un peso crescente nel determinismo dell infezione, in relazione alla loro diffusione come animali da compagnia [Woodward et al, 1997; Willis et al, 2002]. Gli animali a sangue freddo sono infatti reservoirs di diversi sierotipi di salmonelle [Chiodini e Sundberg, 1981]. Negli ultimi anni numerosi casi di salmonellosi correlati alla presenza di rettili nelle abitazioni dei pazienti, o legati al contatto con proprietari di rettili, sono stati segnalati dal Centers for Disease Control [CDC 1992a, 1992b, 1999, 2003]. Nei rettili allevati in cattività è molto frequente l isolamento di S. enterica subspecie enterica (I), che annovera i sierotipi più frequentemente isolati in corso di salmonellosi nell uomo [Geue e Lor- 1 Dipartimento di Sanità e Benessere animale, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Bari. 2 Servizio Veterinario del Bioparco, Roma.

2 GIMMOC Vol. VIII N 3, schner, 2002]. Tuttavia, anche altri stipiti e appartenenti a S. bongori e S. enterica subsp. IIIa e IIIb, sono stati messi in relazione con episodi di malattia nell uomo [Pignato et al, 1998]. Nei rettili le salmonelle non sembrano avere un ruolo patogeno primario; solo in animali in cattive condizioni di salute possono provocare malattia, alla stregua di altri enterobatteri presenti nell intestino [Chiodini e Sundberg, 1981]. Per converso, i casi segnalati nell uomo evidenziano che i ceppi isolati dai rettili possono conservare le caratteristiche di patogenicità. Studi condotti su animali da laboratorio hanno dimostrato infatti che alcuni ceppi isolati da coccodrilli sono dotati di proprietà invasive [Madsen et al, 1998]. Queste caratteristiche sarebbero conferite da alcuni geni, organizzati nelle cosiddette isole di patogenicità delle salmonelle (SPI) [Bäumler et al, 1998]. Negli stadi iniziali dell infezione sono importanti i geni che codificano per le fimbrie, che promuovono l adesione dei batteri alla mucosa intestinale [Bäumler et al, 1998]. Tra questi si annovera il gene fim, che produce fimbrie di I tipo, racchiuso nella SPI 1. La capacità di dare infezione sistemica negli animali a sangue caldo è dovuta invece ad altri geni, come inva, appartenente alla SPI 1, che promuove l internalizzazione delle salmonelle nelle cellule e ai geni della SPI 2, tra cui spv (plasmide di virulenza in salmonella) [Bäumler, 1997]. Nel quadro evolutivo degli enterobatteri l acquisizione di tali geni si sarebbe verificata relativamente di recente, consentendo la diversificazione delle salmonelle da altri enterobatteri a partire da un progenitore comune. In particolare, l acquisizione della SPI 1 avrebbe causato la divergenza tra Salmonella bongori, che è considerata la specie ancestrale delle salmonelle, e Escherichia coli. In una seconda fase, sarebbe comparsa la SPI 2 e con essa gli altri sierotipi di Salmonella. L analisi di questi geni riveste dunque un ruolo importante nello studio della filogenesi delle salmonelle [Bäumler et al, 1998]. Un altro aspetto importante riguarda la sensibilità agli antibiotici delle salmonelle isolate dai rettili. Nel tentativo di eliminare le salmonelle dall intestino, gli animali portatori possono essere trattati con antibiotici. Questa prassi, impiegata soprattutto in passato, potrebbe aver favorito l insorgenza di caratteri di antibiotico-resistenza [Johnson-Delaney, 1996]. Sono note infatti le capacità delle salmonelle di rispondere alla pressione selettiva degli antibiotici con la selezione di ceppi resistenti, e la facilità con cui questi batteri scambiano materiale genetico. Questa prerogativa, condivisa da altri batteri Gram negativi, è legata anche all esistenza di frammenti mobili del genoma, definiti integroni, specializzati nel veicolare caratteri di resistenza agli antibiotici. E stato stimato che questi segmenti possono contenere sino a 60 geni diversi che codificano per tali resistenze [Carattoli, 2001]. Sono state descritte 4 classi di integroni, ma i più diffusi sono gli integroni di classe 1 [Goldstein et al, 2001]. La presenza di questi geni è un indicatore della potenzialità delle salmonelle ad acquisire caratteri di antibiotico-resistenza, soprattutto in virtù della loro permanenza nell intestino dei rettili come flora saprofitica. Sulla scorta di queste considerazioni, alcuni sierotipi di Salmonella spp. isolati da diverse specie di rettili allevati presso un giardino zoologico e di proprietà privata sono stati analizzati per quanto concerne alcuni caratteri di patogenicità. I ceppi sono stati inoltre saggiati per la sensibilità in vitro ad alcuni antibiotici e per la presenza di geni relativi agli integroni. MATERIALI E METODI Ceppi: Sono stati esaminati 18 ceppi isolati da diverse specie di rettili del Giardino Zoologico di Roma (Bioparco) e 4 stipiti appartenenti a privati (Tabella I). L isolamento è stato effettuato dalle feci utilizzando il protocollo standard per l isolamento di salmonelle da matrici alimentari [ISO 6579, Anon 1993] con qualche modifica [Corrente et al, 2004]. I ceppi sono stati Analisi di caratteri di patogenicità e antibiotico-resistenza in ceppi di Salmonella Characters of pathogenicity and antimicrobial resistance of Salmonella strains isolated from reptiles

3 172 GIMMOC Vol. VIII N 3, 2004 Corrente et al. Tabella I Sierotipi di Salmonella, resistotipi e analisi mediante PCR di geni di patogenicità e antibiotico-resistenza Campione Animale Provenienza Sierotipo Resistotipo PCR fim inv A Spv C Int 1 Int 2 Int 3 Int /02 Serpente del grano Bioparco S. Newport Cs Smx a 59/02 Camaleonte S. Muenster Amp C Cs Kf S Smx Te /02 Camaleonte S. Senftenberg Cs S Smx Te /02 Camaleonte S. Gaminara Amp C Cs S Smx Te a 67/02 Pitone S. Aqua Smx b 67/02 Tartaruga S. Senftenberg Smx /02 Lucertola S. Senftenberg S Smx /02 Basilisco S. Senftenberg S Smx /02 Cervone S. Newport Smx a 72/02 Lucertola ocellata S. Give S Na Smx b 72/02 Tartaruga S. Poona Cs Na Smx Sxt a 72/02 Eloderma sospetto S. subsp. IIIa (O 48) Na S Smx /02 Varano del Nilo S. Senftenberg Cs a 72/02 Tartaruga S. subsp. IIIa (O 48 ) S Smx Sxt a 72/02 Camaleonte S. Gbadago S Smx a 101/02 Lucertola S. Minnesota Amp Na Smx Te b 101/02 Lucertola ocellata S. Minnesota Amp Cs Na Smx Te /02 Camaleonte S. Oldenburg Amp C Cs S Smx Te /03 Iguana Privato S. subsp. IIIa (O 17 ) S Smx /03 Iguana Non tipizzabile Cs Na S Smx /02 Lucertola S. Havana Cs Na S Smx /02 Pitone S. subsp. IIIa RF Cs S Smx Antibiotici saggiati: Acido nalidixico (Na), ampicillina (Amp), amoxicillina+ clavulanico (Aug), cefalotina (Kf), ceftazidime (Caz), ciprofloxacin (Cip), cloramfenicolo (C), colistina solfato (Cs), cotrimossazolo (Sxt), gentamicina (Gn), neomicina (N), norfloxacin (Nor), streptomicina (S), sulfametossazolo (Smx), tetraciclina (Te).

4 GIMMOC Vol. VIII N 3, quindi identificati con il sistema api 20E (Biomérieux, Mercy l Etoile, Francia), mediante agglutinazione rapida su vetrino con sieri polivalenti O e H ( Biotech Laboratories, Ipswich Suffolk, UK) e tipizzati con lo schema di Kauffmann- White [Zavanella 2001], presso l Istituto Zooprofilattico di Brescia. Ceppi di referenza: per standardizzare le tecniche sono stati utilizzati 2 ceppi ATCC: S. typhimurium e S. arizonae 13314, acquistati presso la Biogenetics (Padova). Prove di sensibilità in vitro: i ceppi sono stati testati con la tecnica della diffusione in agar, seguendo le direttive del National Committee on Clinical Laboratory Standard [NCCLS 1999] per la sensibilità verso i seguenti antibiotici (concentrazione dei dischetti in µg, Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Te): acido nalidixico (30), ampicillina (10), amoxicillina +acido clavulanico (30), cefalotina (30), ceftazidime (30), ciprofloxacin (5), cloramfenicolo (30), colistina sulfato (10), co-trimossazolo (25), gentamicina (10), neomicina (30), norfloxacin (10), streptomicina (10), sulfametossazolo (50), tetraciclina (30). Estrazione del DNA: I ceppi sono stati seminati in Brain Heart Infusion (Oxoid, Milano) e incubati overnight a 37 C. Un millilitro di brodocoltura di ciascun ceppo è stato sottoposto al protocollo di estrazione del kit QIAmp Tissue (QIAGEN GmbH, Germania). Pcr: Le tecniche di PCR sono state effettuate utilizzando il DNA Thermal Cycler Gene Amp 9600 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA). I campioni sono stati saggiati con i primers indicati nella tabella II [Cohen et al, 1996; Khan et al, 2000; Goldstein et al, 2001]. Cinque microlitri di DNA di ogni campione sono Analisi di caratteri di patogenicità e antibiotico-resistenza in ceppi di Salmonella Characters of pathogenicity and antimicrobial resistance of Salmonella strains isolated from reptiles Tabella II Primers utilizzati nelle reazioni di PCR. Primers Sequenza Temperatura di Riferimento (Forward e Reverse) annealing ( C) bibliografico Fim Inv A Spv C Int 1 Int 2 Int 3 Int 4 F:CCTTTCTCCATCGTCCTG R: TGGTGTTATCTGCCTGACCA 58 Cohen et al. (1996) F: CGCGGCCCGATTTTCTCTGGA R:AATGCGGGGATCTGGGCGACAAG 67 Khan et al F:GGGGCGGAAATACCATCTACA R:GCGCCCAGGCTAACACG 60 Khan et al F:CCTCCCGCACGATGATC R:TCCACGCATCGTCAGGC 65 Goldstein et al F.TTATTGCTGGGATTAGGC R:ACGGCTACCCTCTGTTATC 60 Goldstein et al F:AGTGGGTGGCGAATGAGTG R:TGTTCTTGTATCGGCAGGTG 60 Goldstein et al F:CGGTATGTCTAATTGCTCTTG R: TGGCCACAAAGACTCAATCAC 60 Goldstein et al. 2001

5 174 GIMMOC Vol. VIII N 3, 2004 Corrente et al. stati aggiunti alla miscela di reazione così costituita: PCR buffer (10X), 1.5 mm Mg Cl 2, 200 µm di ogni nucleotide trifosfato, 0.1 mm di ogni primer, 2.5 U di Amplitaq Gold Polymerase (Perkin Elmer Cetus Norwalk, USA) e H 2 O distillata sino a raggiungere un volume finale di 50 µl. Le miscele di reazione sono state sottoposte a 1 ciclo iniziale di denaturazione a 94 C per 8 minuti, seguite da 35 cicli di amplificazione, ciascuno di 1 minuto di denaturazione a 94 C, 1 minuto di annealing, a temperature diverse per ogni coppia di primers ( tabella II), 2 minuti di estensione a 72 C, 1 ciclo finale di 8 minuti a 72 C. I prodotti di PCR sono stati visualizzati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2 % colorato con etidio bromuro, con l ausilio del CHEMIDOC (Bio-rad, Milano). RISULTATI I risultati sono riassunti nella tabella I. La sierotipizzazione ha messo in evidenza 21 stipiti appartenenti alla specie S. enterica, di cui 17 appartenenti a S. enterica subspecie I e 4 a S. enterica subspecie IIIa. La tipizzazione non è stata possibile per 1 ceppo, isolato da un iguana. Le prove di sensibilità in vitro hanno permesso di evidenziare la resistenza ad alcuni antibiotici nei sierotipi di Salmonella saggiati. La maggior parte dei ceppi è risultata resistente al sulfametossazolo (21 su 22 ceppi), alla streptomicina (14) alla colistina solfato (11). Sette ceppi sono risultati resistenti all acido nalidixico, 6 alla tetraciclina, 5 all ampicillina, 3 al cloramfenicolo e 2 al cotrimossazolo. Solo 1 stipite è risultato resistente alla cefalotina. Per converso, nessuno dei ceppi è risultato resistente a norfloxacin, ciprofloxacin, amoxicillina +clavulanico, ceftazidime, gentamicina, neomicina. Secondo la definizione adottata da Dargatz et al [2003], 18 ceppi sono risultati multiresistenti, cioè resistenti a due o più antibiotici. In particolare 9 ceppi sono risultati resistenti a 4 o più antibiotici. Per quanto concerne l analisi dei caratteri di patogenicità, tutti i ceppi saggiati sono risultati positivi alla PCR per i geni fim e inva, mentre in 3 ceppi appartenenti a Salmonella subsp. III A, è stato messo in evidenza il gene spvc. Le reazioni di amplificazione dei tratti relativi alle integrasi hanno dato i seguenti risultati: 11 ceppi sono risultati positivi per il frammento int 1 e 2 ceppi positivi per int 2. Nessun campione è risultato positivo alla PCR per i frammenti int 3 e int 4. DISCUSSIONE Precedenti indagini svolte in USA e in Europa hanno messo in evidenza che l isolamento di salmonelle dai rettili è molto frequente [Johnson-Delaney, 1996; Pasmans et al. 2000; Geue and Lorschner 2002; Pasmans et al. 2002]. In una recente indagine effettuata sugli animali del rettilario del Bioparco di Roma è stata riscontrata una prevalenza del 50.5% [Corrente et al, 2004]. La sierotipizzazione dei ceppi analizzati nel presente studio ha messo in evidenza che non sempre i rettili albergano sierotipi esotici, soprattutto se mantenuti in cattività. Inoltre in alcuni animali è stato isolato S. Senfentberg, un sierotipo particolarmente termoresistente [Murphy et al, 1999]. A tale proposito, occorre ricordare che si sono verificati casi di salmonellosi anche in individui che non avevano avuto un contatto diretto con il rettile portatore. Nel 1996, durante una esibizione a scopo didattico in uno zoo, un rettile utilizzato per un esibizione ha trasmesso la salmonellosi a 39 bambini, sebbene nessuno di questi avesse toccato l animale [Friedman et al. 1998]. Nel tentativo di spiegare come mai le salmonelle non siano patogene per i rettili, alcuni autori hanno sottolineato che questi animali hanno un sistema immunitario più rudimentale rispetto agli animali a sangue caldo. In particolare, l assenza di stazioni linfatiche periferiche organizzate come le placche del Peyer, o di linfonodi veri e propri, innescherebbe una sorta di tolleranza del sistema immunitario verso gli stimoli antigenici a livello intestinale, consentendo alle salmonelle di diventare batteri commensali [Bäumler et al, 1998]. Tuttavia, è stato evidenziato anche nella nostra in-

6 GIMMOC Vol. VIII N 3, dagine che a fronte della varietà di sierotipi isolati, un denominatore comune di tali ceppi è la presenza di geni che codificano per alcuni caratteri di patogenicità. Come in altri studi, il gene spvc è stato evidenziato solo nei sierotipi di Salmonella subsp. IIIa, mentre i geni inva e fim si sono dimostrati ubiquitari [Chiu e Jonathan, 1996; Hudson et al, 2000; Khan et al, 2000]. La presenza di tali geni ribadisce la necessità di considerare questi animali come potenziale fonte di salmonellosi. Inquadrate in tale ottica, appaiono pienamente giustificate le raccomandazioni dei CDC, che consiglia di adottare norme igieniche scrupolose durante la manipolazione di tali animali, e invita a non entrare in possesso di rettili se in casa ci sono bambini di età inferiore a 5 anni, anziani o individui immunocompromessi [CDC 2003]. Infatti in queste categorie la salmonellosi provocata da rettili può essere letale [Weinstein et al, 1995]. Presso il Bioparco è in atto dal 1998 un programma di prevenzione che, per ridurre il rischio d infezione da Salmonella, preconizza il controllo sanitario del personale e degli animali, una procedura dettagliata da seguire durante la manipolazione dei rettili, e il divieto d impiego di tali animali nell ambito di attività didattiche (Friedrich et al, 2000). I ceppi isolati hanno mostrato un elevata percentuale di antibiotico-resistenza, non soltanto verso i presidi terapeutici che di solito sono utilizzati in queste specie animali. E interessante notare che molti ceppi sono risultati multiresistenti, con pattern di resistenza parzialmente sovrapponibili a quelli dei ceppi isolati dall uomo in Europa [Threlfall et al, 1998], facendo ipotizzare che la coabitazione con l uomo o con altre specie animali può favorire lo scambio di ceppi. Inoltre è stata messa in evidenza la presenza di geni relativi agli integroni anche in ceppi che non esprimevano un fenotipo antibiotico-resistente. In particolare molti ceppi veicolavano il gene Int 1, relativo agli integroni di classe 1. Questo frammento mobile, che veicola tra gli altri i geni per la resistenza ai sulfamidici e ad alcuni disinfettanti, risulta essere largamente diffuso nei Gram negativi [Guerra et al 2000; Goldstein et al 2001]. Nel genere Salmonella, come in altri Enterobatteri, i meccanismi di trasferimento genetico intra e inter specifico sono molto frequenti. Gli integroni, saltando da un batterio all altro causano la resistenza multipla, fenomeno caratterizzato dalla comparsa di resistenze verso diversi antibiotici, non necessariamente utilizzati nella terapia o nella chemioprofilassi [Carattoli, 2001]. La somministrazione di antibiotici a scopo profilattico è da considerarsi inutile per diversi motivi: i) è raro ottenere la sterilizzazione batteriologica dei soggetti [Johnson-Delaney, 1996]; ii) essendo i rettili eliminatori intermittenti, risulta difficile evidenziare tramite l esame batteriologico se c è stata l effettiva eliminazione di tali germi dall intestino; iii) la potenzialità dei ceppi di Salmonella ad acquisire caratteri di antibiotico-resistenza fa ritenere che questi trattamenti sono non solo inutili ma anche dannosi. Per minimizzare il rischio di trasmissione di salmonelle dai rettili all uomo, i medici veterinari devono: a) formare in maniera adeguata il personale addetto alla manipolazione dei rettili; b) fornire una corretta informazione sui rischi sanitari ai proprietari privati; c) garantire l osservanza di norme di profilassi sanitaria (Bradley et al, 1998). BIBLIOGRAFIA Anon. ISO Microbiology-General guidance on methods for the Detection of Salmonella, 3 rd edn Case Postale 56, CH Genève 20, Switzerland Bäumler A.J. The record of horizontal gene transfer in Salmonella. Trends Microbiol., 5 (8): , Bäumler A.J., Tsolis R.M., Ficht T.A., Adams L.G. Evolution of Host Adaptation in Salmonella enterica. Infect. Immun., 66: , Bradley T., Angulo F.J., Raiti P. Association of reptilian and amphibian veterinarians guidelines for reducing risk of transmission of Salmonella spp. from reptiles to humans. J. Am. Vet. Med. Assoc., 213: 51-52, Analisi di caratteri di patogenicità e antibiotico-resistenza in ceppi di Salmonella Characters of pathogenicity and antimicrobial resistance of Salmonella strains isolated from reptiles

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