DIPARTIMENTO DI BIOINGEGNERIA

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3 DIPARTIMENTO DI BIOINGEGNERIA PERSONALE Capo Dipartimento Andrea REMUZZI, Dr.Ing. Laboratorio di Biofisica Renale Capo Laboratorio Daniela MACCONI, Dr.Sci.Biol. Laboratorio di Tecnologie Biomediche Capo Laboratorio Bogdan ENE-IORDACHE, Dr.Bio.Ing. Unità di Ingegneria dei Tessuti Capo Unità Marina FIGLIUZZI, Dr.Sci.Biol. 1

4 CURRICULA Andrea Remuzzi si è laureato in Ingegneria Meccanica (indirizzo Biomedico) nel 1979 presso il Politecnico di Milano. Attività formative: 1980 Politecnico di Milano, Dipartimento di Ingegneria Biomedica; 1981 Istituto Mario Negri (Milano), Laboratorio di Farmacologia Cardiovascolare; Massachussets Institute of Technology, Mechanical Engineering Department, Cambridge, USA. Aree di interesse: fenomeni di trasporto nei sistemi biologici, modelli matematici, fisiopatologia renale, risposta cellulare allo stimolo meccanico, ingegneria dei tessuti, tecniche di trapianto di isole pancreatiche, basi di dati clinici, fluidodinamica computazionale. Dal 1984 al 1986 Ricercatore Istituto Mario Negri (Bergamo), Laboratorio di malattie renali, Capo dell Unità di Bioingegneria, Istituto Mario Negri, Capo del Laboratorio di Bioingegneria, Istituto Mario Negri, Capo del Dipartimento di Ricerca Renale, Istituto Mario Negri, dal 2000 ad oggi Capo del Dipartimento di Bioingegneria, Istituto Mario Negri. Dal 1998 professore a contratto del Dipartimento di Bioingegneria, Politecnico di Milano. Principali pubblicazioni Davies PF, Remuzzi A, Gordon EJ, Dewey CF Jr, Gimbrone MA Jr. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A Apr;83(7): PMID: Remuzzi A, Puntorieri S, Battaglia C, Bertani T, Remuzzi G. Angiotensin converting enzyme inhibition ameliorates glomerular filtration of macromolecules and water and lessens glomerular injury in the rat. J Clin Invest Feb;85(2): PMID: Noris M, Morigi M, Donadelli R, Aiello S, Foppolo M, Todeschini M, Orisio S, Remuzzi G, Remuzzi A. Nitric oxide synthesis by cultured endothelial cells is modulated by flow conditions. Circ Res Apr;76(4): PMID: Giavazzi R, Foppolo M, Dossi R, Remuzzi A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J Clin Invest Dec;92(6): PMID: Antiga L, Ene-Iordache B, Remuzzi A. Computational geometry for patient-specific reconstruction and meshing of blood vessels from MR and CT angiography. IEEE Trans Med Imaging May;22(5): PMID: Remuzzi A, Gagliardini E, Sangalli F, Bonomelli M, Piccinelli M, Benigni A, Remuzzi G. ACE inhibition reduces glomerulosclerosis and regenerates glomerular tissue in a model of progressive renal disease. Kidney Int Apr;69(7): Daniela Macconi si è laureata in Scienze Biologiche nel 1983 presso l Università degli Studi di Milano. Attività formative: CNR, Sezione di Neuroscienze, Farmacologia Cellulare e Molecolare, Dipartimento di Farmacologia Medica, Università di Milano; Laboratorio della Divisione di Nefrologia e Dialisi Ospedali Riuniti di Bergamo; University of Michigan, Medical School, Department of Pathology, Medical Science I, Ann Arbor Michigan, USA; Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Bergamo. Aree di interesse: permeabilità glomerulare, progressione della malattia renale, angiotensina II, specie reattive dell ossigeno. Ruoli: 2000 ad oggi Capo Laboratorio di Biofisica Renale, Dipartimento di Ingegneria Biomedica; Capo Unità dei Mediatori dell Infiammazione di Origine Leucocitaria; ricercatrice; borsista; borsista presso il Laboratorio della Divisione di Nefrologia e Dialisi Ospedali Riuniti di Bergamo Principali pubblicazioni Macconi D, Abbate M, Morigi M, Angioletti S, Mister M, Buelli S, Bonomelli M, Mundel P, Endlich K, Remuzzi A, Remuzzi G: Permselective dysfunction of podocyte-podocyte contact upon angiotensin II unravels the molecular target for renoprotective intervention. Am J Pathol.168: , Macconi D, Bonomelli M, Benigni A, Plati T, Sangalli F, Longaretti L, Conti S, Kawachi H, Hill P, Remuzzi G, Remuzzi A. Pathophysiologic implications of reduced podocyte number in a rat model of progressive glomerular injury. Am J Pathol.168:42-54, Ruiz-Torres MP, Casiraghi F, Galbusera M, Macconi D, Gastoldi S, Todeschini M, Porrati F, Belotti D, Pogliani EM, Noris M, Remuzzi G: Complement activation: the missing link between ADAMTS-13 deficiency and microvascular thrombosis of thrombotic microangiopathies. Thromb Haemost. 93:443-52, Galbusera M, Buelli S, Gastoldi S, Macconi D, Angioletti S, Testa C, Remuzzi G, Morigi M: Activation of porcine endothelium in response to xenogeneic serum causes thrombosis independently of platelet activation. Xenotransplantation. 12:110-20, Morigi M, Macconi D, Zoja C, Donadelli R, Buelli S, Zanchi C, Ghilardi M, Remuzzi G: Protein overload-induced NFkappaB activation in proximal tubular cells requires H(2)O(2) through a PKC-dependent pathway. J Am Soc Nephrol. 13: ,

5 Macconi D, Ghilardi M, Bonassi ME, Mohamed EI, Abbate M, Colombi F, Remuzzi G, Remuzzi A: Effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on glomerular basement membrane permeability and distribution of zonula occludens-1 in MWF rats. J Am Soc Nephrol 11:477-89, Bogdan Ene-Iordache si è laureato in Ingegneria Meccanica nel 1990 presso l Istituto di Petrolio e Gas di Ploiesti (Romania). Dopo una breve esperienza in una raffineria di petrolio, in 1992 emigra in Italia. Inizia la sua esperienza al Negri-Bergamo nel marzo 1992 come Visiting Scientist nel Laboratorio di Bioingegneria condotto da Andrea Remuzzi. Le sue principali attività sono nella ricerca renale (modelli teorici della filtrazione delle membrana glomerulare e analisi morfometrica del capillare glomerulare, analisi emodinamica e remodeling nelle fistole artero-venose per l accesso vascolare dei pazienti in dialisi) e nell ambito degli studi clinici controllati (data management e analisi per gli studi clinici controllati svolti nel Centro Aldo e Cele Daccò ). Inoltre, sta coordinando le attività di supporto alla rete informatica e i siti web del Centro Aldo e Cele Daccò. Sta collaborando per informatica applicata all attività clinica con lo staff delle Unità di Nefrologia, Diabetologia ed Ematologia degli Ospedali Riuniti. Sotto la sua supervisione si sono formati negli anni alcuni giovani studenti del Politecnico di Milano, in tesi o in stage, e dal 2003 ha l incarico di insegnamento per i corsi di Formazione Professionale della Regione Lombardia. All inizio del 2000 è diventato capo del Laboratorio di Tecnologie Biomediche creato all interno dell appena nato Dipartimento di Bioingegneria. Principali pubblicazioni Ene-Iordache B, Imberti O, Foglieni O, Remuzzi G, Bertani T and Remuzzi A. Effects of angiotensin-converting enzyme inhibition on glomerular capillary wall ultrastructure in MWF/Ztm rats. J Am Soc Nephrol 5: , Ene-Iordache B and Remuzzi A. Numerical analysis of blood flow in reconstructed glomerular capillary segments. Microvasc Res 49: 1-11, Remuzzi A and Ene-Iordache B. Capillary network structure does not affect theoretical analysis of glomerular size selectivity. Am J Physiol 268: F972-F979, Ene-Iordache B, Mosconi L, Remuzzi G, Remuzzi A. Computational fluid dynamics of a vascular access case for hemodialysis. J Biomech Eng 123(3): , Ene-Iordache B, Mosconi L, Antiga L, Bruno S, Anghileri A, Remuzzi G, Remuzzi A. Radial artery remodeling in response to shear stress increase within arteriovenous fistula for hemodialysis access. Endothelium 10(2): , Ruggenenti P, Fassi A, Ilieva AP, Bruno S, Iliev IP, Brusegan V, Rubis N, Gherardi G, Arnoldi F, Ganeva M, Ene- Iordache B, Gaspari F, Perna A, Bossi A, Trevisan R, Dodesini AR, Remuzzi G for the Bergamo Nephrologic Diabetes Complications Trial (BENEDICT) Investigators. Preventing microalbuminuria in type 2 diabetes. NEJM 351(19): , Marina Figliuzzi si è laureata in Scienze Biologiche nel 1991 presso l Università degli Studi di Milano. Attività formative: Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Bergamo. Aree di interesse: tecniche di isolamento di isole pancreatiche da pancreas umano, bovino, di maiale e di ratto, colture cellulari, sistemi di immunoisolamento per isole pancreatiche, differenziazione di cellule progenitrici del pancreas in cellule che contengono insulina, tecniche di immunoistochimica. Ruoli: 2000 ad oggi, Capo Unità di Ingegneria dei Tessuti, Dipartimento di Ingegneria Biomedica; borsista. Principali pubblicazioni Figliuzzi M, Cornolti R, Plati T, Rajan N, Adobati F, Remuzzi G, Remuzzi A: Subcutaneous xenotransplantation of bovine pancreatic islets. Biomaterials. 26: , Figliuzzi M, Zappella S, Morigi M, Rossi P, Marchetti P, Remuzzi A: Influence of donor age on bovine pancreatic islet isolation. Transplantation. 70: , 2000 Morigi M, Micheletti G, Figliuzzi M, Imberti B, Karmali MA, Remuzzi A, Remuzzi G, Zoja C. Verotoxin-1 promotes leukocyte adhesion to cultured endothelial cells under physiologic flow conditions. Blood.: , Zoja C, Morigi M, Figliuzzi M, Bruzzi I, Oldroyd S, Benigni A, Ronco P, Remuzzi G. Proximal tubular cell synthesis and secretion of endothelin-1 on challenge with albumin and other proteins. Am J Kidney Dis.26: , Morigi M, Zoja C, Figliuzzi M, Foppolo M, Micheletti G, Bontempelli M, Saronni M, Remuzzi G, Remuzzi A. Fluid shear stress modulates surface expression of adhesion molecules by endothelial cells. Blood. 85: , Morigi M, Zoja C, Figliuzzi M, Remuzzi G, Remuzzi A. Supernatant of endothelial cells exposed to laminar flow inhibits mesangial cell proliferation. Am J Physiol. 264:C1080-3,

6 INTRODUZIONE ALLE ATTIVITA' DEL DIPARTIMENTO L'attività di ricerca del Dipartimento di Bioingegneria si basa sull'impiego di tecniche ingegneristiche per lo studio di processi fisiopatologici e lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Sono attualmente attive all'interno del Dipartimento diverse linee di ricerca, sia a livello di base che di ricerca applicata. I principali strumenti utilizzati per queste ricerche consistono in modelli teorici, immagini diagnostiche, analisi istologiche, misure dirette di parametri fisico-chimici sia a livello sperimentale che clinico, tecniche di coltura cellulare e tecnologie informatiche per l'archiviazione e l'analisi dei dati. Gli studi in corso afferiscono a quattro settori della ricerca biomedica: lo studio dei meccanismi coinvolti nella progressione del danno renale nelle nefropatie croniche, studi sull'emodinamica in campo vascolare, lo sviluppo di tecniche di laboratorio per l'ingegneria dei tessuti e lo sviluppo di sistemi informativi dedicati alla gestione di dati clinici generati sia nell'ambito dei trial clinici che nella pratica clinica convenzionale. SCOPERTE/RISULTATI PRINCIPALI Messa a punto di nuovi metodi di calcolo automatico per la ricostruzione tridimensionale di aneurismi cerebrali mediante angiografia rotazionale. Dimostrazione di una relazione significativa tra parametri morfometrici del parenchima renale e la perdita di funzione renale in pazienti affetti da malattia del rene policistico. Valutazione della precisione di una nuova tecnica per la ricostruzione non invasiva, mediante immagini RM degli accessi vascolari per l'emodialisi. Dimostrazione dell'effettiva riduzione della sclerosi glomerulare e della ripopolazione di podociti glomerulari mediante antagonismo dell angiotensina II in un modello sperimentale di nefropatia cronica progressiva. Modulazione delle proteine di giunzione delle cellule epiteliali glomerulari da parte dell angiotensina II. Messa a punto di un nuovo metodo per la coltura in vitro di tessuti tridimensionali. COLLABORAZIONI NAZIONALI Dipartimento di Bioingegneria, Politecnico di Milano, Milano. Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Padova. Istituto di Fisiologia Clinica CNR, Pisa. Tecnobiomedica, Roma. Unità di Anatomia Patologica, Ospedale San Paolo, Milano. Unità di Diabetologia, Ospedali Riuniti, Bergamo. Ospedale Niguarda, Milano. 4

7 COLLABORAZIONI INTERNAZIONALI Massachussetts Institute of Technology, Cambridge MA, USA. National Alliance for Medical Imaging Computing, USA. Politecnico Federale di Zurigo, Dept. of Material Science, Zurich. Institute of Nephrology, Dept. of Cell Biology, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences. University of Toronto, Ontario, Canada. Ghent University, Ghent, Belgium. Technical University, Eindhoven, The Netherlands. University Hospital, Maastricht, The Netherlands. Centre Européen d Etudes du Diabètes, Strasburg, France PRESENZA IN COMITATI EDITORIALI Drugs of Today (Andrea Remuzzi) International Journal of Artificial Organs (Andrea Remuzzi) ATTIVITA' DI REVISIONE Kidney International Journal of the American Society of Nephrology American Journal of Physiology Renal Physiology Physiological Reviewes Medical & Biological Engineering & Computing IEEE Transactions on Medical Imaging IEEE Transactions on Biomedical Ingeneering Medical Physics Journal of Biomechanics Medical Engineering and Physics Artificial Organs International Journal of Artificial Organs Biomaterials Contemporary Clinical Trials 5

8 ORGANIZZAZIONE DI EVENTI Seminario: Perdita delle proprietà selettive del podocita indotta da Angiotensina II, 31 Gennaio, Ranica, Bergamo Seminario: Imaging vascular access: a pre- and post- operative approach, 2 Febbraio, Ranica, Bergamo Seminario: Regressione della glomerulosclerosi e rigenerazione del tessuto glomerulare in un modello di malattia renale progressiva, 17 Febbraio, Ranica, Bergamo Seminario: Diffusion e perfusion cerebrale nelle lesioni ischemiche, 23 Febbraio, Ranica, Bergamo Seminario: Evoluzione temporale della geometria della biforcazione carotidea ed implicazioni per lo sviluppo di aterosclerosi, 16 Marzo, Ranica, Bergamo Seminario: Analisi geometrica dei vasi cerebrali: applicazione allo studio degli aneurismi cerebrali, 20 Aprile, Ranica, Bergamo Seminario: Sviluppo di algoritmi per il post-processing in simulazioni CFD. Applicazione alla emodinamica computazionale degli aneurismi cerebrali, 8 Maggio, Ranica, Bergamo Seminario: Effetti del condizionamento biochimico e meccanico su costrutti vascolari ingegnerizzati, 15 Maggio, Ranica, Bergamo Corso: Corso di formazione in elaborazione digitale delle immagini per la medicina, Giugno, Ranica, Bergamo Meeting annuale: FP6 UE BARP+ - Development of a bioartificial pancreas for type I diabetic patients. PNR Luglio, Bergamo Seminario: Implementazione di uno strumento per la gestione e l analisi di dati clinici finalizzato al monitoraggio delle patologie nefrovascolari nei paesi in via di sviluppo, 20 Settembre, Ranica, Bergamo Seminario: Introduzione alla risonanza magnetica: presentazione cd, 22 Settembre, Ranica, Bergamo Seminario: Sviluppo di una metodologia per l'analisi della concatenazione genica (linkage) mediante data retrieval ed elaborazione multiallelica, 11 Ottobre, Ranica, Bergamo Seminario: Valutazione di 2 metodiche di coltura dinamica per costrutti vascolari ingegnerizzati, 7 Dicembre, Ranica, Bergamo Seminario: Sviluppo e sperimentazione di un dispositivo da laboratorio per la misura del consumo di ossigeno di cellule in coltura, 15 Dicembre, Ranica, Bergamo 6

9 PARTECIPAZIONE AD EVENTI CON CONTRIBUTI DEL DIPARTIMENTO 3rd International Symposium on Modelling of Physiological Fluids, Ranica (BG), Italia, Hemodynamics and cerebral aneurysms: the role of geometry. 5th World Congress of Biomechanics, Monaco, Germania, Flow instability in a failed brachiocephalic graft for hemodialysis: a computational study. 5th World Congress of Biomechanics, Monaco, Germania. Geometric intra-subject variability of arm vessels assessed by MRA: a challenge for quantification and modeling of the vascular access for hemodialysis. 5th World Congress of Biomechanics, Monaco, Germania. Computational geometric analysis of cerebral aneurysms and their parent vasculature from CRA. 5th World Congress of Biomechanics, Monaco, Germania. Influence of siphon bends on the flow patterns of the internal carotid artery: implications for the study of aneurysm development. 5th World Congress of Biomechanics, Monaco, Germania. Statistical and numerical investigations of cerebral aneurysms' morphology and haemodynamics. ISMRM 14th Scientific Meeting, Seattle, Washington, USA. Numerical simulation of MRI using unstructured grids. CSCBC 2006, Kingston, Ontario, Canada, Marzo Towards a new framework for simulating magnetic resonance imaging. Annual meeting of the American Society of Nephrology, San Diego, USA, Novembre ACE inhibition induced regression of glomerular lesions in spontaneously proteinuric rats is associated with icreased number of podocytes.. 25 th Workshop of the AIDIPIT Study Group, Pisa, Italia Febbraio Xenotransplantation of microencapsulated bovine pancreatic islets. CONTRIBUTI E CONTRATTI Ministero dell Università e della Ricerca Scientifica Fondazione San Paolo Progetti di Ricerca FP6 UE - "BARP+ - Development of a bioartificial pancreas for type I diabetic patients". PNR Progetto di Ricerca FP6 UE-STEPS "A system approach to tissue engineering products and processes". FP

10 SELEZIONE PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE APPARSE NELL'ANNO 2006 Antiga L, Piccinelli M, Fasolini G, Ene-Iordache B, Ondei P, Bruno S, Remuzzi G and Remuzzi A. Computed tomography evaluation of ADPKD progression: a progress report. Clin J Am Soc Nephrol 1: , Arrigoni C, Camozzi D, Imberti B, Mantero S, Remuzzi A. The effect of sodium ascorbate on the mechanical properties of hyaluronan-based vascular constructs. Biomaterials 2006; 27: Arrigoni C, Camozzi D, Remuzzi A. Vascular tissue engineering Cell Transplant 2006; 15 Suppl 1: S119-S125. Dodesini AR, Lepore G, Neotti C, Ene-Iordache B, Remuzzi A and Trevisan R. Blood pressure and lipids in an Italian outpatient cohort of type 2 diabetic patients: comparison with the general population. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 16(6): e1-e3, Figliuzzi M, Plati T, Cornolti R, Adobati F, Fagiani A, Rossi L, Remuzzi G, Remuzzi A. Biocompatibility and function of microencapsulated pancreatic islets. Acta Biomater Mar;2(2): Macconi D, Bonomelli M, Benigni A, Plati T, Sangalli F, Longaretti L, Conti S, Kawachi H, Hill P, Remuzzi G, Remuzzi A. Pathophysiologic implications of reduced podocyte number in a rat model of progressive glomerular injury. Am J Pathol 2006; 168: Macconi D, Abbate M, Morigi M, Angioletti S, Mister M, Buelli S, Bonomelli M, Mundel P, Endlich K, Remuzzi A, Remuzzi G. Permselective dysfunction of podocyte-podocyte contact upon angiotensin II unravels the molecular target for renoprotective intervention. Am J Pathol Apr;168(4): Morigi M, Buelli S, Zanchi C, Longaretti L, Macconi D, Benigni A, Moioli D, Remuzzi G, Zoja C. Shigatoxininduced endothelin-1 expression in cultured podocytes autocrinally mediates actin remodeling. Am J Pathol Dec;169(6): Moyle KR, Antiga L and Steinman DA. Inlet conditions for image-based CFD models: is it reasonable to assume fully-developed flow? Journal of Biomechanical Engineering, 128(3), Jun Remuzzi A, Gagliardini E, Sangalli F, Bonomelli M, Piccinelli M, Benigni A, Remuzzi G. ACE inhibition reduces glomerulosclerosis and regenerates glomerular tissue in a model of progressive renal disease. Kidney Int 2006; 69: Remuzzi G, Benigni A, Remuzzi A. Mechanisms of progression and regression of renal lesions of chronic nephropathies and diabetes. J Clin Invest Feb;116(2): Ruggenenti P, Perna A, Ganeva M, Ene-Iordache B and Remuzzi G. Impact of Blood Pressure Control and Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor Therapy on New-Onset Microalbuminuria in Type 2 Diabetes: a Post Hoc Analysis of the BENEDICT Trial. J Am Soc Nephrol 17: , Ruggenenti P, Ene-Iordache B, Remuzzi G. Excellent survival using kidney transplants from older donors Diabetic Microvascular Complications Today, March/April

11 ATTIVITA' DI RICERCA Laboratorio di Biofisica Renale Ricostruzione tridimensionale della rete capillare glomerulare Abbiamo recentemente dimostrato che l inibizione dell angiotensina II non solo rallenta la progressione della malattia renale, ma può indurre anche parziale regressione delle lesioni glomerulari. Per quantificare esattamente il grado di regressione delle lesioni sclerotiche e la possibile rigenerazione del capillare glomerulare indotta dalla terapia con inibitori dell enzima di conversione dell angiotensina (ACE), stiamo sviluppando tecniche di ricostruzione tridimensionale dei tessuti (3D). La struttura del capillare glomerulare permette di concentrare in un piccolo spazio una rete capillare in grado di filtrare efficacemente l'acqua plasmatica e trattenere le proteine circolanti. La valutazione delle alterazioni strutturali del capillare viene effettuata convenzionalmente mediante sezioni osservate al microscopio ottico o elettronico. Alterazioni della struttura tridimensionale della rete capillare possono influenzare in modo importante la funzione del capillare e il flusso ematico nei segmenti del capillare. Per studiare nel dettaglio la struttura di questo tessuto stiamo impiegando tecniche di microscopia basate su serie di sezioni seriate ed elaborazione digitale per la ricostruzione 3D. Come difendere il rene dall insulto dell angiotensina II agendo sui meccanismi molecolari che regolano il contatto podocita-podocita Il trattamento con farmaci che bloccano l angiotensina II (Ang II) migliora la funzione della barriera glomerulare rallentando la progressione del danno verso l insufficienza renale. I meccanismi molecolari di questa protezione non sono chiari. I podociti e, in particolare, le giunzioni intercellulari che li uniscono sono i componenti fondamentali della barriera glomerulare. Il citoscheletro svolge un ruolo fondamentale nel regolare sia la struttura che la funzione del podocita. I nostri studi condotti in vitro in podociti murini hanno permesso di stabilire che l Ang II riorganizza le fibre di actina del citoscheletro e causa la ridistribuzione della proteina zonula occludens-1 (ZO-1), un componente fondamentale della giunzione intercellulare podocita-podocita, che è associata all actina. La perdita del contatto podocitapodocita, aumenta il passaggio dell albumina attraverso il monostrato cellulare. La jasplakinolide, un farmaco che stabilizza l actina, previene sia la ridistribuzione della ZO-1 che la perdita di albumina suggerendo che la riorganizzazione del citoscheletro è strumentale per l alterata funzione del podocita. Esperimenti condotti in reni isolati e perfusi di ratto hanno confermato che la proteinuria indotta dall infusione di Ang II si associa ad alterazioni nella distribuzione glomerulare delle fibre di actina e della proteina ZO-1. Abbiamo dimostrato che gli effetti in vitro dell Ang II sono mediati dall attivazione del recettore di tipo1 attraverso segnali intracellulari quali le Src chinasi (tirosin chinasi non recettoriali) e la fosfolipasi C. I risultati di questo studio suggeriscono che interventi mirati a stabilizzare il contatto podocitapodocita o a bloccare messaggeri intracellulari deputati alla traduzione del segnale che segue l attivazione del recettore dell Ang II sono cruciali per proteggere il rene. Abbiamo dimostrato che nei ratti MWF lo sviluppo di proteinuria spontanea è associata a marcate alterazioni nella distribuzione glomerulare della proteina ZO-1 e che il trattamento con inibitori dell enzima di conversione dell angiotensina (ACE), che bloccano la sintesi di Ang II, previene la proteinuria preservando la corretta distribuzione della ZO-1 nelle giunzioni tra podocita e podocita. (In collaborazione con il Dipartimento di Medicina Molecolare). 9

12 La regressione del danno glomerulare indotta dagli inibitori dell enzima di conversione dell angiotensina (ACE) in un modello di nefropatia cronica si associa a un aumento del numero dei podociti glomerulari Numerosi studi sperimentali e clinici hanno evidenziato nelle perdita dei podociti glomerulari la causa dello sviluppo della glomerulosclerosi e della progressiva perdita della funzione renale. In questo contesto il nostro gruppo ha recentemente dimostrato, in un modello sperimentale di danno glomerulare spontaneo (ratti MWF), che la progressiva riduzione del numero di podociti, associata a ipertrofia glomerulare, causa la perdita di funzione del podocita stesso che determina massiva proteinuria e, a lungo termine, danno renale. Attraverso la ricostruzione tridimensionale della matassa del capillare glomerulare abbiamo anche documentato che il trattamento dei ratti MWF con l ACE inibitore è in grado di far regredire il danno renale e rigenerare il capillare glomerulare. Sulla base di queste scoperte abbiamo voluto studiare se la protezione e la riparazione del glomerulo indotta dall ACE inibitore fosse legata alla capacità del farmaco di modulare il numero di podociti glomerulari. Abbiamo quindi studiato gli animali a 40 settimane, età in cui sviluppano proteinuria elevata e glomerulosclerosi, e dopo 20 settimane di osservazione senza o con trattamento con l ACE inibitore Lisinopril. Un gruppo aggiuntivo di ratti Wistar di 40 settimane è stato utilizzato come controllo. I podociti sono stati identificati come cellule WT1 positive con una tecnica di immunofluorescenza e il loro numero, insieme al volume glomerulare, occupato o non dalla sclerosi, determinato mediante morfometria digitale. I risultati dello studio hanno confermato che il trattamento ritardato con alte dosi di Lisinopril oltre ad avere un effetto anti-ipertensivo, induce regressione della proteinuria e delle lesioni sclerotiche e stabilizza la funzione renale. Riduce inoltre significativamente l ipertrofia glomerulare. Il dato nuovo e del tutto inaspettato è l effetto dell ACE inibitore sul numero di podociti: non solo blocca la perdita progressiva di podociti che si osserva da 40 a 60 settimane d età, ma aumenta il numero di podociti per glomerulo al di sopra dei valori basali. Sono in corso degli studi per individuare I meccanismi che sottendono a questo fenomeno e in particolare se l aumento del numero di podociti dipende dalla proliferazione delle stesse cellule adulte o se i nuovi podociti derivano da progenitori renali o derivanti da cellule staminali del midollo. 10

13 Laboratorio di Tecnologie Biomediche Sviluppo di sistemi computerizzati per la realizzazione di Studi Clinici Controllati Nel Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare Aldo e Cele Daccò sono in corso numerosi studi clinici in collaborazione con altri gruppi di ricerca nazionali o internazionali. Queste ricerche devono essere svolte secondo le linee guida GCP (Good Clinical Practice) e richiedono un alta qualità nella raccolta e nella gestione dei dati clinici. Ogni trial clinico richiede dei case report form (CRF) cartacei per la registrazione dei dati. Tali dati devono essere poi archiviati in maniera elettronica in database appositamente predisposti. Nel nostro laboratorio abbiamo realizzato sistemi di raccolta dati per gli studi clinici, utilizzando database relazionali (RDBMS) e sviluppato programmi finalizzati all elaborazione, validazione e all estrazione dei dati per l analisi statistica. Nell ambito dello studio DEMAND è stato realizzato un sistema innovativo di raccolta dati usando CRF elettronici anziché cartacei. Il sistema è basato sull utilizzo di computer portatili in dotazione agli investigatori e permette di evitare l uso della modulistica cartacea. Recentemente abbiamo messo in funzione un applicazione di supporto per lo staff bio-medico coinvolto nel processo di isolamento di isole pancreatiche umane e il successivo trapianto nel paziente diabetico. Questa applicazione utilizza l interfaccio Web, in modo da poter facilitare l accesso del personale sia da Intranet (laboratori interni all Istituto) che da Internet (NIT, Ospedali Riuniti di Bergamo). KDDC - il centro di coordinamento e raccolta dati per i programmi di prevenzione delle patologie nefro-vascolari nei paesi in via di sviluppo Le malattie renali croniche si stanno rivelando una nuova minaccia a livello globale. La diffusione e l incidenza di queste patologie nei paesi in via di sviluppo non sono note, e questo rappresenta un ostacolo all adozione di misure preventive, l unica speranza per il futuro di questi paesi, considerando che la dialisi non è accessibile alla maggior parte della popolazione per i suoi costi elevati. La Società Internazionale di Nefrologia (ISN) attraverso la Commission for Global Advancement of Nephrology (COMGAN) ha costituito un gruppo di ricerca rivolto specificatamente ad affrontare le problematiche della prevenzione delle malattie renali nei paesi in via di sviluppo. Il coordinamento del gruppo e dei programmi di intervento è stato affidato all Istituto Mario Negri di Bergamo e ha sede presso il Centro di Ricerche Cliniche per Aldo e Cele Daccò di Ranica. L obiettivo generale del progetto è la definizione di programmi in paesi emergenti per identificare soggetti a rischio di sviluppare malattie renali nel corso della loro vita, così da definire una strategia di prevenzione su scala nazionale attraverso l intervento a livello governativo e finanziario dei Ministeri della Salute locali. Il centro di raccolta dati the Kidney Disease Data Center KDDC costituito preso il nostro Laboratorio ha implementato uno strumento informatico che permetta la raccolta facile (via e- mail) dei dati clinici provenienti dai diversi paesi, e poi di effettuare analisi statistiche in modo da ottenere report affidabili da sottoporre all attenzione del personale medico. Abbiamo già raccolto dati dai centri partecipanti di Moldova, Bolivia, Nepal e Cina, mentre altri paesi si stanno attivando per iniziare il programma (Marocco, Mongolia, Mozambico, Messico, Argentina). Sarà quindi possibile monitorare l andamento del programma nei vari centri coinvolti, mettendo in luce le necessità e le peculiarità dei singoli paesi. Ricostruzione tridimensionale e simulazione emodinamica di segmenti vascolari da indagini CT e MR L'evidenza che le placche aterosclerotiche si formano principalmente nelle ramificazioni del circolo arterioso ha portato a ipotizzare che condizioni emodinamiche "disturbate" favoriscano l'insorgenza dell'aterosclerosi. Inoltre, è stato evidenziato come anche l'iperplasia intimale, 11

14 causa di fallimento di graft e fistole arterovenose, sia localizzata in corrispondenza di zone con emodinamica complessa. Analogamente, studi sulla formazione, sulla localizzazione e sulla crescita degli aneurismi cerebrali inducono a considerare l'emodinamica come un importante fattore nello sviluppo della patologia. Data l'influenza della forma del vaso sull'emodinamica, è importante disporre di metodi accurati e veloci di ricostruzione geometrica. Le tecniche angiografiche moderne, come la tomografia assiale computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MR), permettono di ottenere informazioni dettagliate sulla struttura dei vasi. Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato tecniche per la ricostruzione tridimensionale, l'analisi geometrica, la generazione di griglie computazionali e la simulazione fluidodinamica di tratti vascolari da angiografie CT e MR. Le immagini CT e MR, trasferite dalle apparecchiature di acquisizione su calcolatore, vengono processate con algoritmi di modellazione per generare superfici tridimensionali che riproducono l'interfaccia tra parete vascolare e lume del vaso. L'accuratezza della ricostruzione è stata validata sperimentalmente. Sui modelli generati vengono poi effettuate misure accurate utilizzando algoritmi di geometria computazionale. I segmenti vascolari studiati hanno riguardato principalmente gli aneurismi cerebrali, fistole arterovenose e i loop graft per emodialisi. Le patologie indagate sono state l'aterosclerosi, l'iperplasia intimale, la formazione di aneurismi cerebrali e l'arterite di Takayasu, una malattia rara a carico del sistema vascolare. Quantificazione di strutture anatomiche da indagini CT e MR L'introduzione nella clinica di tecniche di imaging non invasive e tridimensionali, come la tomografia assiale computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MR), ha fornito la possibilità di analizzare la struttura anatomica di organi con elevato dettaglio. La non-invasività di tali tecniche permette di estendere l'osservazione a popolazioni di pazienti seguiti nel tempo. La valutazione dell'evolvere di patologie o dell'efficacia di trattamenti richiede spesso una quantificazione della morfologia delle strutture indagate che non può essere svolta unicamente a livello visivo. Abbiamo quindi sviluppato tecniche di quantificazione basate su immagini dotate di alta accuratezza e riproducibilità. Esse sono in corso di applicazione su pazienti affetti da rene policistico (autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD) volto a testare l'efficacia e la sicurezza di alcuni trattamenti. I volumi del rene e delle sue principali componenti tessutali (cisti e parenchima) sono stati quantificati a partire da immagini CT o RM. Sviluppo di un dispositivo per il trapianto di isole pancreatiche immunoisolate Il trapianto di isole pancreatiche immunoisolate è una valida strategia per il trattamento del diabete insulino-dipendente perché le isole possono garantire un appropriata produzione di insulina e i sistemi di immunoisolamento sono in grado di prevenire il rigetto perché impermeabili alle cellule del sistema immunitario dell ospite. Nei nostri laboratori abbiamo sviluppato due sistemi di immunoisolamento per il trapianto di isole pancreatiche di origine bovina in ratti diabetici. Un sistema è costituito da un dispositivo di fibre cave affiancate parallelamente con una geometria piana che ne facilita l impianto sottocute sul dorso e il recupero. I risultati dei trapianti con i dispositivi hanno dimostrato che le isole contenute nel dispositivo sono vitali e funzionanti per un periodo di tempo di circa 20 giorni e la membrana garantisce un immunoprotezione alle isole bovine. Il secondo sistema è costituito da microcapsule di alginato, un polisaccaride derivante dalle alghe che è in grado di proteggere le isole dall attacco del sistema immunitario. Le microcapsule sono state impiantate nella cavità peritoneale di ratti diabetici. Le microcapsule contenenti isole bovine normalizzano i livelli di glucosio nel sangue per diverse settimane. Per valutare se la perdita di funzionalità delle isole contenute nei sistemi di immunoisolamento utilizzati è dovuta ad una scarsa ossigenazione, abbiamo studiato il consumo di ossigeno da parte delle isole pancreatiche all interno dei dispositivi confrontandolo con il consumo di ossigeno da parte di isole libere. I risultati hanno dimostrato che i dispositivi permettono un adeguata diffusione dell ossigeno. Gli obiettivi che 12

15 ci proponiamo sono quelli di migliorare la funzionalità dei dispositivi valutando nuove fibre con porosità maggiore che consentano una maggiore durata dei dispositivi a fibre cave e di ottimizzare i trapianti con le microcapsule valutando le condizioni ottimali per ridurre il numero di isole da trapiantare. Programma di trapianto di isole pancreatiche nel paziente diabetico insulino-dipendente Recenti studi clinici hanno dimostrato che il trapianto di isole pancreatiche in pazienti diabetici può indurre la normoglicemia evitando la somministrazione di insulina e i frequenti controlli della glicemia richiesti dal trattamento convenzionale. Questo tipo di trapianto è molto efficace se viene impiantato un numero sufficiente di isole pancreatiche. Un numero di circa isole equivalenti/kg del ricevente è necessario per raggiungere l indipendenza dall insulina, anche se sono necessari due o più trapianti per raggiungere una tale numerosità. La nostra ricerca è stata quindi finalizzata al miglioramento delle tecniche di isolamento e purificazione per ottenere il maggior numero di isole da un solo pancreas umano. Abbiamo introdotto un sistema che ci permette di mantenere l organo ad una temperatura controllata di 4 C per tutta la durata della pulizia dell organo e un sistema per perfondere il pancreas con l enzima di digestione ad una pressione controllata per evitare traumi al tessuto pancreatico. Per valutare la vitalità delle isole ottenute e quindi avere una stima precisa del numero di isole vitali che si trapianteranno utilizziamo sostanze fluorescenti, in grado di colorare di verde il citoplasma della cellula viva e di rosso il nucleo delle cellule morte. Grazie poi all analisi al microscopio confocale siamo in grado di quantificare le cellule vive o morte nelle isole. Obiettivo dei prossimi mesi è quello di valutare le condizioni migliori per il mantenimento in coltura del materiale cellulare per uso clinico. Differenziazione di cellule del pancreas precursori delle cellule beta Il diabete di tipo I è caratterizzato da distruzione autoimmnune delle cellule beta delle isole pancreatiche, con conseguente deficit di insulina e completa dipendenza dalla somministrazione di insulina esogena. La cura per il diabete di tipo I viene dal trapianto di nuove cellule beta, ma questa procedura risente della scarsità di donazioni di pancreas rispetto ai potenziali riceventi. Nei nostri laboratori abbiamo studiato la metodica per sviluppare beta-cellule sostitutive a partire da cellule progenitrici contenute nel tessuto esocrino o presenti nelle isole pancreatiche di origine bovina o di ratto. Le cellule ottenute contenenti insulina sono poche rispetto alle cellule beta contenute nelle isole pancreatiche. L obiettivo che ci proponiamo è quello di aumentare la quantità di cellule differenziate sviluppando nuove strategie per selezionare le cellule progenitrici del pancreas. Trapianto di isole pancreatiche in modelli singenici e allogenici Studi recenti hanno dimostrato che il trapianto delle isole pancreatiche può essere un alternativa efficace e più sicura al trapianto di pancreas. Nei nostri laboratori abbiamo sviluppato la metodica di isolamento di isole pancreatiche di ratto che consiste nella digestione enzimatica del pancreas e successiva purificazione. Le isole così ottenute sono trapiantate sotto la capsula renale di ratti resi diabetici con singola iniezione di streptozotocina. Utilizziamo due modelli di trapianto: singenico e allogenico. Nel trapianto singenico ratti fratelli vengono utilizzati come donatore e ricevente. In questo modello le isole trapiantate inducono nel ricevente una condizione di normoglicemia che si mantiene per mesi. Nel trapianto allogenico il donatore e il ricevente sono di ceppo differente e il trapianto delle isole sotto la capsula renale induce condizioni di normoglicemia, mantenute per lungo tempo grazie anche alla somministrazione di Ciclosporina come farmaco immunosoppressore. La messa a punto di queste tecniche ha lo scopo di sviluppare nuove strategie atte ad aumentare la sopravvivenza e la funzionalità delle isole pancreatiche. 13

16 Ingegneria del tessuto vascolare Le protesi vascolari artificiali possono essere impiegate nei pazienti solo se di calibro superiore a sei millimetri. Protesi artificiali di calibro inferiore sono soggette ad elevato rischio trombotico. Per questo motivo si sta cercando di sviluppare in laboratorio un sostituto vascolare biologico bioartificiale, ossia una protesi realizzata con le tecniche dell'ingegneria dei tessuti. Nei nostri laboratori sono in corso ricerche basate sull'utilizzo di una matrice di acido ialuronico esterificato come materiale biodegradabile per la generazione di costrutti vascolari. Abbiamo definito le condizioni di coltura e di semina sia di cellule muscolari lisce che di cellule mesenchimali del midollo. Per ottenere un adeguato condizionamento del costrutto tubolare abbiamo realizzato un nuovo tipo di bioreattore a rotazione che permette di coltivare la protesi bioartificiali in modo semplice ma efficace permettendo di limitare l apoptosi e favorire la deposizione di matrice. 14

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