Test rapido immunocromatografico per la rilevazione della Calprotectina su campione fecale
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- Livia Grilli
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1 Test rapido immunocromatografico per la rilevazione della Calprotectina su campione fecale L-CT-101 L-CT-102 Medcard Calpro Test immunocromatografico per la rilevazione della Calprotectina nelle feci Medcard Calpro Test immunocromatografico per la rilevazione della Calprotectina nelle feci 20 TESTS 50 TESTS Test rapido immunocromatografico in fase solida senza dosaggio del campione, il test necessita quantità minime di campione. Premesse Medcard Calpro è un test rapido one step immunocromatografico per la rilevazione qualitativa della calprotectina umana nelle feci, che è indice della presenza di infiammazione gastrointestinale causata da diverse patologie (malattie infiammatorie intestinali, cancro al colon retto, e alcune enteropatie). Il test offre un elevata sensibilità. E un saggio rapido e non invasivo per la rilevazione di attività infiammatoria intestinale, per il monitoraggio della risposta ad un trattamento e per la predizione del rischio di recidiva. La Calprotectina è una proteina citosolica dei neutrofili con proprietà antimicrobiche, la cui concentrazione nelle feci risulta innalzata durante un processo infiammatorio intestinale. La proteina è stabile nel campione fecale e, tenuta a temperatura ambiente, non subisce degradazione per 7 giorni; per questo risulta un analita ideale. La calprotectina viene rilasciata in seguito all attivazione dei leucociti, i suoi livelli risultano così elevarsi nel plasma, nel fluido cerebro-spinale, nel liquido sinoviale, nelle urine e feci e nell organo/i interessati dalla patologia. La calprotectina inibisce il sistema enzimatico zinco-dipendente, uccidendo i batteri e inducendo apoptosi nelle cellule normali e cancerogene. In presenza di calcio, la calprotectina è notevolmente resistente alla degradazione proteolitica, ed è stabile nei campioni fecali per 7 gg a temperatrura ambiente. Principio La Medcard Calprotectina è un saggio immunocromatografico qualitativo per la rilevazione della calprotectina umana in campioni fecali. La membrana a livello della banda test (T) è legata da anticorpi diretti contro la calprotectina umana. Durante il test, il campione reagisce con microsfere colorate ricoperte in superficie da anticorpi anti-calprotectina umana che sono state deidratate sulla striscia del test. La miscela scorre attraverso la membrana per capillarità. Nel caso di risultato positivo gli specifici anticorpi presenti sulla banda test (T) della membrana reagiranno con la miscela coniugata e genereranno una linea colorata. Una banda di colore verde apparirà sempre a livello della linea di controllo (C) come verifica che un volume sufficiente di campione è stato caricato, come conferma che sia avvenuto un flusso corretto del campione e come controllo interno dei reagenti.
2 Composizione Card Natura chimica del preparato Card immunocromatografica contenente una membrana di nitrocellulosa come fase solida. Il pozzetto per il campione (S) contiene anticorpi anticalprotectina coniugati a microsfere rosse e anticorpo IgG di coniglio coniugato a microsfere verdi. Gli stessi anticorpi si trovano immobilizzati alla fase solida sulla linea test (T) e sulla linea controllo (C). Soluzione diluente Natura chimica della soluzione Fosfato 0,15 M, Sodio Azide 0,095 % Sensibilità e Specificità SENSIBILITA : un campione contente calprotectina a concentrazione uguale o superiore a 50 µg/g di feci produce un risultato positivo utilizzando il test Medcard Calprotectina. Differenti diluizioni di calprotectina sono state testate direttamente nel buffer di estrazione o inserite in un campione fecale negativo in accordo con le istruzioni d uso del test per determinare il limite di rilevazione del test. La rilevazione della calprotectina umana con il test Medcard Calprotectina mostra una sensibilità >94% in confronto ad un altro test commerciale (Calprest Eurospital). SPECIFICITA : la rilevazione della calprotectina umana con il test Medcard Calprotectina mostra 93% di specificità in confronto ad un altro test commerciale (Calprest Eurospital). La Medcard Calprotectina è specifica per la calprotectina umana, non mostra cross-reattività con calprotectine di altre specie. Conservazione e Validità Conservare la confezione sigillata in frigorifero o a temperatura ambiente (2-30 C/ F). Il test ha stabilità per un anno. La data di scadenza è indicata sulla confezione. Il test deve rimanere chiuso nella sua confezione fino al momento di utilizzo. Non congelare. Campioni Raccogliere una sufficiente quantità di feci (1-2 ml per i campioni liquidi). I campioni fecali devono essere raccolti in provette pulite e asciutte (prive di conservanti o media di trasporto). Il dosaggio deve essere eseguito dopo la raccolta. I campioni possono essere conservati in frigorifero (2-4 C/36-40 F) per 7 giorni prima di essere analizzat i. Per lunghi periodi di conservazione i campioni devono essere congelati a 20 C/-4 F. In questo caso, il campione deve essere completamente scongelato e riportato a temperatura ambiente fino al momento dell'analisi. Procedura Procedura di preparazione dei campioni fecali (foto 1): 1. Utilizzare una diversa provetta per ciascun campione fecale. Svitare il tappo della provetta e introdurre lo stick quattro volte nelle feci per raccogliere il campione (10-20mg). Riavvitare il tappo col campione di feci alla provetta con il buffer. 2. Agitare delicatamente al fine di distaccare il campione dallo stick e consentire una sua accurata dispersione nel buffer. Nel caso le feci siano liquide, aspirare le feci con una pipetta e aggiungerne approssimativamente µl nella provetta di raccolta con il buffer. 3. Proseguire agitando su vortex, al fine di assicurare una buona dispersione del campione. Attendere fino a quando il campione risulti omogeneo e la parte solida sia completamente disciolta.
3 Procedura del test (foto2): Per eseguire il test, i campioni fecali nelle provette con il buffer devono essere a temperatura ambiente. Non aprire le card prima di effettuare il test. 4. Rimuovere la card calprotectina dalla confezione e utilizzarla il prima possibile. Posizionarla su di una superficie liscia e pulita. 5. Prendere la provetta col campione ben disciolto e staccare la punta della provetta. 6. Usare la provetta come una pipetta e deporre 4 gocce o 100 µl all interno del pozzetto di caricamento rotond0 (S) della card. 7. Far partire il timer e leggere il risultato dopo 10 minuti. Foto 1 1. Raccogliere 2. Sciogliere il campione nel il campione buffer FECI Foto 2 S 4. Preparare la Card S 5. Staccare la punta della provetta 6. / 7. Caricare il campione disciolto nel buffer nel pozzetto e leggere Interpretazione dei Risultati CALPROTECTINA POSITIVO: nella finestra centrale, in aggiunta alla banda di controllo VERDE nella regione identificata con la lettera C (control line), appare anche una banda ROSSA in corrispondenza della regione identificata con la lettera T (result line). Un risultato positivo alla calprotectina può essere indicativo della presenza di una patologia infiammatoria gastrointestinale. NEGATIVO: nella finestra centrale, appare solo la banda di controllo VERDE nella regione identificata con la lettera C (control line). Un risultato negativo mostra che non è presente nessuna attività infiammatoria a livello gastrointestinale. NON VALIDO: nella finestra centrale, c è totale assenza della banda di controllo VERDE nella regione identificata con la lettera C (control line) indipendentemente dalla presenza della banda colorate ROSSA in corrispondenza della regione identificata con la lettera T (result line). Una
4 quantità insufficiente di campione caricata, una procedura tecnica eseguita scorrettamente o il deterioramento dei reagenti sono tra le cause più frequenti del fallimento del test. Rivedere la procedura e ripetere il test con un nuovo test. Se il problema persiste anche utilizzando altri test dello stesso kit, consultare il distributore locale. Se dopo 10 minuti di incubazione non sarà apparsa alcuna banda colorata, il test non potrà avere valore diagnostico. Foto 3 Calprotectina POSITIVO Calprotectina NEGATIVO NON VALIDO L intensità del colore rosso della banda colorata a livello della regione identificata con la lettera T (result line) varierà in base alla concentrazione di calprotectina nel campione. Limitazioni del test Un eccesso di campione può causare risultati erronei. Diluire il campione con il buffer e ripetere il test. I campioni fecali di pazienti in trattamento con anti-infiammatori non-steroidei (NSAID) potrebbero mostrare risultati positivi. I livelli di calprotectina fecale nei neonati sono stati osservati più elevati che in bambini normali con una mediana di 167 µg/g. Alcuni campioni fecali possono diminuire l intensità della banda di controllo. Nei pazienti con malattia infiammatoria e infiltrazione neutrofila intestinale come il Morbo di Crohn e la Colite Ulcerosa, dovrebbero esser positivi per la calprotectina fecale. Il test calprotectina potrebbe esser utilizzato per i pazienti con diarrea cronica. Un risultato positivo alla calprotectina conferma la presenza di calprotectina umana nelle feci; non è escluso che ciò sia dovuto a gravi cause (malattie infiammatorie intestinali, cancro al colon-retto o alcune enteropatie). Un risultato positivo dovrebbe esser seguito da ulteriori indagini diagnostiche su indicazione medica per determinare l esatta causa dell infiammazione. Un risultato negativo non esclude infiammazione, come la presenza di alcune patologie (malattia celiaca o malattie infiammatorie intestinali). Risultati attesi Alcuni studi stabiliscono come cut off un valore di calprotectina pari o superiore a 50µg di hfcp/g di feci per determinare la presenza di disordini infiammatori gastrointestinali in pazienti adulti, che richiederanno un ulteriore indagine diagnostica con procedura invasiva. Bibliografia: 1. Angriman I. et al. Enzymes in feces: Useful markers of chronic inflammatory bowel disease. Clinica Chimica Acta 381 Feb 2007, p Quail, M.A. et al. Fecal Calprotectin Complements Routine Laboratory Investigations in Diagnosing Childhood Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Bowel Dis, Vol 15 No 5; May 2009, p Gaya D.R., et al. Faecal calprotectin in the assessment of Crohn s disease activity. Q J Med 2005, Vol 98, May 2005, p
5 4. Langhorst, M.D. et al. Noninvasive Markers in the Assessment of Intestinal Inflammation in Inflammatory Bowel Diseases: Performance of Fecal Lactoferrin, Calprotectin and PMNElastase, CRP, and Clinical Indices. Am. J. Gastroenterol. 2008; Vol 103, p Fabbricato da: MEDIMAR Srl - Via Rutilia 10/ Milano Tel Fax info@medimaritalia.it 25 C Prodotto ad esclusivo uso diagnostico Ai sensi 98/79/CEE 2
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