Modulo 9: Enteriti infettive (esame microbiologico delle feci)*

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1 CdS Medicina e Chirurgia CI Medicina di Laboratorio MICROBIOLOGIA CLINICA AA Modulo 9: Enteriti infettive (esame microbiologico delle feci)* Giovanni Di Bonaventura, PhD Università «G. d Annunzio» di Chieti-Pescara * XXXVIII AMCLI 2009, rev. 2015, Andreoni et al

2 Aspetti clinico-epidemiologici Le malattie diarroiche rappresentano, dopo le malattie respiratorie, la seconda causa di morbilità e mortalità nel mondo. Ogni anno, oltre 1,7 bilioni di casi di malattia diarroica con circa 2-3 milioni di morti. La malattia diarroica è la seconda principale causa di mortalità nei bambini sotto i 5 anni (> bambini/anno), soprattutto nei Paesi in via di sviluppo dove l incidenza è molto alta a causa di condizioni sanitarie scadenti, approvvigionamento di acque non sicure e carenze nutrizionali. Seppur meno frequentemente, anche nei Paesi ad alto reddito la malattia diarroica rappresenta un serio problema sanitario. Soggetti a maggior rischio: bambini (età < 5 anni), anziani (età > 60 anni), soggetti portatori di malattie croniche (diabete), gravide, malati di AIDS e in generale da tutti i soggetti immunocompromessi. Tali patologie dipendono generalmente dall ingestione di alimenti o bevande infette (che fungono da semplice veicolo per i microrganismi o substrato per la loro moltiplicazione), ma anche secondarie ad un contatto con animali o materiali infetti, ad una trasmissione da persona a persona o sopraggiungere per l ingestione di droplets infette. A seguito di localizzazione gastro-intestinale, i microrganismi coinvolti (batteri, virus, miceti, protozoi) possono esercitare il loro potenziale effetto patogeno localmente oppure diffondere verso altre sedi corporee.

3 Definizioni Enterite: stato infiammatorio a carico dell intestino tenue. colite ed enterocolite indicano un interessamento del colon, mentre la gastroenterite implica un coinvolgimento, in termini di sintomatologia (nausea, vomito), del primo tratto del tubo digerente. Dissenteria: sindrome caratterizzata da diarrea ricca di muco e frequentemente di sangue. Sintomo caratteristico di un enterite infettiva è la diarrea: alterata funzionalità intestinale che si manifesta con una diminuzione di consistenza delle feci, legata ad un incremento del volume e del contenuto d acqua, e/o con incremento della frequenza di scariche ( 3/giorno). La diarrea può essere di origine infettiva (infezione di intestino tenue e/o colon da batteri, virus, parassiti) o non infettiva ( Paesi ad alto reddito): causata da intolleranza ai cibi, disordini (sindrome dell intestino irritabile) o malattie (colite ulcerosa, morbo di Crohn, morbo celiaco) intestinali o quale reazione all impiego di medicinali. In relazione alla durata, la diarrea può presentarsi come: acuta: un episodio con sintomatologia di durata inferiore a 14 giorni persistente: di durata superiore a 14 giorni cronica: di durata superiore a 30 giorni Rispetto al quadro clinico-sintomatologico, la diarrea può essere lieve, moderata o severa (allettamento paziente).

4 Eziologia La diarrea acuta è causata, nel 70% dei casi, da agenti infettivi. Un ampio spettro di microrganismi è in grado di causare diarrea, con meccanismi patogenetici diversi: VIRUS: Rotavirus, Adenovirus, Norwalk virus, Astrovirus. BATTERI: Salmonella, Shigella, V. cholerae, Staphylococcus aureus, Campylobacter, Helicobacter (limitatamente a H. fenelliae e H. cinaedi), E. coli (enterotossigeni, enteroemorragici o enteoinvasivi), Yersinia, Clostridium. PROTOZOI: Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium; Elminti (Strongyloides, Schistosoma); Microsporidi. Una buona percentuale di sindromi diarroiche rimane ancora oggi ad eziologia sconosciuta. E necessario rivalutare il ruolo eziologico di taluni microrganismi, classicamente non considerati di particolare preoccupazione per la salute pubblica, alla luce dei risultati ottenuti dall utilizzo delle tecniche molecolari. L importanza di alcuni batteri può essere attualmente sottovalutata a causa dell inadeguatezza dei metodi di rilevamento tradizionali. Ne sono esempi: Arcobacter species, A. buzleri, Bacteroides fragilis, Edwardsiella tarda, Escherichia albertii e Klebsiella oxytoca.

5 Escherichia coli I ceppi patogeni di E. coli sono classificati in 6 differenti «patotipi» associati a diarrea: Shiga toxin-producing E. coli (STEC) STEC possono rifersri anche a Verocytotoxin-producing E. coli (VTEC) o enterohemorrhagic E. coli (EHEC). E il patotipo più frequentemente causa di «foodborne outbreaks». Enteropathogenic E. coli (EPEC) Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enteroaggregative E. coli (EAEC) Enteroinvasive E. coli (EIEC) Diffusely adherent E. coli (DAEC)

6 Approccio diagnostico La diagnosi eziologica in un soggetto con diarrea acuta è finalizzata a liberarlo dai sintomi, reidratarlo (o prevenire la disidratazione) e potenzialmente prevenire la trasmissione di infezione. L esame microbiologico delle feci andrebbe eseguito in presenza di un forte sospetto (clinico-anamnestico) di diarrea infettiva (diarrea acuta, protratta, del viaggiatore, in pazienti in età avanzata, immunodepressi). E raccomandata* la coltura di feci per pazienti con qualsiasi dei seguenti sintomi: diarrea severa o persistente, temperatura > 38 C, diarrea con sangue o la presenza di lattoferrina, leucociti o sangue occulto; disidratazione, storia clinica pregressa che include patogeni batterici. La coprocoltura è indicata per pazienti con diarrea severa e prolungata, quelli con sintomi di malattia invasiva o quelli con una storia di complicanze associate alla malattia gastrointestinale. La coltura delle feci è, inoltre, un mezzo importante per la Sanità Pubblica al fine di individuare e mappare epidemie a livello locale, nazionale ed internazionale. La coprocoltura non viene effettuata su campioni di feci non diarroiche od in momenti successivi alla scomparsa della sintomatologia, ad eccezione di controllo in soggetti con precedenti riscontri colturali positivi per patogeni enterici, per escludere una condizione di portatore asintomatico. *American College of Gastroenterology; Infectious Diseases Society of America

7 Campioni: modalità di raccolta e trasporto Le feci diarroiche vanno raccolte (0,5-2 g, 5-10 ml), prima della terapia antibiotica, subito dopo l esordio dei sintomi e comunque in fase acuta. Prelievo oltre 2-3 gg di ospedalizzazione non ha senso, tranne per la ricerca di C. difficile. Per la raccolta del campione, utilizzare contenitori sterili dotati di tappo a vite, contrassegnati (nome, cognome, data di nascita). I campioni non devono essere contaminati con urine, con l acqua dei sanitari o con carta igienica (può contenere sali di bario), perché potrebbero interferire con il risultato della coltura. Alternativamente, si effettua tampone fecale, intingendo il tampone (con terreno di trasporto Carey-Blair) nelle feci. Il tampone rettale è invece indicato per ricercare Shigella, Salmonella (portatori), S. agalactiae, N. gonorrhoeae, sebbene la resa sia minore del campione fecale (Breese et al, J Infect Dis 2012). I campioni raccolti con tampone non sono idonei per la ricerca di tossine e/o antigeni, protozoi. Per la ricerca del genere Vibrio, si procede, in fase acuta, sia al prelievo diretto delle feci che al prelievo mediante tamponi sterili, avendo cura di prelevare anche il muco sulle pareti del retto e non limitarsi alla superficie perianale. Nei pazienti convalescenti o in quelli in fase asintomatica è preferibile il prelievo delle feci intere rispetto ai tamponi. Non necessario effettuare una indagine su campioni multipli (analisi su 1 campione, sensibilità 94%), ad eccezione di un sospetto di parassitosi (es: Giardia intestinalis) oppure in presenza di persistente sintomatologia nonostante un precedente riscontro colturale negativo.

8 Campioni: modalità di raccolta e trasporto Le feci dovrebbero pervenire in laboratorio entro 1-2 ore dall emissione, altrimenti vanno conservate: 4-6 C per 24 ore (soluzione salina tamponata, terreno di trasporto Carey-Blair/Stuart/Amies). oltre le 24 h i campioni andrebbero mantenuti a 70 C. In caso di sospetta infezione da: Vibrio (particolarmente sensibile a lunghi periodi di trasporto, la sua vitalità è assicurata da un ph alcalino, tipico delle feci liquide), il campione viene posto in acqua peptonata alcalina con 1-3% di NaCl (per conservazione < 8 h) o in terreno semisolido di trasporto di Cary-Blair (per un tempo di conservazione > 8 h) extraintestinale da Salmonella, oltre a campioni fecali, andrebbero raccolti campioni di sangue ed urina febbre tifoide, campioni di sangue andrebbero raccolti nella prima settimana di febbre e campioni fecali e di urina le settimane successive

9 Indagini - Esame microscopico/sangue occulto/lattoferrina In presenza di diarrea persistente o ricorrente, l esame microscopico (per il riscontro di polimorfonucleati, PMN) (Leuco-test) oppure l immunodosaggio per la determinazione di sangue occulto o lattoferrina, possono ritenersi utili per la conferma di una diagnosi di diarrea infiammatoria o invasiva. La ricerca di PMN va riservata a campioni di feci fresche o conservate in contenitori per ricerca di parassiti. La presenza di lattoferrina (Lf) fecale può essere quantificata risultando generalmente a livelli più alti nelle diarree legate a Shigella, Salmonella, Campylobacter jejunii o C. difficile. Per l elevato potere predittivo negativo, la ricerca di Lf fecale può ritenersi un utile test di screening per una diagnosi presuntiva di enterite batterica infiammatoria o per una diagnosi d idoneità del campione per indagini colturali. Possibili falsipositivi in bambini allattati al seno (Lf in latte materno).

10 Indagini - Esame colturale La batteria di terreni primari utilizzati per le colture di campioni fecali varia in relazione ai microrganismi routinariamente ricercati. Le indagini di base dovrebbero prevedere la ricerca di Salmonella, Shigella, Campylobacter e STEC (Shiga toxinproducing E. coli). Dovrebbero quindi essere impiegati substrati per l isolamento di Salmonella, Shigella e Campylobacter; si dovrebbe prevedere un terreno per l isolamento di STEC O157 e/o un brodo di arricchimento per un test sulla presenza di Shiga-tossine.

11 Indagini - Esame colturale Modalità di semina: diretta: il campione (feci o tampone fecale), viene sospeso in soluzione fisiologica (diluizione 1:10 per ridurre la flora contaminante), quindi alcune gocce di sospensione fecale vengono seminate su piastra di coltura. con arricchimento: un volume di feci viene sospeso in brodo di arricchimento (rapporto 1:5); dopo incubazione ( 6 ore), si procede a sub-coltura mediante semina su terreni solidi appropriati. L arricchimento ha l obiettivo di creare condizioni favorevoli alla crescita di un determinato microrganismo, inibendo contemporaneamente la crescita di altri microrganismi, affinché non interferiscano sull isolamento. Le procedure di arricchimento, più che in forme acute in atto, sono quindi indicate quando si ipotizzano cariche microbiche basse (soggetti convalescenti, portatori asintomatici). su membrana filtrante: un volume di feci viene sospeso in brodo Brucella o in soluzione fisiologica e omogeneizzato; 4-5 gocce di sospensione vengono deposte sopra una membrana filtrante (acetato di cellulosa; pori da 0,45-0,65mm) sterile, appoggiata su una piastra di coltura con terreno non selettivo. A seguito di incubazione a 37 C per 45, si rimuove il filtro e si incuba per ore a 37 C in microaerofilia. Tale tecnica è indicata per la ricerca e l isolamento di microrganismi del genere Campylobacter e di generi correlati.

12 Indagini - Esame colturale Isolamento di Salmonella o Shigella. Terreni moderatamente selettivi: si tratta di terreni in grado di inibire la crescita della maggior parte degli Enterobatteri, facilitando la crescita di Salmonella spp. e Shigella spp. (Hektoen enteric, Xylose Lysine Desoxycholate, Salmonella-Shigella agar). Terreni cromogenici: si tratta di substrati che ottimizzano l isolamento selettivo e la differenziazione di batteri del genere Salmonella. La selettività del terreno è garantita da una miscela di sostanze inibenti che impediscono la crescita di batteri Gram+ e in parte di Gram-; la differenziazione tra i ceppi di Salmonella e di non-salmonella è ottenuta attraverso la presenza nel terreno di substrati cromogenici sui quali agiscono attività enzimatiche specifiche in grado di produrre metaboliti colorati. Terreni di arricchimento: terreni liquidi utili per inibire la crescita del normale microbiota nelle prime ore d incubazione, aumentando le probabilità di rilevare patogeni in bassa carica batterica. Brodi contenenti selenite (Selenite broth, Selenite cystine, GN broth): tossici per E. coli (sodio selenito) non per Salmonella spp, ma per Shigella Brodi contenenti tetrationato (Tetrathionate broth, Kauffmann Muller Tetrathionate broth): selettivi per Salmonella e Shigella spp. (sali biliari ritardano la crescita di altri batteri Gram- e inibisce quella dei Gram+).

13 Indagini - Esame colturale - Hektoen enteric agar Elevate concentrazioni di sali biliari: inibiscono gran parte Gram+, ma non Salmonella e Shigella. Fermentazione di carboidrati (lattosio, saccarosio, salicina): differenzia Salmonella e Shigella (non fermentanti) da coliformi (fermentanti, producono colonie gialle-arancio per il viraggio di blu bromotimolo) Produzione di solfuro di idrogeno (H 2 S): in presenza di tiosolfato Salmonella produce H 2 S gassoso che, in presenza di citrato ferrico, precipita formando colonie nerastre o con un centro nerastro. Salmonella enterica on Hektoen enteric agar. Note the black center of the transparent colonies, indicating H 2 S production in the absence of carbohydrate fermentation. Proteus vulgaris on Hektoen enteric agar. Note the yellow-orange colonies, indicating the fermentation of at least one of the carbohydrates present in the medium. The lack of black colonies indicates no H 2 S production.

14 Indagini - Esame colturale Salmonella-Shigella agar Fermentazione del lattosio: gli organismi fermentanti producono acido che, in presenza dell'indicatore rosso neutro, induce la formazione di colonie rosse, mentre i batteri non fermentanti (Salmonella, Shigella) formano colonie incolori. Tiosolfato di sodio e il citrato ferrico consentono di evidenziare la produzione di solfuro di idrogeno da parte delle colonie con aree centrali nere. Questo terreno viene usato per l'isolamento primario di Salmonella nei campioni fecali umani. Meno selettivo per Shigella. S. typhimurium ATCC on SS agar agar. Note the black center of the transparent colonies, indicating H2S production in the absence of carbohydrate fermentation.

15 Indagini - Esame colturale Isolamento di E. coli O157:H7 (responsabile di coliti emorragiche legate alla produzione di una tossina citotossica) Terreni differenziali (McConkey + sorbitolo, terreno cromogenico per E.coli O 157) I terreni per rilevare stipiti di E.coli O157sorbitolo-negativi includono Sorbitol MacConkey agar (SMAC) e una variante di questo contenente cefixime e tellurito (CT-SMAC). CHROMagar O157 rileva il sierogruppo O157 mentre CHROMagar STEC rileva sia O157 che altri sei sierogruppi prevalenti di STEC (O26, O45, O103, O111, O121, O145). Data l ormai accertata pluralità dei sierotipi dei ceppi che causano infezioni in Italia, l orientamento è quello di ricorrere comunque alla dimostrazione diretta della presenza nelle feci delle shiga-like tossine mediante test immunoenzimatici o dei geni che le codificano mediante test molecolari basati sulla PCR.

16 Indagini - Esame colturale Isolamento di Campylobacter. l isolamento di Campylobacter e di batteri di generi correlati dipende dagli agenti antimicrobici presenti nei substrati colturali (C. upsaliensis, H. fennelliae sono sensibili alla cefalotina), dall incubazione in ambiente microaerofilo (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2 ), alla temperatura di 42 C, che inibisce la crescita del normale microbiota. Possono essere utilizzati differenti terreni selettivi: Skirrow, Karmali, Blaser Wang, Butzler, Preston, Bolton, CCDA (blood free agar). È recente l introduzione di substrati cromogenici, per l isolamento e la differenziazione di Campylobacter da campioni clinici fecali. Possono anche essere impiegate procedure di arricchimento mediante substrati liquidi (Campy-THIO) nel caso si sospettino basse cariche microbiche (portatori, pazienti post-sintomatici od in terapia antibiotica). Possono essere impiegati metodi d isolamento alternativi: mediante membrane filtranti è possibile ottenere l isolamento di specie di Campylobacter incapaci di crescere a 42 C o su terreni selettivi.

17 Indagini - Identificazione In base ai terreni utilizzati, le colonie sospette vanno sottoposte a identificazione biochimica ed a conferma sierologica mediante antigeni somatici. I laboratori di riferimento regionale potranno completare la caratterizzazione degli stipiti mediante una sierotipizzazione con antigeni flagellari. Salmonella spp.: le colonie identificate biochimicamente e confermate sierologicamente (antisiero polivalente) vengono sottoposte a tipizzazione sierologica secondo lo schema aggiornato di Kauffmann-Withe che prevede la caratterizzazione di una fase somatica (gruppi A-E) e di una flagellare (fasi 1 e 2). E. coli: non ci sono specifici test biochimici che consentono di differenziare i ceppi enteropatogeni da quelli non patogeni. La tipizzazione di questi microrganismi è riservata esclusivamente a Centri di riferimento e si basa su metodi fenotipici (sierotipizzazione) e molecolari. Alcuni sierotipi sono più frequentemente associati con EPEC, ETEC, EIEC, EHEC e EAEC ma per una identificazione definitiva si deve procedere, su campioni di feci o su colonia, alla determinazione di specifici fattori di patogenicità (fattori di adesività, entero-citotossicità, invasività, ecc.) indagini, per lo più molecolari, attualmente per lo più riservate a Laboratori di riferimento.

18 Indagini Emocoltura, Sierodiagnosi In caso di sospetta febbre enterica (tifoide, paratifoide) le indagini vanno integrate con emocolture e sierodiagnosi di Widal.

19 Indagini Ricerca antigeni/tossine C. difficile Determinazione dell antigene comune (glutammato deidrogenasi - GDH) proteina non tossinica. Test dotato di buona sensibilità che, in caso di positività, richiede conferma con un test più specifico per la dimostrazione della presenza di stipiti produttori di tossina. Ricerca delle tossine A/B con metodiche immudoenzimatiche (EIA) o immunocromatografiche (IC): consentono di ottenere un risultato in meno di 1 ora. Rispetto al test antigenico, il rilevamento delle tossine risente maggiormente delle modalità di conservazione del campione: le tossine si degradano rapidamente se il campione non viene conservato a 2-8 C. E. coli Immunodosaggio per la ricerca di antigeni O157 e H7 direttamente da feci o da brodi di arricchimento colturali. Non raccomandato come test di prima linea per il mancato rilevamento di STEC non-o157 e per il possibile rilevamento di E. coli O157 non produttori di Shiga tossine. Test immunoenzimatici, immunocromatografici o molecolari basati sulla PCR per la ricerca nelle feci delle shiga tossine o dei geni che le codificano.

20 Indagini Antibiogramma Terapia antibiotica generalmente non indicata per il trattamento di pazienti affetti da gastroenterite batterica in quanto solitamente a risoluzione spontanea. In alcuni casi può essere indicato il trattamento in relazione all ospite come nel caso di infezione di STEC che pone il paziente a maggior rischio di HUS, o per Salmonella con il rischio di ricadute e di persistenza come portatori. I test di sensibilità non sarebbero quindi indicati per batteri isolati da feci, salvo alcune eccezioni come bambini sotto 6 mesi, i pazienti anziani o immunocompromessi o pazienti con malattie croniche. In qualsiasi caso l isolamento di Salmonella typhi o S. paratyphi così come l isolamento di altri patogeni enterici da siti extraintestinali dovrebbe richiedere l esecuzione dei saggi di sensibilità.