Corso di micobatteriologia avanzata

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1 Myco-09: Corso di micobatteriologia avanzata Tubercolosi, una malattia antica Mycobacterium tuberculosis: esame microscopico, terreni di coltura, esame colturale Mirella Tronci Firenze Università degli Studi Ospedale Careggi Scheletro, risalente a oltre anni, ritrovato in un insediamento dell et età del bronzo nel Kent con segni riferibili a tubercolosi ossea Tubercolosi una malattia attuale: anno 2009 Tubercolosi una malattia romantica Tubercolosi una malattia romantica E. Munch Death in the sickroom Tubercolosi una malattia dei poveri 1

2 Tubercolosi una malattia della casa Tubercolosi una malattia dei ricchi TUBERCOLO malattia ereditaria I I barbari nell evo evo antico ed i semibarbari nostri contemporanei, hanno in questo più ragione di noi. Gli antichi scozzesi eviravano gli infermi di epilessia, di mania od altro malore che facilmente si trasmette alla prole, segregavano dagli uomini le donne infette da lebbra e altre malattie ereditarie e se alcuna di queste diveniva incinta, viva ed incinta la seppellivano; ; i moderni invece, con una colpevole tolleranza, permettono che idioti ed epilettici e tubercolotici prendan moglie.. La legislazione dell avvenire giudicherà del grado diverso di colpa dei crudeli scozzesi e dei moderni misantropi. Dal codice di Manu ( a.c.): Quando il Dawidja voglia ammogliarsi non cerchi la sua sposa in una famiglia malsana,, come dire affetta da vizio emorroidario, da tisichezza,, da dispepsia, da epilessia, da lebbra bianca, da elefantiasi, ancorché codesta famiglia fosse d alto lignaggio ed estremamente ricca. Tubercolosi una malattia da diagnosticare 24 marzo 1882, Robert Koch annuncia la sua scoperta nel corso della riunione mensile della Physiological Society of BERLIN Tubercolosi una malattia da laboratorio 2

3 Mycobacterium tuberculosis 3

4 Farmaci anti TB da: TUBERCULOS The illustrated history of a disease, by Jacques CHRETIEN, Tuberculosis is back among us; in the few moments since you opened this book and read these first few words, someone, somewhere in the word, male or female, old or young, has died from tuberculosis. If you have lived under the illusion that the disease was conquered half a century ago, when effective drugs first became available, you may be surprised. Recently, of course, there has been talk about the revival of tuberculosis, man s loyal and constant companion since prehistoric times.. Tuberculosis is therefore not an obsolete subject. It is still topical, still dangerous, and its recent reappearance in the world s headlines illustrates the imperfections of the weapons that we possess against it they are fragile, they quickly lose their power, and if not totally useless, they are simply not sufficiently effective. Nuovi Farmaci anti TB???????????? Laboratorio di microbiologia e TB Un corretto management clinico della tubercolosi oggi consente notevoli successi; contemporaneamente le procedure di laboratorio per diagnosticare e monitorare il corso della malattia sono diventate molto più complesse. Queste procedure sono: laboriose, richiedono tempo, conoscenze, reagenti e tecniche specifiche. richiede l adozione di speciali procedure di sicurezza la disponibilità di locali adibiti a questo specifico scopo. M. Tronci Firenze 23 Questo fatto può rappresentare un problema per alcuni laboratori. 4

5 Il perché di un problema 60-70: chiusura dei dispensari riconversione di gran parte degli ospedali specializzati in ospedali generali, 80: rinnovato interesse per la tubercolosi, 80-90: diagnostica microbiologica dei micobatteri introdotta ex novo tra le attività di molti laboratori clinici. Ciascuno di essi processa ancora oggi pochi, pochissimi campioni. 90: Qualità. L acquisizione ed il mantenimento dei livelli di qualità necessari richiedono una pratica continua. 2000: Quando i test diagnostici sono effettuati raramente è certamente impossibile mantenere in condizioni ottimali i materiali e l esperienza, quindi è preferibile rivolgersi a un laboratorio di riferimento accreditato, scelto su base locale o regionale tra quelli di comprovata specifica esperienza. Laboratorio di microbiologia e TB Il contributo del laboratorio di microbiologia alla diagnosi ed al management delle infezioni da micobatteri si estrinseca: nella rivelazione e nell isolamento dei micobatteri da campioni biologici, nell identificazione delle specie isolate, nella determinazione della sensibilità dei microrganismi isolati verso specifici farmaci, nell analisi dei dati a fini epidemiologici e clinici. Laboratorio di microbiologia e TB DOT Paziente Evidenza clinica Queste indagini devono essere effettuate in laboratori in grado di garantire competenza specifica nel campo della micobatteriologia clinica, in altre parole in grado di garantire un processo analitico, una prestazione, di QUALITA. Fondamentale importanza riveste l attenzione con la quale viene, e deve essere, affrontato nella pratica ogni dettaglio del processo diagnostico nel suo complesso e nelle sue varie fasi, preanalitica, analitica e postanalitica oltre che la fase preliminare. Autorità sanitaria Clinico Controllo infezioni Risultati Microbiologo Clinico DOC Campione Organizzazione della comunicazione in tema di tubercolosi Feci Campioni per la ricerca dei micobatteri 1 Materiale Aspirato gastrico Broncoaspirato, BAL, Brushing Espettorato Espettorato indotto Quantità >5/10 ml al mattino a digiuno >5 5 ml 5-10 ml raccolti 3 in giorni al mattino consecutivi 5-10 ml raccolti 3 in giorni al mattino consecutivi >1 1 g N campioni 3 in giorni consecutivi Campioni non idonei Campioni non neutralizzati con carbonato di sodio Saliva, pool di escreati Campioni congelati Pus Campioni per la ricerca dei micobatteri 2 Materiale Liquidi cavitari Liquor Materiale da lesioni cutanee Prelievi bioptici Quantità Almeno ml in provette con eparina >2 2 ml Aspirato con siringa sotto i margini, biopsia alla periferia della lesione >1g di tessuto La massima possibile N campioni Campioni non idonei Materiale coagulato Tamponi Campioni in formalina Tamponi 5

6 Campioni per la ricerca dei micobatteri 3 Campioni per la ricerca dei micobatteri 4 Materiale Midollo osseo Sangue Quantità La massima possibile in provetta con eparina o isolator 10 ml in provetta con eparina o isolator N campioni 3 a distanza di 24 ore l uno l dall altro altro Campioni non idonei Campione coagulato, campione in provetta con EDTA Sangue coagulato, sangue in provetta con EDTA Materiale Sangue mestruale Urine Quantità Alcuni ml raccolti al giorno del flusso in eparina La prima minzione del mattino, almeno 40 ml N campioni 3 in giorni consecutivi Campioni non idonei Sangue coagulato o in EDTA Urine delle 24 ore, urine da sacca Fase analitica: : tipologie di esami In n laboratorio il campione biologico dopo digestione, decontaminazione e concentrazione può essere sottoposto alle seguenti tipologie di esami tradizionali : - Esame microscopico; - Esame colturale; - Identificazione di genere/specie; - Valutazione di Antibioticosensibilità. Fase analitica: : tipologie di esami - Esame microscopico: 4sensibilità 30-65%; risposta entro le 24 ore; semi-quantitativo; speciazione non possibile. - Esame colturale: 4Terreno solido: sensibilità 80-85%; richiede 3-8 settimane; semiquantitativa. 4Terreno liquido: sensibilità 90-95%; richiede 2-8 settimane; solo qualitativa. - Speciazione: identificazione di genere e di specie. - Valutazione di Antibioticosensibilità: 4Verso farmaci di prima scelta; 4Verso farmaci di seconda linea in caso di resistenza ai primi. ESAME MICROSCOPICO ESAME MICROSCOPICO evidenzia la alcool-acido acido resistenza dei microrganismi rinvenuti in un campione biologico; serve per il monitoraggio di pazienti in terapia antimicobatterica; aiuta nella determinazione delle appropriate diluizioni per i test di farmacosensibilità. 6

7 ESAME MICROSCOPICO Colorazione di Ziehl-Neelsen Neelsen. fluorescenza. Diagnosi di infezione da MTB Fase analitica: esame microscopico - Punti di forza 4Veloce (risultati in meno di 24 ore); 4Semplice; 4Economico (~ 0.50 ); 4Specifico per Micobatteri; anche altri batteri che contengono acidi micolici nella parete possono mostrare a.a.r (Nocardia spp; Rhodococcus spp; Corynebacterium; ecc) 4Usato estesamente; - Inoltre, il metodo con Auramina è: 4Adatto per volumi medio alti di attività; 4Veloce e facile. Diagnosi di infezione da MTB Fase analitica: esame microscopico - Punti di debolezza Colorazione di Ziehl Neelsen: 4Sensibilità del 45-60% in campioni respiratori; 4Detection limit tra e U.F.C./ml; 4Necessita la presenza di un microscopista esperto e paziente, richiede infatti dai 10 ai 15 per lettura; 4Alta variabilità interlaboratorio; 4Non è specifico per MTB;non fornisce informazioni sullo stato di vitalità dei micobatteri osservati. 4Non adatto per volumi medio alti (eccetto Auramina). Colorazione con Auramina : 4Detection limit inferiore a Z.N. se viene utilizzato materiale centrifugato o citocentrifugato; 4Richiede l utilizzo di costosi microscopi a fluorescenza. Diagnosi di infezione da MTB Fase analitica: esame microscopico I batteri alcool-acido acido resistenti (BAAR) si colorano con difficoltà a causa dell alto contenuto lipidico della parete batterica. Si pensa che il fenolo disciolga i lipidi sufficientemente da permettere la penetrazione del primo colorante. La parete cellulare trattiene questo anche dopo esposizione agli agenti decoloranti alcool ed acido. Ogni materiale clinico può essere sottoposto ad esame microscopico, che risulta però inutile nel caso del sangue perché l eventuale numero di batteri in esso presente è sempre al di sotto della soglia di sensibilità della microscopia diretta. ESAME MICROSCOPICO preparazione del vetrino E buona norma, se possibile, approntare più preparati per ogni campione in caso di rottura del vetrino o di dubbia interpretazione; Approntare un controllo positivo con un ceppo di M. tuberculosis H37Ra ed uno negativo con un ceppo di un altro batterio, ad esempio E.coli; Usare vetrini ben puliti e sgrassati; I I campioni da esaminare possono essere concentrati oppure no. ESAME MICROSCOPICO Vortexare il sedimento del campione concentrato; Trasferire una parte del campione in esame con un ansa oppure con una pipetta Pasteur; Nel caso di campioni non concentrati cercare di prelevare una parte necrotica o purulenta; Strisciare il materiale in un area di circa 1,5 x 1,5 cm; Non utilizzare lo stesso vetrino per più campioni; Non eseguire uno striscio troppo spesso o troppo sottile; Fare asciugare i vetrini all aria aria sotto la cappa di sicurezza; Fissare i vetrini passandoli alla fiamma del becco Bunsen tre o quattro volte evitando il surriscaldamento, oppure lasciandoli sopra una piastra riscaldante a c c per almeno due ore,, o immergendoli in metanolo per un minuto (rischio cross - contaminazioni). 7

8 ESAME MICROSCOPICO Liquor ESAME MICROSCOPICO colorazioni a base di carbolfucsina In caso di campioni di liquor,, dopo centrifugazione, il sedimento deve essere vortexato,, quindi con una pipetta Pasteur si depone una goccia di esso al centro di un vetrino; Fare asciugare all aria; aria; Ripetere questa procedura altre due volte deponendo sempre una goccia sopra la precedente asciugata; Fissare il vetrino; Disponendo di una citocentrifuga eseguire il preparato utilizzando almeno 200 microlitri di liquor e fissare normalmente. COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN (carbolfucsina a caldo) COLORAZIONE DI KINYOUN (carbolfucsina a freddo) COLORAZIONE DI ZIEHL- NEELSEN COLORAZIONE DI KINYOUN reattivi Colorazioni a base di carbolfucsina: reattivi Carbolfucsina: - Soluzione A: sciogliere 0,3 g di fucsina basica in 10 ml di etanolo al 95% - Soluzione B: sciogliere 5,0 g di fenolo in 100 ml di acqua distillata - Soluzione di lavoro: : unire la soluzione A a 90 ml della soluzione B. Carbolfucsina di Kinyoun : - Soluzione A.: A sciogliere 4,0 g di fucsina basica in 20 ml di etanolo al 95% - Soluzione B : sciogliere 8 g di cristalli di fenolo in 100 ml di acqua distillata - Soluzione di lavoro: : unire la soluzione A alla soluzione B Decolorante: Unire 3 ml di acido cloridrico concentrato a 97 ml di etanolo al 95%; Colorante di contrasto: : ( Bleu di Metilene ) Sciogliere 0,3 g di bleu di metilene in 100 ml di acqua distillata. COLORAZIONE A CALDO: procedimento Ricoprire il vetrino, precedentemente fissato, con carbolfucsina versata attraverso carta da filtro per evitare la formazione di eventuali cristalli; Scaldare il vetrino passando sotto di esso la fiamma di un becco Bunsen finché non compaiano i primi vapori; Lasciare agire per 5 minuti, se il colorante dovesse essiccarsi è sufficiente aggiungerne altro; Risciacquare il vetrino con acqua di fonte. COLORAZIONE A CALDO: procedimento Coprire il vetrino con la soluzione decolorante al 3% di acido in alcool e lasciare decolorare per 2 minuti; Risciacquare ed eliminare l eccesso l di acqua; Ricoprire il vetrino con il bleu di metilene e lasciare per 1 minuto; Risciacquare e fare asciugare all aria. aria. 8

9 COLORAZIONE A FREDDO: procedimento Ricoprire il vetrino precedentemente fissato con carbolfucsina di Kinyoun versata attraverso carta da filtro; Lasciare agire per 5 minuti; Sciacquare il vetrino con acqua di fonte; Coprire con la soluzione decolorante al 3% di acido in alcool e lasciare decolorare per 2 minuti; Risciacquare ed eliminare l acqua l in eccesso; Ricoprire il vetrino con il bleu di metilene e lasciare per 1 minuto; Sciacquare e lasciare asciugare all aria. aria. Colorazione con AURAMINA O: O reattivi Soluzione A: sciogliere 0,1 g di auramina O in 10 ml di etanolo; Soluzione B: sciogliere 3.0 g di cristalli di fenolo in 87 ml di di acqua distillata; Soluzione di lavoro: : unire la soluzione A con la soluzione B. AURAMINA O: reattivi Decolorante: : aggiungere 0,5ml di acido cloridrico a 100 ml di etanolo al 70%; Colorante di contrasto: Permanganato di potassio preparato sciogliendone 0,5 g in 100 ml di acqua distillata. N.B: : tutti i coloranti e gli altri reattivi così preparati possono essere conservati per 3 mesi a t.a. COLORAZIONE CON AURAMINA O: procedimento Coprire il vetrino con Auramina O e lasciare agire per 15 minuti; Sciacquare con acqua; Coprire con acido-alcool alcool allo 0,5% e lasciarlo 2 minuti; Sciacquare con acqua; Versare la soluzione di permanganato di potassio e farla agire per 2 minuti; Sciacquare e fare asciugare all aria aria Leggere entro 24 h. con obiettivi 30-50x. 9

10 Automazione della colorazione Nei laboratori che giornalmente processano un numero elevato di campioni può essere previsto l utilizzo di coloratori automatici. Questi strumenti consentono di colorare con tecnica di Ziehl-Neelsen, Kinyoun e auramina senza esposizione a vapori tossici, secondo il principio della nebulizzazione o dell immersione nel colorante. Per consentire un buon funzionamento è fondamentale l esecuzione sistematica di operazioni di lavaggio e manutenzione dello strumento a fine seduta. REFERTAZIONE Ziehl Neelsen Auramina Refertare massimo entro 24h lavorative dall arrivo del campione in laboratorio. La positività microscopica di pazienti non noti deve essere comunicata tempestivamente al clinico per permettere l immediato isolamento del paziente. Quando non si osservano batteri dopo un osservazione attenta e prolungata (almeno 100 campi microscopici), refertare come Negativa la ricerca microscopica di batteri acido-alcool resistenti Se l esame microscopico e positivo dare una valutazione della positività come segue: obiettivo 100x obiettivo 40x Referto n BAAR / c. m. 1-2 / / 70 Dubbio (ripetere) 1-9 / / / / /campo 4-36 /campo 3+ >9 /campo >36 /campo 4+ da:kent, P.T.,and G.P. Kubica Public Health Mycobacteriology: a Guide for the Level III Laboratory 10

11 ESAME COLTURALE ESAME COLTURALE I campioni da sottoporre a coltura, possono essere di due tipi: a) contaminati dalla flora residente; b) con contaminati perché provenienti da siti sterili. ESAME COLTURALE CAMPIONI CONTAMINATI - Espettorato - Aspirato gastrico - Tamponi o aspirati laringei - Lavaggio gastrico - Urine - Lavaggi, aspirati o brushing bronchiali - Feci - Cute - Prelievi autoptici - Sangue mestruale CAMPIONI STERILI - Sangue - Midollo osseo - Versamenti cavitari - Biopsie, tessuti e campioni chirurgici - Liquor cefalo-rachidiano - Urine da puntura sovrapubica - Aspirati da puntura transtracheale ESAME COLTURALE campioni contaminati I campioni contaminati richiedono un processo di decontaminazione e, qualora si tratti di materiali non omogenei, come l espettorato, di digestione ed omogeneizzazione, quindi, di concentrazione. La decontaminazione può influire sulla vitalità degli stessi micobatteri, perciò, è buona regola scegliere sempre la procedura decontaminante più dolce possibile. I campioni sterili richiedono soltanto un processo di concentrazione. DIGESTIONE DECONTAMINAZIONE Metodiche NaOH 4% NaOH 2% + N-acetil-L-cisteina Dodecil-solfato di Na Ammoni quaternari Acido ossalico Acido solforico. DIGESTIONE DECONTAMINAZIONE N-acetil-L-cisteina Preparare la soluzione decontaminante (50 ml citrato trisodico 0,1 M + 50 ml NaOH 4% + 0,5 g NALC). Mettere a contatto campione + decontaminante x 15 a t.a. Neutralizzare la soluzione (tampone fosfato ph 6,8) Centrifugare x 15 a 3000 x g Decantare e risospendere in albumina 0,2% Utilizzare il campione trattato x striscio e semina. 11

12 DIGESTIONE DECONTAMINAZIONE Controllo di qualità Per controllare la capacità decontaminante dei reagenti si seminano 3 o 4 campioni di espettorato trattati su una piastra di agar- sangue. Dopo 48h a 35 C si dovrebbero sviluppare solo rarissime colonie di batteri. E necessario registrare la percentuale di campioni contaminati. Una percentuale accettabile di inquinamento va dal 3 al 5%; inferiore al 3% denota un processo di decontaminazione troppo energico; superiore al 5% una decontaminazione troppo debole o una incompleta fluidificazione. Colture contaminate Quando si verifichino ripetuti casi di contaminazione di colture effettuate da campioni dello stesso paziente, si deve pensare che le normali procedure di decontaminazione non sono sufficienti. In questi casi si può ricorrere ad altri metodi: nel caso di espettorato, al metodo dell acido ossalico, nel caso delle urine, al metodo dell acido solforico. Terreni di coltura TERRENI DI COLTURA TERRENI DI COLTURA La scelta di un terreno di coltura dipende da molti fattori. Un terreno ideale deve a) permettere una crescita rapida e rigogliosa dei micobatteri, b) deve inibire quanto possibile lo sviluppo della flora contaminante, c) deve essere economico. Attualmente sono disponibili validi sistemi automatizzati e semi automatizzati che posseggono molte delle suddette caratteristiche; la scelta si basa sulle preferenze personali e sulla tradizione del laboratorio, tuttavia rimane l importanza fondamentale dei terreni tradizionali liquidi e solidi di uso manuale sia per l isolamento primario che nelle fasi successive dell identificazione e dell esecuzione dei test di farmacosensibilità. Terreni solidi a base di uovo a base di agar selettivi Terreni liquidi 12

13 TERRENI DI COLTURA SOLIDI A BASE DI UOVA (1) A BASE DI AGAR (2) Lowenstein-Jensen Petragnani American Thoracic Society IUTM * Middlebrook 7H10 ** Middlebrook 7H11 (1): a base di uova fresche, fecola di patate, sali, glicerolo e come inibitore verde di malachite in concentrazione variabile nei vari tipi. (2): *Middlebrook 7H9, a base di sali, vitamine, ac oleico, albumina, catalasi, glicerolo al 2% e destrosio, rappresenta la base cui vengono aggiunti agar e verde di malachite; ** con aggiunta di idrolisato di caseina 0,01% VANTAGGI E LIMITI DEI TERRENI A BASE DI UOVA VANTAGGI: a) Possono essere conservati per molti mesi in frigorifero e il tappo a vite minimizza l evaporazione; b) Il L.J. fornisce un grande numero di risultati positivi, perché è un ottimo supporto nutritizio per la crescita di M. tuberculosis, un po meno degli altri micobatteri; LIMITI: a) In caso di contaminazione viene coinvolta in genere tutta la superficie del tubo; b) Occorrono almeno 3-6 settimane o più per lo sviluppo della crescita. c) La conta delle colonie è problematica a causa della ridotta superficie del becco di clarino. d) La crescita di molte specie (es. M. avium complex) non è soddisfacente. VANTAGGI E LIMITI DEI TERRENI A BASE DI AGAR VANTAGGI: a) Sono meno facilmente contaminati poiché sono di più semplice formulazione rispetto al L.J. b) Essendo trasparenti permettono una rilevazione più rapida della crescita e del numero di colonie (le microcolonie su piastra si osservano al microscopio). LIMITI: a) Il terreno, contenuto in piastre, tende più facilmente ad essiccarsi durante l incubazione (inserire le piastre in sacchetti di plastica). b) L esposizione del terreno alla luce naturale provoca il rilascio di formaldeide, che inibisce la crescita dei micobatteri c) Necessitano di incubazione in presenza di CO 2. ESAME COLTURALE Semina ed incubazione Tutti i terreni di coltura vanno esaminati dopo una settimana di incubazione per verificare l eventuale presenza di micobatteri a rapida crescita o di contaminanti. L incubazione va protratta per 8 settimane e i tubi si esaminano settimanalmente per rilevare la crescita. Le piastre di agar 7H10-7H11, permettono una rilevazione più rapida della crescita con l osservazione eseguita, inizialmente a piastra capovolta al microscopio a piccolo ingrandimento, poi ad occhio nudo. esame colturale: parametri per la refertazione quantitativa della crescita in terreno solido Numero di colonie in terreno solido Nessuna colonia <50 colonie colonie colonie colonie > 500 colonie negativa la coltura per micobatteri riportare il numero di colonie contate Referto 13

14 Diagnosi di infezione da MTB Fase analitica: esame colturale Esame colturale in terreno solido: punti di forza 4Sensibilità molto alta (ancor maggiore se combinata con coltura liquida); 4Specifico per Micobatteri; 4Economico (~ 3,50 ); 4Semplice da eseguire, ben sperimentato, usato su larga scala; 4Adatto a tutti i tipi di campioni; 4Consente di apprezzare i caratteri delle colonie; 4Evidenzia eventuali inquinamenti; 4Consente la speciazione e l esecuzione dei test di sensibilità agli antibiotici dei ceppi cresciuti. Diagnosi di infezione da MTB Fase analitica: esame colturale Esame colturale in terreno solido: punti di debolezza 4Lunghi tempi di risposta (da 2 a 6 settimane in relazione alla carica batterica ed alle caratteristiche del batterio); 4Richiede regolare controllo della crescita; 4Richiede controllo accurato della procedura (dalla raccolta alla semina attraverso tutte le fasi intermedie); 4La resa dipende dalla qualità del campione processato; 4Possibili falsi positivi in seguito a contaminazione; 4Possibili falsi negativi dovuti a: 1)specie a lenta crescita, 2) specie provenienti da soggetti già sottoposti a terapia antibiotica. E raccomandato l uso di più di un mezzo di coltura per aumentare la sensibilità del metodo. TERRENI DI COLTURA N.B.: Nessun terreno di coltura è ideale per ogni campione e in ogni circostanza, perciò si consiglia la semina di almeno due tipi di terreno, uno all uovo e/o uno a base di agar a cui va aggiunto un terreno liquido (Middlebrook 7H9 o i suoi derivati BACTEC 12B, MGIT, ecc ). Il terreno liquido è di fondamentale importanza non soltanto per la rapidità della crescita, ma anche perché alcune specie di micobatteri vi crescono decisamente meglio (M. avium-intracellulare), o addirittura esclusivamente (M. genavense). Tenover F.C., Crawford J.T., Huebner R.E et al. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? Apr J. Clin. Microbiol., 41: National Center for Infectious Disease and National Center for Prevention Service, Centers for Desease Control and Prevention - Atalanta RECOMMENDATION TO MAXIMIZE MYCOBACTERIAL RECOVERY Inoculate a liquid medium as primary culture, and include inoculation of a slant of Lowenstein-Jensen medium. TERRENI LIQUIDI STEMI MANUALI Terreni: Middlebrook 7H9 Brodo di Dubos Sistemi di coltura: MB Redox MGIT * Middlebrook 7H9, a base di sali, vitamine, ac oleico, albumina, catalasi, glicerolo al 2% e destrosio rappresenta il terreno base per molti sistemi di coltura manuali o automatizzati di coltura TERRENI LIQUIDI MB Redox. Il sistema MB Redox (Biotest)) utilizza una provetta di vetro munita di tappo a vite dotato di un setto di gomma per l'eventuale inoculo con siringa. Essa contiene terreno di Kirchner modificato con l aggiunta di glucosio, siero di cavallo, complessi vitaminici, OADC, e catalasi.. Il sistema rivelatore è costituito da un sale incolore di tetrazolio che i micobatteri in attiva crescita riducono a formazano, composto insolubile di colore rosa, rosso o violetto. Quest ultimo ultimo si deposita sulla superficie delle microcolonie rendendole visibili come particelle colorate.. Incubare x 8 settimane a 37 C. Tempo medio crescita 18,9 giorni. Eseguire vetrino per verificare presenza di b.a.a.r.. Il sistema non è utilizzabile per la valutazione della sensibilità ai farmaci antitubercolari.. Le provette MB Redox sono pronte all uso e contengono, oltre al terreno di Kirchner,, una miscela di antimicrobici costituita da polimixina B, amfotericina B, carbenicillina e trimetoprim.. Devono essere conservate a 2-8 C. 2 14

15 TERRENI LIQUIDI MB Redox TERRENI LIQUIDI MGIT Metodo fluorimetrico (MGIT) Il sistema MGIT (Becton Dickinson) utilizza una provetta di plastica con tappo a vite contenente 4 ml di brodo 7H9 con 0,25% di glicerolo che viene successivamente addizionato con OADC e con la miscela antibiotica PANTA. Alla base della provetta è adeso, in un film di silicone, un sale metallico di rutenio che è fluorescente e sensibile alle variazioni della concentrazione di O 2. L elevato contenuto iniziale di O 2 nella provetta inattiva la fluorescenza, ma il consumo di O 2 operato dai micobatteri durante la crescita determina la comparsa di una intensa fluorescenza arancio, all altezza del fondo e del menisco, quando la provetta è esposta a raggi ultravioletti. TERRENI LIQUIDI MGIT Indicator System Metodo fluorimetrico (MGIT). In questo terreno possono essere seminati tutti i tipi di campioni ad eccezione del sangue e dei campioni fortemente ematici perché la fluorescenza viene neutralizzata dalla presenza del sangue.. Il sistema può essere usato anche per la valutazione della sensibilità ai farmaci antitubercolari.. Incubare i tubi x almeno 6 settimane a 37 C.. Per la lettura esporre i tubi alla luce di una lampada di Wood o ad un transilluminatore per evidenziare la fluorescenza. Eseguire vetrino per controllo presenza b.a.a.r.. Tempo medio di crescita è di circa 15 giorni. Negative Culture O 2 O 2 O CO 2 2 O 2 O2 O 2 CO 2 O O 2 2 CO 2 O 2 FO F FO 2 FO 2 FO 2 2FO2 F FO2 F FO2 Little or No Fluorescence Positive Culture Headspace O 2 O 2 Broth O 2 O 2 O 2 CO 2 Sensor F FO F F F 2 F F F FO 2 F Strong Fluorescence Provette MGIT negativo e positivo TERRENI LIQUIDI STEMI AUTOMATICI Terreni: Middlebrook 7H9 modificato a seconda dei metodi Middlebrook 7H12 Sistemi di coltura: BACTEC 460 TB MGIT 960 BacT ALERT 3D Versa TREK BACTEC 9000 MB 15

16 esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB) la produzione di CO 2 radiomarcata viene rilevata da un β counter. Metodo fluorimetrico (MGIT 960) la fluorescenza di un composto, inibita dalla presenza di ossigeno nel terreno, viene evidenziata per effetto del consumo di ossigeno. Metodo colorimetrico (BacT ALERT 3D) la produzione di CO 2 fa virare un sensore che a sua volta modifica l intensità di un raggio di luce riflessa. Metodo pressometrico (Versa TREK) l aumento di pressione, dovuto a produzione di gas, viene rilevato da un manometro. BACTEC 460 TB Tecnologie di rivelazione: Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB) Utilizza flaconi sigillati contenenti 4 ml di brodo 7H12 (BACTEC 12B) composto da Middlebrook 7H9 modificato con l aggiunta di albumina bovina, idrolisato di caseina, catalasi ed acido palmitico 14Cradiomarcato. Quest ultimo è metabolizzato dai micobatteri in crescita che rilasciano anidride carbonica 14C-radiomarcata (14CO 2 ). La quantità di 14CO 2 presente nell atmosfera confinata delle boccette è rilevata da un ß-counter che converte la concentrazione del gas in un indice di crescita (Growth Index [G.I.]) che è proporzionale al numero di micobatteri vitali presenti nella coltura. Se impiegato per l isolamento, il terreno 7H12 deve essere addizionato con la miscela di antibiotici PANTA BACTEC 460 TB Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB) Caratteristiche del sistema:. Il sistema BACTEC 460 TB permette una rapida rilevazione della crescita micobatterica e presenta una elevata sensibilità anche per quanto riguarda i batteri provenienti da campioni negativi all esame microscopico.. L incubazione dei campioni condotta al di fuori dallo strumento deputato al rilevamento, consente l incubazione delle colture a temperature differenti, scelte sulla base del sospetto clinico.. Il sistema può essere utilizzato anche per l esecuzione del test di farmaco-sensibilità.. Il sistema richiede l uso di sostanze radioattive soggette a particolari normative di trasporto, detenzione, conservazione e smaltimento.. L uso di aghi per l inoculo dei campioni comporta rischi di incidente biologico e difficoltà di semina per i materiali non finemente omogeneizzati. Esiste inoltre il rischio di contaminazione crociata, per trascinamento da un flacone positivo al successivo, legato al sistema di rilevamento invasivo (perforazione del setto di gomma dei flaconi operata dagli aghi dello strumento durante la lettura). esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo fluorimetrico (MGIT 960) Il sistema MGIT (Becton Dickinson) utilizza una provetta di plastica con tappo a vite contenente 4 ml di brodo 7H9 con 0,25% di glicerolo che viene successivamente addizionato con OADC e con la miscela antibiotica PANTA. Alla base della provetta è adeso, in un film di silicone, un sale metallico di rutenio che è fluorescente e sensibile alle variazioni della concentrazione di O 2. L elevato contenuto iniziale di O 2 nella provetta inattiva la fluorescenza, ma il consumo di O 2 operato dai micobatteri durante la crescita determina la comparsa di una intensa fluorescenza arancio, all altezza del fondo e del menisco, quando la provetta è esposta a raggi ultravioletti. Le provette inserite nello strumento BACTEC MGIT 960 vengono incubate a 37 C e monitorate ogni 60 minuti per rilevare l eventuale aumento di fluorescenza. Un algoritmo individua, sulla base della variazione di intensità della fluorescenza, i campioni positivi che vengono notificati con segnali acustico e luminoso. esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo fluorimetrico (MGIT 960) Caratteristiche del sistema:. Il sistema è completamente automatico, non invasivo non radiometrico, e utilizza provette di plastica con tappo a vite il cui inoculo non richiede l utilizzo di aghi.. Può essere utilizzato per l esecuzione dei test di farmaco-sensibilità.. Il sistema non può essere utilizzato per le emocolture o per campioni fortemente contaminati da sangue poiché la fluorescenza viene neutralizzata dalla presenza di quest'ultimo. La percentuale di contaminazioni è mediamente non inferiore 6-7%.. Per i campioni in cui si sospetti la presenza di micobatteri con optimum di crescita a temperature diverse da 37 C, è necessario incubare, al di fuori dell apparecchio, una seconda provetta MGIT alla temperatura richiesta; questa verrà letta manualmente a luce ultravioletta o mediante un apposito lettore di provette singole. 16

17 Indicator System Negative Culture O 2 O 2 O CO 2 2 Headspace Positive Culture O 2 O 2 MGIT 960 O 2 O2 O 2 CO 2 Broth O 2 O 2 O O 2 2 CO 2 O 2 O 2 CO 2 FO F FO 2 FO 2 FO 2 2FO2 F FO2 F FO2 Sensor F F F F FO 2 F F F FO 2 F Little or No Fluorescence Strong Fluorescence esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo colorimetrico (BacT ALERT 3D) Il sistema BacT ALERT 3D (biomérieux) è totalmente automatico e non radiometrico. Utilizza flaconi di due tipi di cui uno dedicato esclusivamente alla coltura di campioni ematici. Il flacone da utilizzare per i campioni diversi da sangue contiene 10 ml di brodo Middlebrook 7H9 arricchito con caseina, sieroalbumina bovina e catalasi. Al terreno contenuto nei flaconi devono essere aggiunti, prima della semina, 0,5 ml di miscela antibiotica e di fluido di ricostituzione. Al fondo di ogni flacone è presente un sensore permeabile ai gas che vira progressivamente dal verde al giallo in presenza di CO 2 prodotta da microrganismi in fase attiva di crescita. I flaconi sono incubati all interno dello strumento BacT ALERT 3D in celle apposite che presentano alla base una unità di lettura dotata di un reflettometro elettronico che registra le variazioni colorimetriche dei flaconi. I valori rilevati sono trasmessi ogni 10 minuti ad un computer che segnala i flaconi in cui è presente crescita. La positività viene segnalata dallo strumento con un segnale visivo ed acustico. esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo colorimetrico (BacT ALERT 3D) Caratteristiche del sistema:. Il sistema è esente da rischio di cross-contaminazioni e la gestione dei dati è totalmente computerizzata.. È utilizzabile anche per l esecuzione del test di farmaco-sensibilità.. Non è possibile l incubazione a temperature differenziate per favorire la crescita di specie con esigenze particolari.. Sono stati segnalati falsi negativi in campioni provenienti da pazienti in trattamento con farmaci antimicobatterici. Sembra che, in questi casi, i micobatteri cresciuti in coltura non siano in grado di produrre sufficienti quantità di CO 2 da risultare rilevabili dallo strumento.. L inoculo dei campioni avviene tramite siringa. Questa procedura, oltre ad essere pericolosa per l'operatore, è causa di difficoltà di inoculo in presenza di materiale non finemente omogeneizzato. esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo pressometrico (Versa TREK) VersaTREK Culture System II (TREK Diagnostic Systems) è un sistema automatico, non radiometrico, a rivelazione pressometrica, che permette la coltura di micobatteri da tutti i materiali, sangue compreso. Il terreno utilizzato, contenuto in flaconi di vetro al cui interno sono presenti spugne di cellulosa che fungono da supporto meccanico per la crescita batterica, è a base di brodo Middlebrook 7H9 addizionato di casitone, glicerolo e bicarbonato di sodio. Ad ogni flacone deve essere aggiunto un supplemento di crescita e, per i campioni provenienti da siti non sterili, una miscela di antibiotici. La tecnologia VersaTREK è basata sul rilevamento dei cambiamenti di pressione che avvengono nello spazio sovrastante il terreno di coltura presente all interno del flacone. Tali cambiamenti sono dovuti al consumo di O 2 ed alla produzione di gas che accompagnano l eventuale crescita batterica.. 17

18 esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo pressometrico (Versa TREK) Lo strumento VersaTREK Culture System II rileva la crescita micobatterica monitorando automaticamente ogni 24 minuti le variazioni pressorie all interno del flacone tramite un connettore (applicato al flacone subito dopo l inoculo) che lo collega allo strumento. Questa informazione è utilizzata per generare una curva di crescita che, analizzata in base ad un algoritmo interno, permette di stabilire lo stato del campione. La positività viene notificata con un segnale visivo. Caratteristiche del sistema: Il sistema è adatto per ogni tipo di materiale compresi i campioni ematici.. Può essere usato anche per l esecuzione del test di farmacosensibilità.. Non è possibile l incubazione a temperature differenziate.. Utilizza aghi per le procedure di inoculo. Questa procedura, oltre ad essere pericolosa per l'operatore, è causa di difficoltà di inoculo in presenza di materiale non finemente omogeneizzato. VersaTREK VersaTREK 528 VersaTREK 240 esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo fluorimetrico (BACTEC 9000 MB). Il sistema BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson) è automatico, non radiometrico, e permette la coltura per micobatteri da tutti i materiali compreso il sangue. Questo sistema utilizza il brodo Middlebrook 7H9 modificato con l aggiunta di idrolisato di caseina, citrato ferrico di ammonio, glicerolo e Tween 80. Al flacone così composto deve essere addizionata una miscela di antibiotici per eliminare la crescita dei contaminanti. Il sistema rivela i cambiamenti nella concentrazione di O 2. Ogni flacone contiene un disco di silicone impregnato con un sale di rutenio che si comporta da sensore ossigeno-specifico. L elevato contenuto iniziale di O 2 nel flacone inattiva la fluorescenza ma il consumo di O 2 operato dai micobatteri durante la crescita determina la comparsa di fluorescenza quando la provetta è esposta a raggi ultravioletti. La positività è segnalata tramite allarmi visivo ed acustico. esame colturale su terreno liquido Tecnologie di rivelazione: Metodo fluorimetrico (BACTEC 9000 MB) Caratteristiche del sistema:. Il sistema è completamente automatico, non radiometrico, non invasivo, esegue un monitoraggio continuo della crescita e consente la gestione computerizzata dei dati.. È adatto ad ogni tipo di materiale compresi i campioni ematici.. Non è possibile l incubazione di flaconi a temperature diverse da 37 C.. Il sistema non è utilizzabile per eseguire il test di sensibilità ai farmaci. BACTEC 9000MB Caratteristiche Formato Radiometria Emocolture Rilevamento Volume dell' inoculo (ml) Capacità Volume del terreno (ml) Gestione dati Antibiogramma Tempi medi di detection (gg.) Valutazione comparativa dei sistemi automatici attualmente disponibili in Italia BACTEC 460TB semiauto matico 14 CO 2 0,5-4 NO MGIT 960 automatico NO NO fluorimetrico 0, BACTEC 9000 automatico NO fluorimetrico 0,5-1, NO VersaTREK automatico NO pressometri co 0,5-1,0 128/256/384 12, BacTAlert automatico NO colorimetrico 0,5 120/ * * non approvato dalla US-FDA 18

19 Emocoltura per micobatteri Emocoltura per micobatteri Poiché i micobatteri, quando sono presenti nel sangue lo sono in bassa carica ed in maniera intermittente, il sangue non può essere considerato il materiale di elezione per diagnosticare un'infezione da micobatteri. È perciò importante che la richiesta di emocoltura sia basata su fondati sospetti clinici. La sepsi da micobatteri tubercolari è comunemente associata a tubercolosi miliare,, le sepsi da micobatteri non tubercolari sono più frequenti in corso di AIDS o comunque in presenza di grave compromissione del sistema immunitario. Le specie più frequentemente isolate appartengono, in ordine di frequenza, al Mycobacterium avium complex ed al Mycobacterium tuberculosis complex. Accanto al classico prelievo ematico mediante puntura venosa può essere praticata una mielocoltura e, nel caso di sospetta tubercolosi dell apparato genitale femminile, la coltura del sangue mestruale. A causa della paucibacillarità dei campioni ematici non è utile l esecuzione l dell esame esame microscopico ed è consigliabile prolungare il tempo di incubazione delle colture almeno per otto settimane, anche nei sistemi i cui protocolli prevedano incubazioni più brevi. Sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza di M. genavense. Emocoltura per micobatteri La coltura può essere sostituita? Semina diretta del sangue in flaconi dedicati BacTAlert MB blood Bactec MYCO/F Lytic Semina dopo lisi-centrifugazione (sistema ISOLATOR) su terreno solido (uovo o sintetici) sui terreni liquidi impiegati dai sistemi automatizzati. tempi di risposta lunghi; possibili inquinamenti; problemi organizzativi e di sicurezza per il laboratorio. Risposta al quesito Laboratorio di oggi e domani La coltura rimane ancora il test di riferimento per la diagnosi microbiologica della tubercolosi; i test molecolari sono utili complementi ma sono lontani i tempi in cui potranno sostituirla. I risultati dei test molecolari devono essere sempre interpretati alla luce dei dati clinici e dei risultati della microbiologia tradizionale. Deve definire linee guida diagnostiche insieme ai clinici e scegliere il tipo di tecnologia da utilizzare 19

20 ALCUNE LINEE GUIDA CDC Original TB Guidelines, 1994 CDC Original Guidelines CDC Federal Register notice CDC Notice, December 6, 2004 CDC Draft TB Guidelines CDC 2005 Draft Guidelines, Revised APIC comments to CDC APIC Comments, February 4, 2005 Risposta al quesito: cosa può il clinico attendersi dal laboratorio di microbiologia? DOT Paziente Evidenza clinica Autorità sanitaria Clinico Risultati Linee Linee guida guida Microbiologo Clinico DOC Campione TB: non più un problema diagnostico da urlo Controllo infezioni Organizzazione della comunicazione in tema di tubercolosi E. Munch The scream 20