Applicazioni cliniche dei marcatori molecolari nel nodulo tiroideo
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1 Applicazioni cliniche dei marcatori molecolari nel nodulo tiroideo
2 cytology 15 20% FNAB inconclusive or unable to discriminate between follicular adenoma and carcinoma RNA rearrangement studies DNA somatic mutation analysis need for partial or total thyroidectomy for diagnostic purposes Riesco-Eizaguirre et al. Clin Transl Oncol 2007, 9:
3 BRAF V600E point mutation [K601E and V599Ins] ü 45-80% of PTC, mainly tall cell and classic hystology ü h extrathyroidal invasion ü higher stage ü h recurrence (with reduced I up-take) ü h de-differentiation Lupi et al. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92:4085 DNA resticted to PTC Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83
4 BRAFV600E molecular test somatic mutation analysis pyrosequencing Kim et al. J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:658 MASA Pelizzo et al. Clin Chem Lab Med. 2011;49:325 RFLP Zatelli et al. Eur J Endocrinol 2009, 161:467 direct sequencing Zatelli et al. Eur J Endocrinol 2009, 161:467 allelic discrimination Rossi et al. J Clin Endocrinol Metab 2012;97:2354 specific colorimetric mutation detection assay (Mutector; TrimGen, Sparks, MD) Xing et al. J Clin Oncol. 2009;27: Affordable costs Dedicated instruments Experienced personnel
5 does it improve diagnosis?
6 BRAFV600E molecular test Cytology BRAF Cytology + BRAF Sensitivity Specificity PPV NPV Accuracy K value 0.51± ± ± ± ± ±0.01 Kim et al. J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:658 Zatelli et al. Eur J Endocrinol 2009, 161:467
7 BRAFV600E molecular test Kim et al. J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:658 BRAF mutation analysis may help especially in small nodules
8 Number of clinical/us findings suspected for malignancy in nodules diagnosed as cancer at histology None 4 < 1 cm 3 > 1 cm 1 One 59 < 1 cm 41 > 1 cm 18 Two 79 < 1 cm 62 > 1 cm 17 More than two 91 < 1 cm 34 > 1 cm 57 Even nodules lacking clinical/ US findings suspected for malignancy may underlie a thyroid cancer!!! None of the clinical/us findings suspected for malignancy predict BRAF status Rossi.Zatelii JCEM 2012;97:2354
9 233 thyroid carcinomas 222 PTC 195 PTC with classical histology 25 follicular variant PTC 4 MTC 1 tall cell PTC 1 oncocytic variant PTC 5 FTC 1 malignant hystiocitoma 1 AC 144 microcarcinomas 140 PTC 3 MTC 1 FTC Rossi.Zatelii JCEM 2012;97:2354
10 Cancer prevalence nodules >1 cm nodules <1 cm 7.2% 12.2% p< microptc 13 multifocal 17 with lymphnode metastases Rossi.Zatelii JCEM 2012;97:2354
11 BRAFV600E molecular test Cytology BRAF Cytology + BRAF S NS S NS S NS Sensitivity 76,8 69,4 56, ,9 84,7 Specificity 99,7 99, ,7 99,9 PPV 97,7 98, ,1 98,8 NPV 96, ,6 96,9 98,9 99 Accuracy 96,6 98,1 94, ,8 99 BRAF testing significantly increases FNAB sensitivity also in nodules clinically non suspected 15 PTC patients rescued by BRAF analysis Rossi.Zatelii JCEM 2012;97:2354
12 BRAFV600E molecular test S % NS % ACUS 26 3,1 78 4,9 PTC 6 75, ,0 BRAF ,2 0 0,0 FN 35 4,2 62 1,2 PTC 5 25,0 9 23,7 BRAF + 2 5,7 6 9,7 BRAF testing identifies as malignant 10% of FN Indication to total thyroidectomy Rossi.Zatelii JCEM 2012;97:2354
13 Thyroid cancer in Ferrara Years Patients number I 131 therapy (no) % I 131 therapy/ thyroid cancer pre-braf post-braf ,08% ,00% 36.7% in DTC diagnosis (+39 new cases/year) > 50% stage I and II
14 N (%) Class III (n =52*) Class IV (n =37) Class V (n =22) Indeterminate cytology (n =111) Cytology alone 19.2% 21,6% 90,9% 27,1 % Any mutation 47,3% 71,4% 90,9% 63,1% BRAF 100% 100% 100% 100% RAS 0% 50% 0% 14,2% RET/PTC-1 RET/PTC-3 Cancer risk in thyroid nodules with indeterminate cytology according to Bethesda classification and genetic alteration 40% 0% - 0% 100%* 100%* 57,1% 33,3% No mutations 3% 10% 90,9% 13,5% Rossi.Zatelii submitted
15 CONCLUSION -1 BRAF molecular analysis increases diagnostic sensitivity of cytology for PTC and may influence clinical management
16 any prognostic value?
17 PAPILLARY CARCINOMA BRAF mutation(s) NIS expression NIS trafficking to the membrane Riesco-Eizaguirre et al. Endocrine-Related Cancer 2006, 13: 257 DNA synthesis and apoptosis MMP, vimentin, osteopontin little growth advantage BUT genomic instability epithelial-mesenchimal transition Mitsutake et al. Cancer Research 2005;65: 2465 Vasko et al. Curr Opin Oncol 2007;19: 11
18 Xing et al. J Clin Oncol. 2009;27:
19 BRAFV600E molecular test PTC persistence/recurrence prediction All PTC Conventional PTC sensitivity 68% 79% specificity 66% 60% PPV 36% 34% NPV 88% 92% Xing et al. J Clin Oncol 2009; 27: BRAF mutation positive patients are significantly more likely to have PTC persistence/recurrence
20 PTC distribution according to TNM stages and the presence/absence of a genetic alteration Thyroid cancers TNM staging Genetic alteration (AJCC/UICC ) positive negative Total I II III IV Total Rossi.Zatelii submitted
21 BRAFV600E molecular test significantly reduced disease-free probability in BRAF+ patients Xing et al. J Clin Oncol. 2009;27:
22 BRAFV600E molecular test significantly increased mortality in BRAF+ patients Elisei et al. J Clin Endocrinol Metab. 2008;93:3943
23 1849 patients Greater mortality in BRAF+ (5.3%) vs BRAF- (1.1%) patients
24 When lymph node metastasis, extrathyroidal invasion, and distant metastasis were also included in the model, the association of BRAF V600E with mortality for all PTC was no longer significant
25 A higher BRAF V600E associated patient mortality was observed in several clinicopathological subcategories, but statistical significance was lost with adjustment for patient age, sex, and medical center.
26 CONCLUSION -2 BRAF status may predict patients outcome
27 any surgical relevance?
28 BRAFV600E molecular test â surgical strategy lobectomy total thyroidectomy lymph node dissection no dissection High prognostic impact extrathyroidal invasion lymph node metastasis local neck recurrence PTC recurrence complications Xing Endocrine Reviews 2007; 28: 742
29 BRAFV600E molecular test PREDICTOR OF LYMPHNODE METASTASES Indication for sentinel lymphnode Yip et al Surgery 2009; 146: 1215
30 CONCLUSION -3 BRAF V600E may influence surgical approach
31 BRAFV600E molecular test May address patients with persistent/recurrent disease to therapy with BRAF-specific inhibitors Cantwell-Dorris et al. Mol Cancer Ther 2011, 10: 385
32 THEREFORE BRAFV600E molecular test FNAB material ü increases cytology diagnostic sensitivity for PTC ü may predict patients outcome ü influences surgical approach ü allows detection of minimal disease metastatic to cervical lymph nodes Xing et al J Clin Endocrinol Metab 89:2867 Cohen et al Clin Cancer Res 10:2761 Domingues et al Cytopathology 16:27 Zatelli et al 2009 J Clin Endocrinol Metab Nikiforov et al J Clin Endocrinol Metab 94:2092 Rossi et al 2012 Clin Endocrinol Metab Kim et al Ann Surg 244:799 Kim et al Clin Endocrinol 65:364 Xing 2007 Endocr Rev 28:742 Nikiforova et al 2008 Expert Rev Mol Diagn 8:83 Riesco-Eizaguirre et al Endocr Rel Cancer 13:257 Xing et al J Clin Endocrinol Metab 90:6373 Mojica et al 2006 Endocr Pathol 17:183
33 SCOPO DELLO STUDIO Valutare se l introduzione dell analisi molecolare della mutazione V600E di BRAF ha determinato un miglioramento nella diagnosi e nell approccio terapeutico al PTC.
34 CAMPIONE PRE-BRAF da giugno 2001 a settembre pazienti con diagnosi di PTC POST-BRAF da ottobre 2007 a dicembre 2013 ABBIAMO VALUTATO: l PTC DIAGNOSTICATI l MICROCARCINOMI DIAGNOSTICATI l INCIDENZA DEI PTC NEI DIVERSI STADI l DIAGNOSI INTRAOPERATORIA l TIROIDECTOMIA DI COMPLETAMENTO l TERAPIA RADIOMETABOLICA
35 RISULTATI Numero dei PTC diagnosticati nei due periodi PRE-BRAF POST-BRAF
36 RISULTATI Numero dei microcarcinomi diagnosticati PRE-BRAF POST-BRAF MicroPTC pazienti con microptc (+ 5.02%; p<0.05) <= 1cm
37 RISULTATI Incidenza dei PTC nello stadio III e IV PRE-BRAF STADIO III POST-BRAF PTC allo stadio III (+ 7.98%; p<0.01) PRE-BRAF STADIO IV POST-BRAF pazienti allo stadio IV (-3.17%; p<0.05)
38 RISULTATI Aspetto chirurgico DIAGNOSI INTRAOPERATORIA PRE-BRAF POST-BRAF richieste di diagnosi intraoperatoria (-17%; p<0.01)
39 RISULTATI Aspetto chirurgico TIROIDECTOMIA DI PRE-BRAF POST-BRAF COMPLETAMENTO tiroidectomie di completamento (-4.70%; p<0.01)
40 RISULTATI Terapia radiometabolica PRE-BRAF POST-BRAF NO RAI pazienti sottoposti a RAI (-4.78% con p<0.05)
41 RISULTATI Terapia radiometabolica PRE-BRAF POST-BRAF 50 mci pazienti che hanno ricevuto un dosaggio di 50 mci (-4.18% con p<0.01) PRE-BRAF POST-BRAF > 100 mci pazienti che hanno ricevuto un dosaggio > 100 mci (-1.07% con p<0.05)
42 CONCLUSIONI Dall introduzione dell analisi molecolare della mutazione V600E di BRAF abbiamo ottenuto: Diagnosi precoce: Ø Ø un maggior numero di microptc un minor numero di PTC allo stadio IV
43 CONCLUSIONI Dall introduzione dell analisi molecolare della mutazione V600E di BRAF abbiamo ottenuto: Miglioramento dell approccio terapeutico: Ø Ø Ø Ø Ø minor richieste di diagnosi intraoperatoria riduzione delle tiroidectomie di completamento riduzione dei pazienti sottoposti a RAI riduzione dei pazienti che hanno ricevuto un dosaggio di 50 mci aumento dei pazienti che hanno ricevuto un dosaggio superiore ai 100 mci
44 VANTAGGI PER IL PAZIENTE E UN RISPARMIO ECONOMICO PER IL SERVIZIO SANITARIO
45 Riesco-Eizaguirre et al. Clin Transl Oncol 2007; 9:686
46 Molecular testing is not sufficient to detect all malignant cases Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83
47 UNIVERSITA DEGLI STUDI di FERRARA Corso di laurea in Medicina e Chirurgia LE MUTAZIONI DEI GENI BRAF E PIK3CA NEL CARCINOMA PAPILLARE DELLA TIROIDE: CARATTERISTICHE CLINICO-PATOLOGICHE E CORRELAZIONI CON L OUTCOME CLINICO. Relatore: Dott.ssa Maria Chiara Zatelli Laureanda: Matilde Bozzoli Anno Accademico
48 Carcinoma Papillare della Tiroide e alterazioni molecolari Istotipo più frequente, rappresenta il 75-80% dei CDT. Vie di trasduzione del segnale interessate: Ø MAPK Mutazioni BRAF Ø PI3K/Akt Mutazioni PIK3CA L attivazione della cascata delle MAPK è essenziale nelle fasi precoci della tumorigenesi del PTC, mentre la via PI3K/Akt ricopre un ruolo nella sua progressione.
49 Entrambe le mutazioni sono state correlate a caratteristiche clinicopatologiche di particolare aggressività dei PTC, predittive di una prognosi negativa e associate a maggiore mortalità. Gli studi di Abubaker et al. e di Filho et al. hanno messo in relazione le mutazioni di BRAF e le mutazioni di PIK3CA, dimostrando che tumori con entrambe le mutazioni presentano caratteristiche più aggressive.
50 Scopo dello studio Valutare l impatto delle mutazioni somatiche BRAF V600E e PIK3CA sulla prognosi dei pazienti affetti da PTC, mediante uno studio CASO-CONTROLLO. 1. Ricerca delle mutazioni somatiche dei geni BRAF e PIK3CA 2. Analisi delle caratteristiche anatomo-cliniche alla diagnosi 3. Analisi dell outcome clinico
51 Studio CASO/CONTROLLO 156 PTC 80 PTC BRAF V600E positivi 76 PTC BRAF V600E negativi 40 con metastasi linfonodali positive (N 1 ) 40 con metastasi linfonodali negative (N 0 ) 36 con metastasi linfonodali positive (N 1 ) 40 con metastasi linfonodali negative (N 0 ) I gruppi sono stati selezionati per essere omogenei per i seguenti fattori di rischio: 1. sesso 2. età 3. istotipo 4. stadio di malattia
52 Ricerca delle mutazioni somatiche su FNAB del gene PIK3CA L analisi genetica è stata condotta con la metodica del sequenziamento diretto su DNA somatico proveniente d a c i a s c u n o d e i campioni di agoaspirato. L analisi è stata eseguita per il gene PIK3CA a carico dell esone 9 e dell esone 20. Sui 156 campioni era già stata eseguita l analisi genetica per la ricerca della mutazione V600E di BRAF, a carico dell esone 15.
53 L analisi NON ha mostrato alcuna mutazione somatica puntiforme a carico del gene PIK3CA. L ipotesi di un possibile ruolo sinergico tra le mutazioni BRAF e PIK3CA non è confermata nel nostro studio. Ipotesi sul mancato riscontro della mutazione: 1) Si tratta di un fattore di progressione nella tumorigenesi del PTC 2) Non possiamo escludere la presenza di amplificazioni
54 La PROGNOSI della nostra popolazione dipende dallo stato di mutazione di BRAF e/o dalla presenza delle metastasi linfonodali (N)?
55 Analisi delle caratteristiche anatomo-cliniche Parametro T Parametro T1a è statisticamente più frequente in entrambe le popolazioni. Nei PTC BRAF non ci sono differenze fra il gruppo N 0 e il gruppo N 1 ; al contrario i PTC del gruppo BRAF N 1 hanno un parametro T superiore a quello dei PTC BRAF- N 0 Diametro tumorale MicroPTC è statisticamente più frequente in entrambe le popolazioni. Nei PTC BRAF non ci sono differenze fra il gruppo N 0 e il gruppo N 1 ; al contrario, nei PTC BRAF, il gruppo N 0 ha un numero significativamente maggiore di microptc rispetto al gruppo N 1. Parametro T BRAF + BRAF - N 0 N 1 N 0 N 1 T1a T1b T T T4a T4b totale Diametro del tumore BRAF + BRAF - N 0 N 1 N 0 N 1 microptc ( 1 cm) PTC > 1 cm totale
56 La presenza di microptc non si associa alla presenza della mutazione di BRAF I PTC BRAF + metastatizzano ai linfonodi indipendentemente dal diametro I PTC BRAF presentano metastasi linfonodali in associazione ad un diametro maggiore
57 Multifocalità e Bilateralità Prevalenza di PTC monofocali ed unilaterali Multifocalità è statisticamente più presente nei PTC BRAF N 1. BRAF + BRAF - N 0 N 1 N 0 N 1 Multifocalità 15% 27,2% 22,5% 47,2% Bilateralità 15% 22,5% 15% 30,5% Multifocalità e Bilateralità 5% 17,5% 15% 22,2% I PTC BRAF sono maggiormente associati a multifocalità
58 Analisi dell OUTCOME clinico Dopo 6-8 mesi Follow-up Pazienti trattati con I 131 Dopo 2 anni Ultimo controllo Range di follow-up: da più di 2 anni a 6 anni Pazienti NON trattati con I 131 Ultimo controllo Valutati attraverso: Ø Tg di base Ø Tg dopo rhtsh Ø Ecografia del collo Ø Scintigrafia con I RISPOSTA COMPLETA 2. PERSISTENZA LOCOREGIONALE di malattia 3. PERSISTENZA BIOCHIMICA di malattia
59 Analisi delle OUTCOME clinico dei pazienti SOTTOPOSTI a terapia radiometabolica Non ci sono differenze fra i PTC BRAF + e BRAF che vanno alla terapia radiometabolica. I PTC N 1 vanno alla terapia radiometabolica in numero significativamente maggiore rispetto ai PTC N 0. La presenza di BRAF non ha condizionato la scelta clinica di mandare il paziente alla terapia.
60 Analisi dell outcome clinico dei pazienti SOTTOPOSTI a terapia radiometabolica 1 controllo dopo 6-8 mesi dalla terapia con I 131 La percentuale di RISPOSTE COMPLETE è sovrapponibile fra i PTC BRAF + e BRAF, senza differenze significative fra i rispettivi N 0 e N 1. La percentuale di RISPOSTE COMPLETE è sovrapponibile anche fra i PTC N 0 e PTC N 1. La percentuale di risposte complete a 6-8 mesi NON è influenzata né dallo stato di mutazione di BRAF né dalla presenza delle metastasi linfonodali.
61 Analisi dell outcome clinico dei pazienti SOTTOPOSTI a terapia radiometabolica 2 controllo dopo 2 anni dalla terapia con I 131 La percentuale di RISPOSTE COMPLETE è sovrapponibile fra i PTC BRAF + e BRAF, senza differenze significative fra i rispettivi N 0 e N 1. La percentuale di RISPOSTE COMPLETE è sovrapponibile anche fra i PTC N 0 e PTC N 1. La percentuale di risposte complete a 2 anni NON è influenzata né dallo stato di mutazione di BRAF né dalla presenza delle metastasi linfonodali. Fra il 1 e il 2 follow-up abbiamo un aumento significativo di risposte complete nei PTC BRAF e nei PTC N 0.
62 Analisi dell outcome clinico dei pazienti SOTTOPOSTI a terapia radiometabolica 3 controllo all ultimo follow-up disponibile NON ci sono differenze statisticamente significative nelle percentuali di risposta completa né fra i PTC BRAF + e BRAF, né fra i rispettivi N 0 e N 1. La percentuale di risposte complete all ultimo follow-up NON è influenzata né dallo stato di mutazione di BRAF né dalla presenza delle metastasi linfonodali.
63 Analisi delle OUTCOME clinico dei pazienti NON sottoposti a terapia radiometabolica Unico controllo all ultimo follow-up disponibile Non c è differenza fra le percentuali di risposta completa fra i PTC BRAF + (45,5%) e i PTC BRAF (50%). La risposta completa all ultimo follow-up, anche in chi non ha fatto la terapia con I 131, non dipende dallo stato di mutazione di BRAF.
64 Conclusioni Il nostro studio ha evidenziato come, partendo da una popolazione omogenea per i fattori di rischio (sesso, età, istotipo e stadio di malattia), per il parametro T e la presenza di microptc alla diagnosi la presenza della mutazione di BRAF non ha significato prognostico negativo Higher mortality percentages and deaths per 1000 person-years were seen with BRAF V600E within most of the categories, including among patients with distant metastasis and advanced American Joint Committee on Cancer stage IV disease, in which the highest mortality percentages and deaths per 1000 person-years were seen. However, after adjustment for age, sex, and medical center, the HRs were no longer statistically significant in some of these stratified categories. The association of BRAF V600E with mortality among patients with disease stages I, II, and III was not statistically significant. When tumors were stratified by size, the absolute magnitude of mortality increased from smaller to larger tumors, particularly in thebrafv600e positive groups. BRAF V600E had a significant association with mortality percentages of microptc, but the absolute mortality was lowand the adjusted HRs were not significant. Mingzhao Xing, JAMA, April 2013
65 però.....nei pazienti con PERSISTENZA di malattia, i PTC BRAF + N 1 sembrano presentare una malattia residua più aggressiva.
66 Genetic alterations and their frequencies in each BSTRC class (isolated or combined) Number of genetic alteration (%) BSTRC classes I II III IV V VI Total BRAF V600E 4 (12.1) 3 (0.4) 9 (17.3) 4 (10.8) 8 (36.4) 12 (42.8) RAS 1 (3.03) 22 (2.9) 4 (7.7) 2 (5.4) 1 (4.5) 2 (7.1) 32 RET/PTC-1 2 (6.06) 25 (3.2) 5 (9.6) 0 2 (9.1) 3 (10.7) 37 RET/PTC-3 4 (12.1) 20 (2.6) 3 (5.8) 1 (2.7) 2 (9.1) 3 (10.7) 33 Total samples with genetic alteration(s) None 11 (33.3) 70 (9.1) 22 (66.7) 698 (90.9) 21 (40.4) 31 (59.6) 7 (18.9) 13 (59.1) 30 (81.1) 20 (71.4) (40.9) 8 (28.6) 798 All samples Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
67 Distribution according to TNM stages and the presence/absence of a genetic alteration TNM staging (AJCC/UICC ) Thyroid cancers Genetic alteration positive negative Total I II III IV Total Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
68 Cancer risk in thyroid nodules with indeterminate cytology according to BSTRC classification and genetic alteration % class III class IV class V Indeterminate cytology Cytology alone ,6 90,9 27,1 Any mutation 47,3 71,4 90,9 63,1 BRAF RAS ,2 RET/PTC-1 RET/PTC * 100* 57,1 33,3 No mutations ,9 13,5 *The patients with a PTC displaying RET/PTC rearrangements also had a BRAFV600E mutation or a class V or a class VI BSTRC cytology Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
69 Diagnostic value of cytology and of genetic analyses in all 940 samples Cytology BRAF RAS RET/PTC All genetic analyses PPV ,4 63,3 NPV 50 58,4 34,3 28,2 34,2 sensitivity 37,5 55,6 4,2 15,3 66,7 specificity , ,3 31 accuracy 61,5 72,6 33,3 29,9 53,8 Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
70 Diagnostic value of cytology combined with genetic analyses in all 940 samples Cytology combined with BRAF RAS RET/PTC All genetic analyses PPV ,3 61,1 66,7 NPV 72,6 45,6 38,1 51,9 sensitivity 76,4 40,3 45,8 82,2 specificity ,3 31,8 accuracy 85,5 55,6 48,7 63,2 Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
71 Diagnostic value of genetic analyses in the 140 indeterminate lesions according to BSRTC classification BRAF Class III Class IV Class V all genetic analyses BRAF all genetic analyses BRAF all genetic analyses PPV , , ,9 NPV 92,9 83,3 69, ,3 9,1 sensitivity , specificity , , accuracy 95,7 60,9 76,5 70,6 45,5 50 Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
72 BRAFV600E diagnostic sensitivity of cytology for thyroid cancer RAS mutations RET/PTC rearrangements Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
73 Negative BRAFV600E in class III nodules very low cancer risk!!! conservative treatment NO diagnostic lobectomy Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
74 BRAFV600E earlier diagnosis of thyroid cancer reduced clinical impact reduced patients and healthcare costs! Rossi M,. Zatelli MC. Thyroid Oct 21. [Epub ahead of print]
75 THANKS Section of Endocrinology Dept. of Medical Sciences University of Ferrara Ettore degli Uberti
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