1. LA SUPEROSSIDO DISMUTASI

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1 1. LA SUPEROSSIDO DISMUTASI La superossido dismutasi (SOD) appartiene ad una famiglia di metalloproteine la cui funzione è quella di eliminare l anione radicalico superossido O 2 -, generato da reazioni biologiche spontanee come la dismutazione (fig. 1.), che produce O 2 e H 2 O 2. Fig. 1. Reazione di dismutazione dello ione superossido Sotto questo aspetto, la SOD assume un ruolo centrale nella risposta dell'organismo alla tossicità dei sottoprodotti metabolici dell'ossigeno. Le SOD sono enzimi dimerici o tetramerici costituiti da subunità identiche, presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche e nel periplasma di quelle batteriche. Lo studio della superossido dismutasi (SOD) è iniziato all incirca mezzo secolo fa quando è stato provato che il rame, elemento presente nel sangue, era associato a proteine di derivazione ematica ed epatica, denominate poi rispettivamente emocupreina ed epatocupreina (Mann et al., 1939). Queste due proteine non reagivano con l ossigeno come l emocianina, presente negli invertebrati come proteina respiratoria, e non promuovevano né reazioni di fosforilazione né l attività di enzimi come la citocromo ossidasi, la perossidasi, la catalasi. 6

2 La funzione della proteina è rimasta ignota fino al 1969, quando McCord e Fridovich (Mc Cord et al., 1969) hanno identificato l emocupreina come SOD quale risultato della ricerca condotta presso la Duke University sulla riduzione del citocromo c da parte del radicale superossido, generato dalla xantina ossidasi. Nel periodo intercorso tra il primo isolamento dell emocupreina e la scoperta della sua funzione è stata identificata un intera famiglia di cupreine, presenti a livello di vari organi. Una metallo-proteina contenente rame è stata isolata dal cervello bovino e chiamata cerebrocupreina (Porter et al., 1957) e un analoga è stata trovata nel cervello umano (Porter et al., 1959). E stato ipotizzato che tutte le cupreine isolate dai vari organi fossero identiche, ma la scoperta che degli anticorpi contro l emocupreina umana non reagivano con l emocupreina di manzo ha suggerito l esistenza di specie-specificità (Markowitz, 1959). Studi successivi hanno confermato che l epatocupreina umana, la cerebrocupreina e l eritrocupreina sono identiche: tutte queste infatti hanno simile punto isolettrico, velocità di sedimentazione, peso molecolare, spettro di risonanza magnetica e di assorbimento, risposta immunologica e soprattutto medesima composizione aminoacidica e pattern di restrizione, risultato della digestione con tripsina (Carrico, 1969). E stato dimostrato inoltre che queste cupreine potevano contenere oltre al rame anche lo zinco (Carrico et al.,1970), il manganese ed il ferro (Keele et al., 1970). La scoperta della superossido dismutasi (SOD) (E.C ) (McCord et al., 1969) ed il riconoscimento della sua distribuzione in vari organismi aerobi (McCord et al., 1971) ha avuto come importanti implicazioni che la produzione del radicale superossido è il risultato del metabolismo dell ossigeno molecolare e che tale specie radicalica presenta elevata tossicità per l organismo; la sua eliminazione avviene infatti in maniera assolutamente veloce ed efficiente. 7

3 1.1. Specie reattive dell ossigeno (ROS) Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sostanze fisiologicamente generate in piccole quantità durante la fosforilazione ossidativa, che esercitano un'azione regolatoria di diverse funzioni cellulari, quali: l'espressione genica, la crescita cellulare, la trasduzione di segnali biologici e la difesa contro patogeni esterni. O2 e -.- O2 e - H + H2O2 - e HO. e - H + H2O Fig.2. ROS, Reactive Oxygen Species L ossigeno è un elemento essenziale per la sopravvivenza di tutti gli organismi aerobi dato il suo coinvolgimento nella fosforilazione ossidativa che avviene durante la respirazione aerobica, ma risulta allo stesso tempo essere anche nocivo per tutte le cellule viventi a causa della sua tossicità, derivante dalla formazione di prodotti ridotti e/o di stati eccitati di singoletto. La varietà delle specie dell ossigeno (ROS, Reactive Oxygen Species) viene generata sia dalla normale attività metabolica sia dagli stress generati con vari meccanismi. Il radicale superossido (O - 2 ) formato da O 2 in presenza di ferro (McCord et al., 1978; Halliwell, 1978) è uno dei principali metaboliti primari generati dalla cessione di elettroni durante la respirazione aerobica. Questo anione altera il bilancio redox della cellula riducendo e rilasciando ioni metallici, in particolare il Fe(III) o il Cu(II) legati alle proteine, oppure convertendosi ad altri ROS, inclusi il radicale idroperossile e l H 2 O 2. Gli ioni metallici ridotti e l H 2 O 2 vanno incontro alla reazione di Fenton generando il più reattivo radicale idrossile (OH ). La - dismutazione spontanea di O 2 con H 2 O 2 catalizzata dal ferro e la decomposizione dell H 2 O 2 possono inoltre dare origine all ossigeno singoletto ( 1 O 2 ). OH e 1 O 2 8

4 danneggiano le cellule reagendo con numerose molecole cellulari (Lledias, et al., 2000). Reazione di Fenton Fe 2+ + H OH + OH - + Fe 3+ 2 O 2 Fe 3+ o Cu Reazione di Haber- 2+ O H OH + OH - 2 O 2 + O 2 I radicali superossido sono generati da numerose e diverse ossidazioni biologiche, quali l autossidazione delle flavine (Ballou et al., 1969), dell idrochinone (Misra, 1972), delle catecolammine (Cohen, et al., 1974), dei tioli (Misra, 1974), delle emoproteine (Misra et al., 1972; Gotoh et al., 1976) e della ferredossina ridotta (Misra et al., 1971). Sono anche prodotti in vari organelli subcellulari come i cloroplasti (Halliwell, 1984) ed i mitocondri ( Loschen et al., 1974) e dalla reazione di diversi altri enzimi tra i quali la xantina ossidasi, l aldeide ossidasi e alcune deidrogenasi flaviniche (Fridovich, 1975). Il radicale (O 2 - ) può essere inoltre formato anche a livello dei neutrofili e macrofagi durante il processo di fagocitosi (Bannister et al., 1985). Le varie specie radicaliche danneggiano le strutture cellulari alterando la struttura della membrana e quindi anche la fluidità e la permeabilità, e perturbando in questo modo la comunicazione intercellulare, o danneggiando il materiale genetico e l attività dei vari enzimi, inducendo così la morte della cellula (fig. 3.). Fig. 3. Azione dei ROS sulla cellula 9

5 Gli organismi hanno perciò evoluto un sistema di difesa antiossidante costituito sia da componenti enzimatiche sia da molecole non enzimatiche. I sistemi enzimatici maggiormente coinvolti sono rappresentati da superossido dismutasi (SOD), da catalasi (CAT) che agiscono rispettivamente sullo ione superossido (O 2 ( e sull acqua ossigenata (H 2 O 2 ) e dalla glutatione perossidasi Se-dipendente (GPx), un importante enzima che decompone i perossidi utilizzando come cosubstrato il glutatione. Gli antiossidanti non enzimatici comprendono varie molecole a basso peso molecolare ("scavenger") come ascorbato, vitamina E, carotenoidi, glutatione ridotto (GSH) e metallotioneina (MT). Nonostante la produzione basale di ossiradicali sia normalmente contrastata da questo complesso sistema di difese antiossidanti, la produzione di ROS viene amplificata come risposta a molteplici stress ambientali fra i quali i fenomeni di anossia e successiva riossigenazione. Se questi meccanismi di difesa risultano inefficaci si ha uno sbilanciamento verso la formazione di radicali, che genera una situazione di stress ossidativo. Se i radicali non vengono prontamente inattivati possono danneggiare i costituenti cellulari e fungere così da agente eziologico per l insorgenza di patologie di carattere degenerativo (Follezou et.al., 1999) (fig. 4.). Sorgenti di ROS: Mitocondri Catena respiratoria Leucociti attivati Fattori ambientali (fumo, radon, ozono) Luce ultravioletta A N T I O S S I D A N T I Danno ossidativo a: DNA Lipidi Proteine Patologie conseguenti: Invecchiamento Patologie cardiache Morbo di Alzheimer Patologie immuno-infiammatorie Artrite reumatoide Fig. 4. Patologie correlate allo stress ossidativo 10

6 La superossido dismutasi costituisce il primo sistema di difesa contro i danni causati dai radicali derivanti dall ossigeno; questo enzima è pertanto essenziale per tutti gli organismi aerobi ma non lo è per quelli anaerobi. A sostegno di tale tesi è stata proposta da McCord (McCord et al., 1981) la teoria dell obbligatorietà dell anaerobiosi. L esistenza aerobica di un organismo dipende soprattutto dalla sua capacità di produrre SOD; una sua deficienza sarebbe responsabile della sensibilità all ossigeno e consentirebbe la sopravvivenza solo in ambiente anaerobico. Altri studi (Loesche, 1969) hanno tuttavia delineato un range di tolleranza all ossigeno, definito come la massima quantità di ossigeno contenuta nell atmosfera in cui un organismo anaerobio potrebbe crescere nonostante la mancanza di SOD. La teoria non è quindi sempre applicabile Isoforme della superossido dismutasi Tutte le SOD sono metalloenzimi contenenti uno ione di un metallo di transizione redox-attivo (rame, ferro o manganese); i geni che codificano per le tre famiglie di SOD ad oggi note derivano da due geni ancestrali tra loro non correlati. Da uno dei due geni ancestrali deriva il gruppo delle Mn-SOD e delle Fe-SOD, estremamente diffuso a livello degli organismi aerobi, dai batteri alle piante fino all uomo. Dall altro discende la famiglia delle Cu,Zn-SOD, distribuito esclusivamente tra gli organismi eucariotici. In tab. 1. sono riassunte le pricipali caratteristiche dei vari tipi di SOD. La distribuzione delle tre isoforme a livello cellulare è stata ampiamente analizzata: la Cu,Zn-SOD si trova esclusivamente a livello citosolico di organismi eucarioti; la Mn-SOD è localizzata nella matrice mitocondriale di alcuni eucarioti e di mammiferi; la Fe-SOD si trova a livello citosolico o di organelli nei procarioti ed in alcuni eucarioti. Nonostante ciò sono state trovate particolari eccezioni a questa 11

7 regola generale: in alcuni procarioti è stata, per esempio, identificata una Cu,Zn- SOD, normalmente di origine eucariotica (Beck et al., 1990; Steinman et al., 1990; Bricker et al., 1990; Leunissen et al., 1986); altro caso riguarda la Mn-SOD che sembra essere completamente confinata nella matrice mitocondriale in quasi tutti i mammiferi, mentre nell uomo è la forma predominante presente nel citosol delle cellule epatiche. Tipo Peso Molecolare (Dalton) Struttura Localizzazione Distribuzione Cu,Zn-SOD Dimerica Citosol EUCARIOTI, PROCARIOTI Mn-SOD Fe-SOD 40,000 o 80,000 40,000 o 80,000 Dimerica o tetramerica Dimerica o tetramerica Citosol o matrice mitocondriale Citosol, cloroplasti, mitocondri MAMMIFERI PROCARIOTI Tab. 1. Peso molecolare, struttura, localizzazione cellulare e distribuzione delle 3 famiglie di SOD negli organismi viventi Le diverse isoforme di SOD presentano caratteristiche sensibilità a composti chimici: la Cu,Zn-SOD al cianuro, la Mn-SOD al perossido d idrogeno e la Fe-SOD all azide (Weisiger et al., 1973; Fridovich, 1974). E stato pertanto possibile discriminare le varie isoforme presenti negli estratti cellulari grezzi, confermate poi dal successivo isolamento dall organismo e caratterizzazione dell enzima. 12

8 La Cu,Zn-SOD Le Cu,Zn-SOD (fig. 5.) sono omodimeri con peso molecolare di circa dalton. Le due subunità identiche sono associate unicamente tramite interazioni non-covalenti ed ognuna contiene un atomo di rame e di zinco. Gli allineamenti di sequenza effettuati indicano che i siti di legame con i metalli sono conservati in tutti gli enzimi. Fig. 5. Struttura tridimensionale di una Cu,Zn-SOD La reazione di dismutazione procede tramite due step di uguale velocità: nel primo si ha la formazione di ossigeno molecolare a partire dal radicale superossido con la conseguente riduzione di Cu(II) a Cu(I), mentre nel secondo si ha la riduzione a H 2 O 2 da parte di un altro anione superossido rigenerando in questo modo il centro catalitico (fig. 6.). - E Cu(II) + O 2 E Cu(I) + O 2 - E Cu(I) + O 2 + 2H + E Cu(II) + H 2 O 2-2 O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Fig. 6. Meccanismo catalitico e reazione complessiva della Cu,Zn-SOD 13

9 Un alto grado di omologia è evidente tra le varie SOD dei vertebrati, pressoché lo stesso del citocromo c tra gli eucarioti; questo indica che le varie Cu,Zn-SOD si sono diversificate molto lentamente. Nei batteri è stata riscontrata una scarsa omologia di sequenza ma una struttura secondaria analoga a quella delle altre Cu,Zn-SOD. A dimostrazione di ciò sono state avanzate numerose ipotesi tra le quali lo sviluppo indipendente di eucarioti e procarioti, o il trasferimento dell enzima originario dai procarioti agli eucarioti; ciò implicherebbe l esistenza di un gene progenitore comune. Il meccanismo catalitico della superossido dismutasi è stato determinato con uno studio di radiolisi pulsata e quindi confermato sia per il manganese sia per il ferro (Klug-Roth et al., 1973) La Mn-SOD e la Fe-SOD La struttura della Mn-SOD e della Fe-SOD (fig. 7. e fig. 8.) non è stata ancora dettagliata quanto l analoga Cu,Zn-SOD; si conosce infatti la struttura primaria di solo quattro Mn-SOD (Fig. 7) (Brock et al., 1980; Ditlow et al., 1984; Barra et al.,1984) contro le undici della Cu,Zn-SOD (Steiman et al., 1974; Barra et al., 1980; Jabush et al., 1980; Steffens et al., 1983). Non è stata invece ancora identificata la sequenza aminoacidica completa della Fe-SOD. Fig. 7. Sito di legame per il metallo della Mn-SOD 14

10 Questi enzimi contenenti ferro e manganese hanno subunità molecolari di circa dalton e, mentre l enzima contenente ferro esiste unicamente in forma dimerica, l analogo con manganese può esistere sia in forma dimerica sia tetramerica (Parker et al., 1984). Il contenuto in metallo nei vari enzimi varia tra uno e due atomi per dimero, ciò forse dovuto alla perdita del metallo durante i processi di purificazione. I dati cristallografici sulla Fe-SOD indicano la presenza di due siti per il legame con il metallo (Ringe et al., 1983). I ligandi del manganese si trovano nell identica posizione della ferro-proteina (Barra et al., 1985) e ci sono evidenze che la Mn-SOD e la Fe-SOD sono strutturalmente omologhe (Stallings et al., 1984). Fig. 8. Struttura tridimensionale e sito di legame per il metallo della Fe-SOD Le poche conoscenze attuali sulle due metallo-proteine sono sufficienti a delineare un meccanismo di reazione abbastanza analogo a quello della Cu,Zn- SOD, ma non per identificare le basi della funzione catalitica. La Mn-SOD e la Fe- SOD non sono strutturalmente correlate all isoenzima contenente zinco e rame. Il meccanismo catalitico della proteina contenente ferro o manganese segue lo schema generale mostrato per la Cu,Zn-SOD, coinvolgendo le coppie di Fe(ΙΙΙ)/Fe(ΙΙ) e di Mn(ΙΙΙ)/Mn(ΙΙ). Nel caso della Mn-SOD si ipotizza che l attività del sito catalitico sia coinvolta nella formazione di specie finali (Pick et al., 1974) (Lavelle et al., 1977). L efficienza catalitica è leggermente più bassa nell isoenzima 15