BAL : lavaggio broncoalveolare

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1 BAL : lavaggio broncoalveolare Si tratta di una metodica altamente sensibile che viene eseguita con un broncoscopio a fibre ottiche, evitando la contaminazione del materiale con flora orofaringea permettendo la coltura di microrganismi in carica ridotta.

2 BAL : lavaggio broncoalveolare E una metodica indicata per tutte le ricerche batteriologiche, fungine, parassitologiche e virologiche. Consente di ottenere le maggiori probabilità di successo nella identificazione di patogeni polmonari.

3 Per l isolamento e l identificazione dei batteri Gram-negativi, si semina su agar-mac Conkey, incubazione h. in aerobiosi, T C Eventuale colorazione di Gram. Identificazione tramite sistemi automatici che contengono card specifiche con reagenti per test enzimatici e biochimici. Successivo antibiogramma.

4 Pseudomonas aeruginosa

5 Per l isolamento e l identificazione dei Gram positivi il materiale viene seminato su agar-sangue e su agar-sangue CNA, incubato a 37 C, per h. in condizioni di aerobiosi, in presenza di CO2 al 10%. Eventuale colorazione di Gram. Identificazione e antibiogramma automatici ( es. sistema Vitex). Str. pneumoniae

6 Staphylococcus aureus

7 Streptococcus Pyogenes: raro agente di polmoniti, in genere complicanti infezioni virali. Crescita su agar-sangue e sensibilità alla bacitracina. ( ß-emolitico, gruppo A).

8 Per l Haemophilus si usa l isolamento su agarcioccolato, le piastre vengono incubate a 37 C in presenza di CO2 al 10%. Si possono usare gallerie NH ( identificazioni biochimiche specifiche per l organismo), e gallerie ATBNH per l eventuale antibiogramma.

9 Legionelle : l isolamento di questo microrganismo va fatto insemenzando il materiale patologico su agar-mullerhinton, con aggiunta di L-cisteina e pirofosfato ferrico solubile. Si può utilizzare l osservazione microscopica di preparati trattati con anticorpi monoclonali e marcati con fluorescina (immunofluorescenza diretta). La maggioranza dei casi clinici è sostenuta da Legionella pneumophila e micdadei.

10 Per l identificazione dei miceti lievitiformi, in particolare Candida spp. Si usa il terreno di agarsabouraud, T C 30-33, aerobiosi, per h. Colonie identificabili su vetrino dopo trattamento con KOH, oppure con colorazione di Gram. Ulteriore identificazione automatica secondo le caratteristiche biochimiche del fungo.

11 Criptococcosi Umana Fino agli anni 80 malattia ubiquitaria e sporadica malattia opportunistica con Comparsa degli HIV+ frequenza del 2-10% in Europa e USA, superiore al 15% in Africa Cellule lievitiformi, ovali o rotonde, spesso gemmanti (ellittiche nella var. gattii) Capsula polisaccaridica di 5-20 micrometri di spessore

12 Manifestazioni Cliniche Forme polmonari Forma cronica Può produrre noduli o masse, cavità, linfoadenopatia Infezione acuta Rara, più frequente nei pazienti AIDS Forme disseminate Sistema Nervoso Centrale Meningoencefalite, raramente masse fungine intracerebrali singole o multiple (Alterazioni psichiche) Cute Lesioni poco doloranti tipo papule, placche, ulcere, masse sottocutanee Altro Endoftalmite, corioretinite, congiuntivite, sinusite, otite, miocardite, pericardite, endocardite, gastroduodenite, epatite, colecistite, peritonite, ascessi renali, artrite, osteomielite, linfoadenite, prostatite

13 Metodi colturali Optimum di temperatura di sviluppo 37 C o leggermente inferiore (non tollera temperature superiori a 40 C) ph del terreno 5-7 (non tollera ph superiore a 7,6) Tempo minimo di incubazione 48 ore (superiore per la var. gattii) Colonie bianco crema convesse tendenti a scurire col tempo, possono avere anche aspetto mucoso se gli stipiti sono dotati di grossa capsula

14 Metodi colturali II Normali terreni per micologia come Emocoltura Sabouraud dextrose agar Sensibilità: scarsa in HIV-, 35-68% in HIV+ Con metodi radiometrici (BACTEC) è consigliato subcolturare La lisicentrifugazione ha maggiore sensibilità Altri materiali (escreato, urine) Sensibilità: scarsa ( escreato spesso negativo anche in caso di criptococcosi polmonare) E consigliato l uso del terreno di Staib all estratto di semi di Guzotia abissinica (colonie brune) per differenziare da altri lieviti E utile l aggiunta di antibatterici ma non di cicloeximide che

15 Identificazione presuntiva Aspetto e colore delle colonie Osservazione microscopica di lieviti capsulati (da HIV+ sono stati isolati lieviti privi di capsula o con capsula molto sottile) Crescita a 37 C Produzione di ureasi (sono descritti casi dovuti a ceppi ureasi negativi) Sviluppo di colonie brune su Staib-agar (Produzione di fenolossidasi)

16 Diagnostica di Laboratorio Esame diretto Preparati a fresco dei campioni Istopatologia Metodi colturali Indagini sierologiche Ricerca di anticorpi Ricerca di antigeni Metodi di biologia molecolare Sonde specifiche Amplificazione genomica mediante PCR o nested-pcr

17 Mycobacterium tuberculosis : esame microscopico con la colorazione di Ziehl Nielsen, evidenza la presenza di bacilli alcol-acido resistenti; esame colturale con terreni di Lowenstein-Jensen, IUTM, Middlebrook-Cohn, terreni liquidi( es. il 7H12 che contiene acidopalmitico e carbonio radioattivo). La crescita avviene in atmosfera aria con il 5-10% di CO2, T C

18 Pneumocystis carinii : si può evidenzare in maniera diretta al microscopio, nel BAL, dopo colorazione di GomoriGrocott ( impregnazione argentica); si può usare anche la tecnica di immunofluorescenza indiretta. Di recente introduzione è la ricerca di componenti antigeniche del microrganismo nel BAL e nel siero.

19 Nocardia : osservazione microscopica diretta o colturale, utilizzando terreni usati per i micobatteri o per i funghi. (incubazione prolungata, fino a 7 giorni)

20 Neisseria meningitidis : diplococchi gram negativi intracellulari, ricercata in caso di polmonite meningococcica, colture su agar cioccolato, incubazione a 37 C per 24-48h, in atmosfera di CO2 al 5-10%. Ulteriori indagini biochimiche e sierologiche con antisieri verso gli antigeni specifici.

21 Mycoplasma pneumoniae : aerobi o anaerobi facoltativi, crescono su terreni contenenti estratto di lievito e siero con l aggiunta di glucosio, blu di metilene e rosso fenolo. Successiva identificazione antigenica e utilizzo di PCR per identificare specifiche sequenze del genoma. Clamydia trachomatis : ricerca di antigeni specifici con test immunoenzimatici, immunofluorescenza,ricerca dell acido nucleico tramite PCR.

22 Aspergillus: specie d interesse medico A. fumigatus A. flavus A. niger A. nidulans A. terreus A. versicolor

23 Patologie da Aspergillus Sviluppo saprofitario endocavitario: aspergilloma Invasione tessuti: aspergillosi polmonare invasiva aspergillosi disseminata Patolologie su base allergica: ABPA Localizzazioni superficiali: otomicosi Patologie da tossine (aflatossine)

24 Patologie polmonari: fattori predisponenti Aspergilloma: bronchiettasie, tubercolosi cavitaria. Aspergillosi polmonare invasiva: emopatie maligne, trapianti d organo, terapie immunodepressive, infezione da HIV.

25 Preparazione KOH al 10%, microscopia ottica ( a fresco) Escreato: ife fungine (Aspergillus?) Lavaggio bronco-alveolare: ife e conidiofori (A. fumigatus)

26 Esame colturale: Identificazione di specie Caratteristiche microscopiche Riproduzione asessuata morfologia delle teste conidiali dimensioni del conidioforo; dimensioni e forma della vescicola presenza di metule ; presenza e forma delle hülle cells; forma delle ascospore

27 Diagnosi di laboratorio Esame colturale Terreni: Sabouraud destrosio agar Malto estratto agar Czapek agar Temperatura di incubazione: C Tempo di incubazione: 2-5 gg

28 Aspergillus terreus Vescicola, metule, fialidi

29 A. nidulans

30 Aspergillus flavus Testa conidiale 100x Conidioforo (superficie rugosa)

31 Aspergillus niger Conidioforo con metule e fialidi

32 Aspergillus fumigatus:ceppo che determina le maggiori patologie polmonari nell uomo Teste colonnari (100x) Conidioforo con fialidi

33 Sierodiagnosi Ricerca di anticorpi Ricerca di antigeni

34 Sierodiagnosi: ricerca di antigeni In quali pazienti? Pazienti immunocompromessi Sospetto clinico: Aspergillosi invasiva

35 Sierodiagnosi: ricerca di anticorpi In quali pazienti? Pazienti immunocompetenti Sospetto clinico: Aspergilloma (Ig G) Aspergillosi broncopolmonare allergica (Ig E, Ig G)

36 Bordetella pertussis : sebbene comunemente presente nel tratto respiratorio alto, a volte può essere associato a broncopneumopatia interstiziale. Cresce su terreno di Bodet-Gengou o su agar cioccolato. ( coccobacilli gram -).

37 Bacteroides spp : anaerobio

38 Actinomyces spp : miceti con disposizione raggiata, ma nonostante le analogie con i miceti sono da considerarsi batteri (gram +).

39 Brucella spp. : coccobacilli gram -, necessitano di CO2 per la crescita, crescono lentamente su agar-sangue e agarcioccolato, utilizzo di reazioni sierologiche per l identificazione (Wright), emocolture.

40 Botticini per colture (emocolture) in aerobiosi e anaerobiosi.