Fase analitica: Terreni di coltura ed identificazione

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1 Fase analitica: Terreni di coltura ed identificazione Dott.ssa Saveria Dodaro Cosenza

2 Laboratorio di microbiologia clinica Diagnosi eziologica 1. identificare l agente patogeno 2. appropriato trattamento terapeutico

3 Laboratorio di MICROBIOLOGIA clinica Altri obiettivi : Valutare l efficacia della terapia Valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio in comunità)

4 Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive Utilizzo di metodologie scientificamente valide ed eseguibili in tempi accettabili Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla terapia

5 Diagnosi diretta sangue feci urine biopsie tamponi Ecc. Diagnosi batteriologica Sospetta infezione batterica Diagnosi rapida Diagnosi indiretta Siero del paziente Metodo immunologico ricerca di anticorpi verso l agente batterico immunoenzimatico (EIA) immunofluorescenza (IFA) Esame colturale Semina su brodo di arricchimento,terreno solido non selettivo e/o selettivo Isolamento del microrganismo in coltura pura Identificazione Biochimica,immunologica,molecolare Metodo immunologico (ricerca di antigeni dell agente batterico) Test di agglutinazione ELISA Immunocromatografia su membrana Metodo molecolare (ricerca di sequenze genomiche dell agente batterico) PCR Multiplex PCR Nested PCR NASBA Ibridazione su una sonda verso l agente batterico antibiogramma

6 Diagnosi batteriologica Diagnosi diretta: presenza dell agente patogeno Esame microscopico (batterioscopico) Esame colturale (isolamento) Ricerca di antigeni Ricerca di sequenze geniche

7 Diagnosi diretta: esame microscopico Campioni a fresco oppure fissati ( al calore o chimicamente) La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente : Microscopia in campo oscuro Microscopia in contrasto di fase Microscopia in fluorescenza Spesso si utilizzano colorazioni dedicate Gram Ziehl Neelsen (alcool-acido resistenza)

8 Microscopia in campo oscuro borrelia burgdorferi

9 Microscopia contrasto di fase Lieviti

10 Microscopia in fluorescenza

11 Diagnosi diretta : esame microscopico (previa colorazione) Colorazioni SEMPLICI prevedono l impiego di un solo colorante : cristalvioletto fucsina basica blu di metilene Colorazioni DIFFERENZIALI prevedono l impiego di più di un colorante : colorazione di Gram colorazione di Ziehl -Neelsen

12 Diagnosi diretta: esame microscopico (previa colorazione) UTILITÀ CLINICA Campioni fissati ( a calore o chimicamente) Idoneità del campione (espettorato-neutrofili/ cell.squamose) Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili Presenza o assenza di microrganismi(batteri-funghi-parassiti) Colorazione del campione con tecnica di Gram: Morfologia (cocchi-bastoncelli-coccobacilli) Disposizione ( catenelle-clusters-diplococchi) Quantità assoluta di batteri presenti Percentuale relativa di Gram pos/neg Localizzazione in sede intra o extra cellulare Altre specifiche colorazioni bacilli alcool-acido resistenti (Ziehl Neelsen) endospore batteriche (Verde malachite)

13 COLORAZIONE DI GRAM Neisseria meningitidis Streptococcus pyogenes

14 COLORAZIONE DI GRAM osservazione microscopica I batteri Gram+ (Staphylococcus, Streptococcuss, etc) Staphylococcus epidermidis I batteri Gram (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) Escherichia coi

15 COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN Gli organismi acido-resistenti appaiono colorati in rosso Mycobacterium tuberculosis

16 ESAME COLTURALE TERRENI DI COLTURA

17 Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio A tale scopo si devono conoscere le sostanze nutritizie e le condizioni fisiche richieste

18 COLTIVAZIONE DEI BATTERI In laboratorio l impiego di terreni di coltura riproduce artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare

19 I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare

20 Macronutrienti Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi in quantità notevoli CARBONIO AZOTO OSSIGENO IDROGENO ZOLFO FOSFORO servono per la sintesi dei componenti strutturali della cellula

21 Altri Macronutrienti

22 Micronutrienti Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue

23 TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL INTERNO DELLA CELLULA Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all interno della cellula: l unico composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula batterica, è l acqua TRASPORTO FACILITATO Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del microrganismo) questo processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di membrana (le permeasi) TRASPORTO ATTIVO la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo energia L energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall idrolisi di ATP

24 TERRENI DI COLTURA Stato fisico Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi

25 Per solidificare i terreni si impiega L AGAR Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100 C ma resta liquefatto fino a 45 C). L uso dell agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare Inoltre: non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

26 i microrganismi invisibili ad occhio nudo (<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o liquido

27 Preparazione dei terreni 1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H 2 O. 2. Determinazione del ph ed eventuale correzione. 3. Distribuzione in contenitori idonei. 4. Sterilizzazione

28 In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come: Sintetici (o definiti) Complessi Terreni sintetici o definiti I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere. Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.

29 Terreni complessi sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro Inoltre è possibile far crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute Oltre alle sostanze standard i terreni complessi contengono: Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica; Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell azoto.

30 I caratteri colturali forniscono indizi utili per l identificazione

31 POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua). COLTURE MISTE

32 COLTURA PURA Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un unica cellula madre Essa rappresenta una condizione artificiale per l accrescimento dei batteri ed è una condizione ottenuta da manipolazioni di laboratorio

33 Classificazione qualitativa dei terreni Terreni elettivi Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico. Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie. Terreni differenziali Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata. Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.

34 ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE a - b - g - emolisi su piastra di agar sangue

35 ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE Lattosio fermentante Agar Mac Conkey Fermentazione del Lattosio su agar Mac Conkey Lattosio non fermentante

36 ESEMPIO DI TERRENO ELETTIVO E DIFFERENZIALE Agar CLED (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient) Lattosio non fermentante Contiene: Lattosio Blu bromotimolo come indicatore del ph Cistina amminoacido nutriente Lattosio fermentante

37 Esame colturale Pretrattamento del campione fluidificazione concentrazione sonicazione diluizione

38 Esame colturale Semina del campione quantitativa per isolamento

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40 Esame colturale Incubazione dei terreni di coltura temperatura ossigeno

41 TEMPERATURA Psicrofili -10 C a +20 C (L.monocytogenes 5-8 C) Mesofili +10 a +50 C Termofili +40 a +70 C

42 OSSIGENO Aerobi obbligati: Crescono solo in presenza di O 2 atmosferico Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO 2

43 OSSIGENO

44 CRESCITA IN ANAEROBIOSI Per la coltura dei batteri anaerobi bisogna utilizzare terreni riducenti ed in incubatori speciali. I terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l ossigeno atmosferico fino ad esaurirlo. Gli incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO 2 e H 2 e successivamente H 2 O con scomparsa dell ossigeno

45 INCUBATORI SPECIALI

46 INCUBATORI SPECIALI CO 2

47 Diagnosi diretta : identificazione CRESCITA DI COLONIE BATTERICHE SU TERRENI DI COLTURA IDENTIFICAZIONE

48 Caratteri macroscopici delle colonie

49 stafilococchi Agar sangue streptococchi Agar sangue Gram negativi Enterobatteri Non fermentanti Agar Mac Conkey miceti Agar Sabouraud e Terreni cromogenici

50 PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

51 Caratteri macroscopici

52 Diagnosi diretta : identificazione ID PRESUNTIVA - Caratteri microscopici (colorazione, forma, organizzazione) - Caratteri macroscopici (aspetto colonia) ID FINALE (DEFINITIVA) -biochimica -immunologica -molecolare

53 Diagnosi diretta : identificazione biochimica VALUTAZIONE DELLE CAPACITÀ METABOLICHE DEI MICRORGANISMI metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per via fermentativa (via aerobica) produzione di specifici enzimi e/o di prodotti metabolici metodi manuali o automatizzati identificazioni in tempi rapidi (4-6 h)

54 identificazione manuale

55 Gram positivi Stafilococco e streptococco

56 Cocchi Gram positivi catalasi-positivi di forma sferica riuniti in ammassi irregolari, dall aspetto di grappoli, del diametro di μm immobili privi di capsula evidente asporigeni

57 Gram positivi Test CATALASI 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Stafilo e strepto Test: alcune goccie di H 2 O 2 3% direttamente su colonie su terreno solido (non AS); oppure mischiare una aliquota di coltura (colonia o coltura liquida) con alcune goccie di H 2 O 2 3% su vetrino portaoggetti e quindi coprire con vetrino coprioggetti. Test positivo: sviluppo rapido di effervescenza (O 2 ) positivo: Staphylococcus negativo: Streptococcus

58 Gram positivi test coagulasi la coagulasi è un enzima liberato da alcuni batteri in grado di coagulare il plasma citrato di coniglio. E' possibile produrre due forme differenti di coagulasi, libera o legata. Il test in provetta è in grado di rilevare la presenza di coagulasi libera e legata. positivo: Staphylococcus aureus negativo: Staphylococcus epidermidis Esame microscopico cocchi gram positivi Aspetto delle colonie su agar sangue di S.aureus

59 Classificazione degli streptococchi clinicamente significativi

60 Cocchi Gram positivi: Streptococchi sferici, con diametro di μm, disposti in coppie o catenelle capsulati immobili asporigeni ossidasi-negativi catalasi-negativi aerobi-anaerobi facoltativi

61 Cocchi Gram positivi: Streptococcus pyogenes Test della sensibilità alla bacitracina Agar Sangue (5% sangue di montone) Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2 cresce anche in atmosfera aerobia emolisi totale (di tipoβ) Test della identificazione dell antigene polisaccaridico C metodica di Lancefield (agglutinazione)

62 Cocchi Gram positivi: Streptococchi e enterococchi Streptococcus agalactiae Non presentano emolisi, solo raramente presentano emolisi β. Sono caratterizzati dal possesso dell antigene polisaccaridico di gruppo B Enterococchi Appartengono al genere Streptococcus. Non presentano emolisi, solo raramente presentano emolisi β. Sono caratterizzati dal possesso dell antigene polisaccaridico di gruppo D

63 Cocchi Gram positivi: Streptococcus pneumoniae Test della sensibilità all optochina AgarSangue (5% sangue di montone) Incubazione a 37 C in presenza di 5% CO2 cresce anche in atmosfera aerobia. emolisi parziale del sangue (di tipo α)

64 Gram negativi Proteus su Agar sangue e mac conkey Escherichia coli su Agar mac conkey pseudomonas su Agar mac conkey

65 Gram negativi Non fermentanti fermentanti

66 Bacilli Gram negativi: Enterobacteriaceae terreno indicatore McConkey Agar Vengono incubate a 37 C in atmosfera aerobia Bacilli Gram-negativi asporigeni mobili per ciglia peritriche o immobili provvisti di pili aerobi o anaerobi facoltativi ossidasi-negativi

67 Bacilli Gram negativi: non Enterobacteriaceae o batteri non fermentanti non fermentano Crescono su qualsiasi terreno gli zuccheri bastoncelli diritti o incurvati mobili (uno o più flagelli polari) isolati o a coppie o in brevi catene asporigeni catalasi-positivi ossidasi-positivi aerobi Esame microscopico col.gram P.aeruginosa Il test dell ossidasi differenzia gli enterobatteri dai batteri gram negativi non fermententi.i batteri lattosio non fermentanti ( pseudomoniaceae ) posseggono l'enzima citocromo ossidasi, la cui presenza può essere messa in evidenza dalla ossidazione di un accettore artificiale di elettroni la tetra-metil-para-fenilendiammina

68 Gram negativi : salmonella bacilli Gram-negativi asporigeni, aerobi facoltativi. Fermentano il glucosio, producendo gas (acido solfidrico), riducono i nitrati e non producono citocromo-ossidasi. La maggior parte non fermenta il lattosio Salmonella colonie nere produttrici (acido solfridico) Salmonella Colorazione rosa su terreno cromogeno

69 Bacilli Gram negativi: Haemophilus Cresce su Agar Cioccolato (10% sangue di montone emolizzato incubazione a 37 C in presenza di 5%CO2 Fattore X, termostabile Fattore V, termolabile (NAD) Alternativamente può essere seminato su terreno TSA (Tryptic Soy Agar) addizionato dei fattori X +V

70 ID BIOCHIMICA : metodo manuale (BioMèrieux) identification System

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72 ID BIOCHIMICA : metodo automatizzato SIEMENS

73 Grazie