INFINITI Warfarin Assay (2C9 & VKORC1 Multiplex Assay) Metodica

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1 INFINITI Warfarin Assay (2C9 & Multiplex Assay) Metodica Per uso diagnostico In Vitro FOR EXPORT ONLY Prodotto da AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA Rappresentante EU Autorizzato : BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Svizzera 1 su 10

2 USO INFINITI Warfarin Assay è un test in vitro per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genetiche *2, *3,di CYP2C9 e della variante intronica 3673 (-1639) in DNA ricavato da sangue umano EDTA. INFINITI Warfarin Assay è un test qualitativo da eseguirsi in laboratori clinici dietro richiesta del medico curante. INFINITI Warfarin Assay è indicato per identificare soggetti a rischio di reazione avversa al Warfarin INFORMAZIONI GENERALI Il Warfarin è un anticoagulante largamente prescritto in pazienti con trombosi venosa, embolia polmonare, fibrillazione atriale cronica e sostituzioni di valvole cardiache. La FDA stima che ogni anno due milioni di persone intraprendono la terapia con Warfarin 2. Fattori individuali come assunzione di vitamina K, stato di malattia, età, sesso, terapie concomitanti, superficie corporea e differenze genetiche possono influenzare la risposta del paziente al Warfarin. Il Warfarin agisce interferendo con il riciclo della vitamina K, che porta alla riduzione dell attività di alcuni fattori della coagulazione. I due geni che interferiscono con la farmacocinetica e la farmacodinamica del Warfarin sono il CYP2C9 (cytochrome P450 2C9) e il (subunità 1 del complesso vitamina K epossido reduttasi). Questi due geni, insieme con altri fattori come età, superficie corporea e sesso, spiegano parzialmente la variazione individuale della risposta al Warfarin 1. Diversi studi suggeriscono che la variabilità individuale nella risposta al Warfarin possa dipendere da varianti individuali dei geni CYP2C9 e 2. CYP2C9 Il Warfarin è fornito come miscela racemica di isomeri R e S; l isomero S ha da 3 a 5 volte la potenza della forma R. Dopo la somministrazione orale, la warfarina libera è captata dal fegato e qui metabolizzata dal citocromo P450. L isomero S è metabolizzato dal citocromo P450, subfamiglia IIc, polipeptide 9 proteine (CYP2C9) e eventualmente escreto con la bile 3. CYP e CYP sono le varianti CYP2C9 per le quali è dimostrata attività enzimatica ridotta 5,9. La variante omozigote *2*2 porta a una riduzione dell attività CYP2C9 di circa il 12% rispetto al wild type, mentre la variante omozigote *3*3 ha attività inferiore di circa il 15% rispetto al wild type 4. In uno studio retrospettivo, è stato dimostrato che pazienti con una o entrambe le varianti genetiche richiedevano una dose di mantenimento del Warfarin inferiore a quella necessaria a pazienti wild type 5, 7, 8. L attività anticoagulante del Warfarin è dovuta all inibizione della vitamina K epossido reduttasi, importante per l attivazione di vari fattori della coagulazione. Diversi studi suggeriscono che polimorfismi di singoli nucleotidi (SNPs) nella subunità C1 del complesso 2,3 della vitamina K epossido reduttasi () possono influenzare la sensibilità al Warfarin. I polimorfismi del gene tendono a presentarsi in blocchi di aplotipi con particolari combinazioni in forte linkage disequilibrium. L identificazione di un singola componente del blocco è spesso predittiva per l intero aplotipo 7. L identificazione del polimorfismo 3673 (-1639) che è in comune agli aplotipi H1 e H2, può essere predittivo della risposta individuale al Warfarin. 2 su 10

3 PRINCIPIO DEL TEST INFINITI Warfarin Assay è progettato per rilevare simultaneamente le varianti genetiche *2, *3 di CYP2C9 e la variante introniche 3673 (-1639) di. Il test è basato sui seguenti processi principali: (a) Estrazione del DNA (b) Amplificazione mediante PCR del DNA purificato da DNA genomico umano (c) Estensione del primer analita specifico con incorporazione del marcato (ASPE) (d) Ibridazione del primer esteso e fluorescente su un microarray e successivo lavaggio (e) Scansione del microarray (f) Rilevazione del segnale e elaborazione (determinazione dei genotipi,, 3673 (- 1639) I passaggi da (c) a (f) sono automatizzati sull Analizzatore INFINITI. Di seguito lo schema del test DESCRIZIONE DEL DISPOSITIVO INFINITI Warfarin Assay è un dispositivo diagnostico in vitro basato sulla tecnologia del microarray su film brevettata da AutoGenomics, associata a processi di automazione, gestione dei reagenti e impiego di software per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genetiche *2, *3 del CYP2C9 e delle varianti introniche 3673 (-1639) in DNA genomico ottenuto da campioni di sangue umano. INFINITI Warfarin Assay comprende BioFilmChip Microarray, Modulo Reagenti Intellipac. Il BioFilmChip Microarray è formato da una pellicola di poliestere coattata con componenti multi-strato brevettati per ottimizzare l analisi del DNA. Gli strati sono stati progettati per fornire una superficie versatile che aumenti le prestazioni del test. I microarray sono test specifici. INFINITI Warfarin Assay utilizza un microarray chip (R-chip) che contiene Sonde a Cattura non utilizzate che potrebbero essere potenzialmente impiegate per aggiungere altri test specifici. Quindi test multipli possono essere sviluppati utilizzando lo stesso microarray. Il Modulo Reagenti Intellipac contiene quattro scomparti che alloggiano i reagenti del test. Il Modulo Reagenti Intellipac ha un chip di memoria integrato che conserva le informazioni sui reagenti quali numero di lotto, data di scadenza, volumi. INFINITI Warfarin Assay è automatizzato mediante l analizzatore INFINITI. L Analizzatore INFINITI è uno strumento multiplex che misura i segnali in fluorescenza di target marcati di DNA ibridati a BioFilmChip microarray. L Analizzatore INFINITI automatizza il test INFINITI Warfarin Assay integrando tutti i singoli processi di gestione dei campioni (PCR amplicon), dei reagenti, l ibridazione, la rilevazione 3 su 10

4 e l analisi dei risultati. I test sono processati automaticamente e gli spot vengono letti dal microscopio confocale interno. I risultati sono analizzati ed espressi come genotipo. Le istruzioni per il corretto utilizzo dello strumento sono contenute nel Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Requisiti Ad uso diagnostico in vitro. Da utilizzarsi solo a cura di personale di laboratorio qualificato. Questo test deve essere utilizzato solo per campioni di sangue intero EDTA. Non congelare/scongelare il campione. I campioni devono essere processati prima possibile. Tutti i campioni dei pazienti sono da considerarsi potenzialmente pericolosi. Prestare attenzione nel trattamento di materiali di origine umana. Nessun metodo può garantire l assenza di HCV, HIV o di altri agenti infettivi. Seguire le Linee Guida CLSI (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3-A). Verificare visivamente le condizioni dei campioni al loro ricevimento. Ricercare eventuali segni di compromissione dell integrità del campione (i.e. evaporazione, diminuzione del volume, precipitazione, sedimentazione, separazione, torbidità eccetera). Se si riscontra una qualsivoglia anormalità del campione, non procedere con il test. I campioni devono essere trattati con estrema cautela per prevenire contaminazione, dispersione o mix tra campioni diversi. I contenitori dei campioni devono essere etichettati chiaramente, per prevenire scambi di materiale. Conservare i campioni come specificato. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni crociate, la preparazione del campione, il set up della reazione di PCR e l analisi del prodotto della PCR dovrebbero essere effettuate seguendo linee guida approvate come le CLSI (Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Non costituire pool o miscele di reagenti di lotti diversi. Non usare kit o reagenti oltre la data di scadenza. Conservare kit e reagenti secondo quanto riportato sull etichetta del prodotto. Procedure di Laboratorio Seguire le normali procedure per il trattamento dei reagenti di laboratorio. Seguire le norme di sicurezza del laboratorio: non pipettare con la bocca; indossare indumenti protettivi (ad es., guanti monouso, camici da laboratorio) e protezioni oculari; non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio; lavare le mani accuratamente dopo aver manipolato campioni e reagenti. Manipolazione dei Rifiuti Smaltire reagenti non usati, campioni e rifiuti secondo quanto previsto dalla vigente normativa nazionale. Le Schede di Sicurezza (MSDS) sono disponibili presso il Customer Service Medical Systems S.p.A. Preparazione del Campione Fare riferimento alle istruzioni di sicurezza riportate nella metodica fornita con il kit per l estrazione del DNA. Il prodotto ottenuto dalla PCR non può essere conservato prima di essere caricato nell Analizzatore INFINITI. Usare immediatamente. Analizzatore INFINITI Leggere il Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI prima di utilizzare lo strumento. Fare particolare attenzione alle Note. Seguire le indicazioni relative a Avvertenze e Precauzioni di Sicurezza contenute nel Manuale dell Operatore. 4 su 10

5 Fare riferimento alla Sezione Requisiti di Installazione per l installazione dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Errori quando si riscontrano errori durante l operatività dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Help quando si riscontrano problemi. CONSERVAZIONE/STABILITA AutoGenomics BioFilmChip Microarray: Reagente Intellipac: Mix di Amplificazione: 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) Nota: Non usare il Reagente Intellipac oltre quattro settimane dall apertura. 18 mesi dalla data di produzione, congelato (da -30 C a -15 C) Nota: la data di scadenza per ogni singola confezione è stampata sull etichetta. RACCOLTA CAMPIONE E STABILITA Sangue periferico prelevato in provetta EDTA (tappo porpora). Non congelare/scongelare i campioni di sangue. I campioni devono essere processati nel più breve tempo possibile. MATERIALI FORNITI (SUFFICIENTI PER 48 TEST) AutoGenomics Codice n INFINITI Warfarin Assay BioFilmChip Microarray Magazine 4 magazine/confezione AutoGenomics Codice n INFINITI Warfarin Assay Intellipac Reagent Management Module: 2 moduli/confezione. Ogni Intellipac contiene: 1,4 ml ASPE master mix composto da: d[agt]tp Mix Cy5 dctp ASPE Primer Mix PCR Buffer 2.6ml Buffer di Ibridazione SSC Conservante Sodio Azide Hybridization Positive Control (Pos C-PTAG10, Cy5) AutoGenomics Codice n INFINITI Warfarin Assay Amplification Mix: 4 x 250µl provette di PCR reaction master mix, ciacuna contenente: d[agt]tp Mix dctp PCR Primer Mix MgCl 2 PCR Buffer AutoGenomics Codice n : Tampone di lavaggio REAGENTI NECESSARI MA NON FORNITI Kit di Estrazione DNA - INFINITI Warfarin Assay può rilevare le varianti genetiche e e 3673 (-1639) da DNA genomico isolato da sangue con sufficiente purezza, i.e.con ratio di assorbanza 260nm- 280nm di Può essere utilizzato ogni sistema di estrazione del DNA che rispetti queste specifiche. INFINITI 2C9- è stato testato con diversi kit commerciali. Gli utilizzatori possono contattare il Servizio Prodotti Medical Systems per ulteriori informazioni. Acqua Distillata (DNAse and RNAse free) Titanium taq DNA Polimerasi 5 su 10

6 ATTREZZATURA Attrezzatura necessaria non fornita con i reagenti: AutoGenomics Codice n : Analizzatore INFINITI. AutoGenomics Codice n : Puntali INFINITI AutoGenomics Codice n : INFINITI micropiastre da 24 pozzetti/coperchi Pipette Mini Centrifuga Puntali per pipette Racks per provette da Microfuge Thermocycler Vortex Provette a parete sottile per PCR da 0.2 ml Provette per microcentrifuga da 1,5 ml Piastra 24-Well (24 WP) PROCEDURA DEL TEST Estrazione del DNA Seguire le istruzioni fornite nel kit usato per l estrazione del DNA. Reazione PCR Nota: Il prodotto della PCR non può essere conservato: caricarlo immediatamente nell analizzatore INFINITI. 1. Scongelare e portare a temperatura ambiente la provetta della Amp Mix e mantenere in ghiaccio la Taq DNA polimerasi. 2. Vortexare la provetta Amp Mix 2-5 sec per mescolare i reagenti e centrifugare brevemente per portare il contenuto sul fondo della provetta. Includere un controllo negativo in ciascun set up della reazione di PCR. Amp Mix 17.5 µl Taq DNA polimerasi 0.5 µl Template DNA (25ng/ul) 2.00 µl Totale 20.0 µl Per il Controllo negativo PCR, aggiungere 1µl di acqua DNase free. 3. Vortexare le provette 2 5 secondi per miscelare i componenti e poi centrifugare brevemente. Importante: Assicurarsi che i tubi siano perfettamente tappati per evitare evaporazione o fuoriuscite del materiale. 4. Posizionare le provette nel thermocycler impostando le seguenti condizioni. Conditioni PCR Multiplex 2 Tm Step Temperatura C Tempo No. di Cicli No minuti secondi 60 (-0.5 C/cycle) 30 secondi secondi 2 (touch down) secondi 30 secondi 30 secondi minuti Hold su 10

7 Nota: Il tempo totale della PCR deve essere 1 ora e 38 minuti ± 5 minuti Si raccomanda di impostare la reazione PCR nelle micropiastre INFINITI da 24 pozzetti (WP24) per ridurre al minimo la manipolazione del campione nei passaggi successivi Per evitare una potenziale contaminazione, si raccomanda un area di lavoro separata per la PCR. Assicurarsi che non ci sia evaporazione abnorme del prodotto della PCR. A PCR completata, verificare visivamente eventuali anomalie di volume. I volumi delle PCR devono essere circa 20 l : in caso contrario, non procedere con il test. Caricamento Campioni Seguire le istruzioni del Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI (codice N EM-34000). 1. Dispensare i 20 µl di prodotto della PCR nella piastra WP24 e caricarla nell Analizzatore INFINITI. 2. Caricare il BioFilmChip Magazine, il Modulo Intellipac, i puntali e il tampone di lavaggio specifici. Operazioni dell Analizzatore INFINITI Fare riferimento al Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI (codice N EM-34000). CONTROLLO DI QUALITA Si raccomanda di inserire in ciascuna seduta un controllo positivo (eterozigote e/o omozigote per i genotipi studiati), un controllo negativo (un campione che non contenga la mutazione di interesse, i.e. un campione wild type) ed un Controllo No Template (acqua Molecular Grade). I requisiti del controllo di qualità devono essere conformi alle richieste delle vigenti regolamentazioni. Nota: Il thermocycler usato deve essere regolarmente sottoposto a manutenzione e calibrato con uno standard esterno di temperatura, secondo le norme del laboratorio ed i requisiti del CQ. LIMITAZIONI I risultati ottenuti con INFINITI Warfarin Assay dovrebbero essere usati ed interpretati soltanto in un contesto globale di diagnosi clinica. AutoGenomics non è responsabile di qualsiasi decisione clinica venga presa. Nel gene sono stati osservati altri polimorfismi oltre che 3673G>A, come altre varianti oltre *2 e *3 sono state osservate in 2C9. Warfarin Assay non riporta queste altre variazioni. INTERPRETAZIONI DEI RISULTATI I risultati di INFINITI Warfarin Assay sono refertati come call indicanti che tipo di genotipo è stato rilevato nel campione, i.e. Wild Type, Omozigote o Eterozigote per, *3 e 3673 (-1639). Quando i risultati del test non sono completi, e non sono riportate le call, viene generata una pagina bianca con un messaggio. Il test deve essere ripetuto. Il messaggio indica il motivo per il quale le call non sono andate a buon fine. Se c è stato un errore (e.g DNA insufficiente) viene generata un error log per identificare il problema. Quando INFINITI genera un messaggio di errore, far riferimento alla sezione Risoluzione dei Problemi del Manuale dell Operatore INFINITI. A seconda del messaggio/errore, il test deve essere ripetuto solo dopo che il problema/errore è stato risolto. PRESTAZIONI DEL TEST Specificità Analitica Durante lo sviluppo di questo test sono stati condotti studi di specificità. La specificità dei primer della PCR è stata determinata dalla dimensione della banda del frammento amplificato su gel e dal sequenziamento del frammento amplificato. La specificità del primer ASP è stata confermata ottenendo risultati corretti da campioni genomici noti. 7 su 10

8 La specificità delle sonde di cattura è stata determinata per ibridazione con diversi oligonucleotidi, dimostrando che l oligo corretto ibridizza lo spot noto. Sensibilità Analitica Da un campione di DNA noto e purificato, state preparate diluizioni seriali (200, 100, 50, 25, 10, 1, 0,1 ng di DNA). ogni diluizione è stata testata tre volte utilizzando INFINITI Warfarin Assay. Lo studio ha stabilito che la concentrazione minima di DNA necessaria per INFINITI Warfarin Assay è 1ng. La concentrazione raccomandata per il test è 25 ng/ml. Il test richiede 2 µl di campione, cioè 50 ng. Lo studio ha dimostrato che concentrazioni di DNA di 100 e 200 ng, cioè in eccesso rispetto alla concentrazione raccomandata (50 ng), non interferiscono con INFINITI Warfarin Assay. Correlazione con altro metodo Gli studi di comparazione di INFINITI Warfarin assay verso il sequenziamento bidimensionale, eseguiti in tre diversi laboratori clinici, hanno dimostrato: 98,0% di correlazione per il genotipo comparato al sequenziamento bidirezionale, alla prima seduta, 100% finale 97,3% di correlazione per il genotipo comparato al sequenziamento bidirezionale, alla prima seduta, 99,3% finale 98,0% di correlazione per i genotipi 3673 (-1639) comparati al sequenziamento bidirezionale, alla prima seduta, 100% finale I risultati degli studi di comparazione sono riassunti nella tabella 1 Genotipo *1/*2 *2/*2 *1/*1 Totale per *1/*3 *3/*3 *1/*1 Totale per 3673 (-1639) GA 3673(-1639) AA 3673 (-1639) GG Totale per 3673 (-1639) Totale per Assay Tabella 1: Correlazione fra INFINITI Warfarin Assay e Sequenziamento Bi-direzionale Numero di Numero di Numero di Numero di Numero di Calls Correlazione Campioni Calls No Calls Calls Corrette Calls Scorrette alla Prima Testati Corrette alla alla Prima alla Scorrette alla alla prima Corsa Prima Corsa Corsa Ripetizione Ripetizione Corsa Numero di No Calls alla Ripetizione Correlazione Dopo la Ripetizione (Finale) % % % % % % % % % % % % * % * % % % % % % % % % % % * % * % 8 su 10

9 * I risultati iniziali di INFINITI (*1/*1 per, *1/*3 per e GG per 3673) non correlano con quelli del sequenziamento. Ripetendo la corsa sono stati ottenuti gli stessi risultati. Ragione non nota Riproducibilità Inter-Laboratorio Per dimostrare la riproducibilità di INFINITI Warfarin Assay, è stato condotto uno studio in tre diversi laboratori, utilizzando tre lotti del kit. I laboratori hanno testato gli stessi campioni, costituiti da sette DNA genomici e cinque sangue in toto. I laboratori hanno lavorato in cieco rispetto all identità dei campioni. Ogni laboratorio ha utilizzato un differente metodo di estrazione del DNA. In ogni laboratorio, ogni campione è stato testato in duplicato per giorno/operatore per sei giorni. In ogni laboratorio si sono alternati tre diversi operatori. I risultati dello studio di riproducibilità sono riassunti nelle Tabelle 2. Tabella 2: Riproducibilità Inter-Laboratorio di INFINITI Warfarin Assay rispetto alle calls Genotipo Tests Prima Corsa Finale (Dopo una Ripetizione) Campioni # Calls Genotipo per Lab Calls Calls No % Calls Calls Calls No % Calls Testati Genotipo Lab. corrette scorrette Calls corrette corrette scorrette Calls corrette b *1/* tot *2/*2 *1/* b tot a tot Totale per *1/*3 *3/* b tot c tot a b *1/* tot Totale per (- 1639) GA 3673 (- 1639) AA 3673 (- 1639) GG b tot b tot a tot Totale per 3673 (-1639) * Risultati dopo una ripetizione dei campioni 9 su 10

10 Interferenze Studi di valutazione dell interferenza da bilirubina, colesterolo ed eparina, dimostrano che la presenza di queste componenti a concentrazione di bilirubina 8mg/dl, colesterolo 70 mg/dl, ed eparina 133 v/dl non interferisce con INFINITI Warfarin Assay Carry-Over Non è stato riscontrato carry-over tra campioni testando 300 ng di campione positivo seguito da 10 ng di un secondo campione positivo, e 300 ng di un campione positivo seguito da un No template Contro o acqua. Le call erano corrette al 100%. Interferenza di altri Dosaggi Testare INFINITI Warfarin Assay e INFINITI Fattore II e Fattore V sullo stesso strumento non interferisce con i risultati dei test, i.e. INFINITI Warfarin Assay non compromette i risultati di INFINITI Fattore II e Fattore V, e vice versa. BIBLIOGRAFIA 1 Wadelius M et al Pharmacogenetics of warfarin: current status and future challenges The Pharmacogenomics Journal (2007) 7, FDA Approves Updated Warfarin (Coumadin) prescribing Information FDA News, August 16, Gage B Pharmacogenetics-Based Coumarin Therapy Hematology Caldwell M et al Evaluation of Genetic factors for Warfarin Dose prediction Clinical medicine & Research (2007) Volume 5, Number 1: Cho H et al Factors affecting the interindividual variability of warfarin dose requirement in adult Korean patients Pharmacogenomics (2007) 8(40, Lee CR, Goldstein JA, Peiper JA Cytochrome P450 2C9 polymorphisms: a comprehensive review of the invitro and human data Pharmacogenetics 2002; 12: Rieder M et al Effect of Haplotypes on Transcriptional Regulation and Warfarin Dose The New England Journal of Medicine (June 2, 2005) 352;22. 8 Takahashi H et al Pharmacogenetics of CYP2C9 and interindividual variability in anticoagulant response to warfarin The Pharmacogenomics Journal (2003) 3, Takahashi H et al Different contributions of polymorphisms in and CYP2C9 to intra- and interpopulation differences in maintenance dose of warfarin in Japanese, Caucasians and African-Americans Pharmacogenetics and Genomics 2006, Vol 16 No su 10