Valore diagnostico degli oncogeni BRAF V600E e RET/PTC nei noduli tiroidei

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1 415 Recenti Prog Med 2013; 104: Valore diagnostico degli oncogeni BRAF V600E e RET/PTC nei noduli tiroidei Anna Guerra 1, Mario Carrano 2, Elisabetta Angrisani 2, Mario Vitale 1 Riassunto. La citologia su prelievo con ago sottile (FNC) è lo strumento principale per la diagnosi dei noduli tiroidei. Scopo di questo studio è determinare il valore diagnostico degli oncogeni BRAF V600E e RET/PTC, in una ampia casistica di noduli tiroidei con citologia inconclusiva. Abbiamo ricercato i due oncogeni in campioni citologici di 299 noduli tiroidei sottoposti a chirurgia. RET/PTC non era specifico per carcinoma. La ricerca dell oncogene BRAF V600E risultava utile in 25 casi, consentendo l identificazione di un PTC in 2 FNC falsi negativi, 2 inadeguati, 11 indeterminati e 10 sospetti. La ricerca dell oncogene BRAF V600E è un utile supporto alla FNC inconclusivo. Parole chiave. BRAF V600E, RET/PTC, noduli tiroidei. Diagnostic value of BRAF V600E and RET/PTC oncogenes in thyroid nodule aspirates Summary. Fine-needle aspiration cytology (FNC) is the primary means to distinguish benign form malignant nodules. Aim of this study is to evaluate the diagnostic value of BRAF V600E and RET/PTC oncogenes in a large cohort of thyroid nodules with inconclusive FNC. We searched for BRAF V600E and RET/PTC in 299 thyroid nodule aspirates then removed by surgery. RET/PTC demonstrated a poor specificity. The search for BRAF V600E demonstrated to be useful in 25 cases, identifying a PTC in 2 false negative, 2 inadequate, 11 indeterminate and 10 suspicious FNC. Detection of BRAF V600E revealed to be a useful tool to refine inconclusive cytology. Key words. BRAF V600E, RET/PTC, thyroid nodules. Introduzione Il gozzo nodulare è una patologia molto frequente, la cui prevalenza varia in funzione di fattori genetici, alimentari e ambientali 1. In particolare, il gozzo multinodulare è più frequente nelle aree con carenza iodica. Il gozzo nodulare è caratterizzato dalla presenza di uno o più noduli nella tiroide, più spesso asintomatici, talvolta presentanti sintomi di alterata funzione tiroidea o sintomi locali. La maggior parte dei noduli tiroidei è di natura benigna e solo il 4-5% di questi noduli sono maligni. Mentre i noduli benigni necessitano di una terapia medica o più spesso del solo follow-up, i noduli maligni richiedono la exeresi chirurgica 2. Per evitare interventi chirurgici non necessari, non appropriati o tardivi, è molto importante una diagnosi precisa e tempestiva. La diagnosi differenziale tra noduli benigni e maligni è affidata alla citologia su prelievo con ago sottile (FNC) 3-6. La FNC è una metodica semplice, rapida e poco costosa ma che richiede una particolare esperienza da parte dell anatomopatologo, anche perché spesso il nodulo si trova nel contesto di altre malattie tiroidee che ne rendono l esame più complesso 7,8. Questa metodica consente di classificare l esame citologico in categorie. Una classificazione molto usata è quella della Società Italiana di Anatomia Patologica e Citologia diagnostica (SIAPEC) che comprende 5 categorie (TIR 1-TIR 5) 9. Tuttavia, circa il 25% delle FNC produce un risultato inconclusivo (inadeguato, indeterminato o sospetto per malignità), costringendo ad una tiroidectomia a scopo diagnostico. Per tale motivo in questi ultimi anni, i ricercatori hanno cercato metodiche alternative o ancillari per perfezionare l esame citologico con risultato inconclusivo. Quelle basate sulla ricerca di marcatori molecolari specifici sono state le metodiche che hanno fornito i risultati più promettenti. BRAF V600E è il prodotto di una mutazione puntiforme che trasforma la chinasi BRAF in un potente oncogene, tra i più diffusi nei tumori umani. BRAF V600E è presente in circa il 50% dei tumori tiroidei papillari (PTC) ed è altamente specifico in quanto non è mai presente nei noduli benigni, negli adenomi, e nei carcinomi follicolari (FTC) della tiroide 10. RET/PTC è il prodotto di una ricombinazione del cromosoma 10 che porta alla produzione di una proteina chimerica costituita dal dominio tirosino-chinasico di RET con un gene costitutivamente espresso nella cellula tiroidea. Ad oggi, sono più di 13 le ricombinazioni RET/PTC conosciute, ma RET/PTC-1 e RET/PTC-3 sono le più frequenti. Mentre i primi studi condotti su RET/PTC as- 1 Dipartimento di Medicina e Chirurgia, Università di Salerno; 2 Azienda Ospedaliero-Universitaria San Giovanni di Dio e Ruggi D Aragona, Salerno. Pervenuto il 26 giugno 2013.

2 416 Recenti Progressi in Medicina, 104 (7-8), luglio-agosto 2013 segnavano a questo oncogene una specificità assoluta per il PTC, quelli successivi hanno dimostrato che questa ricombinazione può essere presente anche in noduli benigni, adenomi e nella tiroidite di Hashimoto, seppure solo in un sottogruppo di cellule 11. Molti studi sono stati condotti sul valore diagnostico di questi oncogeni, perlopiù singolarmente. In alcuni studi, l impiego di RET/PTC è stato esaltato come marcatore specifico per il PTC, mentre altri sono giunti a conclusioni più critiche, soprattutto per la sua presenza in lesioni benigne, seppure sporadica. Poco numerosi e non sempre concordanti sono i lavori che hanno considerato questi due oncogeni contemporaneamente, anche se il loro utilizzo contemporaneo dovrebbe garantire una sensibilità diagnostica maggiore. Per tale motivo, abbiamo determinato il valore diagnostico di questi due oncogeni, in un ampia casistica di noduli tiroidei di cui erano disponibili il materiale citologico per l analisi molecolare, la diagnosi citologica e quella istologica definitiva. Materiali e metodi Sono stati studiati 299 campioni citologici di noduli tiroidei di pazienti successivamente sottoposti a tiroidectomia per citologia certa o sospetta per carcinoma o indeterminata. I pazienti venivano selezionati partendo dall esame istologico e includendo pazienti consecutivi con esame definitivo di nodulo tiroideo benigno, o di tumore differenziato (PTC o FTC). I pazienti con citologia inconclusiva o benigna sottoposti a tiroidectomia erano operati per le complicanze locali o ragioni estetiche. I campioni citologici sono stati ottenuti utilizzando una siringa con un ago di 22 G passato 3-4 volte attraverso il nodulo. L ago, dopo aver prodotto gli allestimenti citologici, veniva lavato in tampone di estrazione per gli acidi nucleici. La classificazione cito/istologica dei campioni è stata effettuata in accordo con la classificazione SIA- PEC/British Thyroid Association e Royal College of Physicians 9. Il prelievo citologico veniva eseguito sotto guida ecografica avendo cura di verificare se la modularità fosse intratiroidea o extratiroidea 12,13. La classificazione prevede 5 categorie: TIR 1, prelievo inadeguato; TIR 2, citologia certamente benigna; TIR 3, citologia indeterminata; TIR 4, citologia sospetta per malignità; TIR 5, campione certamente maligno. ESTRAZIONE DEL DNA E ANALISI DELLA MUTAZIONE BRAF T1799A L estrazione del DNA dai FNAB è stata condotta mediante l utilizzo del TRI REAGENT (Sigma, St. Louis, MO) seguendo il protocollo della casa produttrice. Il precipitato finale veniva risospeso in 10 μl di acqua DEPC, e la concentrazione del DNA estratto da tutti i campioni veniva quantizzata con un Biofotometro (Eppendorf, Amburgo, Germania) leggendone l assorbanza a 260 nm. La ricerca di mutazione nel gene BRAF veniva eseguita attraverso la metodica del pirosequenziamento. La metodica veniva eseguita come descritta in dettaglio 14. In breve, il DNA veniva amplificato mediante PCR, ridotto in singola catena, ibridizzato con il primer di sequenza e sintetizzato in un apparecchio PSQ96MA (Biotage, Uppsala, Svezia). La soglia di positività veniva calcolata del 5%, al di sopra della quale il campione veniva classificato positivo per la mutazione di BRAF. ESTRAZIONE DELL RNA E RT-PCR L RNA totale veniva estratto usando il TRI REA- GENT e seguendo il protocollo suggerito. Il precipitato finale veniva risospeso in 10 μl di acqua DEPC e retrotrascritto utilizzando la SuperScript III (Invitrogen, Milano, Italia) in 20 μl di volume di reazione con i random primer. La presenza di cellule follicolari epiteliali, l integrità dell RNA e l efficienza della reazione di retro-trascrizione in ogni campione è stata confermata mediante una RT-PCR utilizzando primer specifici per la tireoglobulina (tabella 1). RET/PTC-1 e RET/PTC-3 venivano ricercati mediante Southern-blot sugli ampliconi prodotti con la PCR, usando gli appropriati primer e sonde specifici per il dominio tirosino-chinasico (TK) di RET e per sequenze di H4 e ELE1 (tabella 1) 15. STATISTICA Il valore predittivo positivo veniva calcolato secondo la formula: (vero positivo/vero positivo + falso positivo) x 100. Il valore predittivo negativo veniva calcolato secondo la formula: (veri negativi/veri negativi + falsi negativi) x 100. Risultati Abbiamo analizzato 299 FNC che all esame istologico risultavano essere 222 noduli benigni, 65 PTC e Tabella 1. Primer e sonde per il sequenziamento di BRAF e la ricerca di RET/PTC. BRAF V600E RET/PTC-1 RET/PTC-3 Gene Primers per PCR Primers per sequenza Forward: 5 -TGAAGACCTCACAGTA AAAATAGG-3 Reverse: 5 -biotin-acaaaatggatc AGACAACTG-3 For: GCTGGAGACCTACAAACTGA Rev: GTTGCCTTGACCACTTTTC For: AAGCAAACCTGCCAGTGG Rev: CTTTCAGCATCTTCACGG 5 -GTGATTTTGGTCTAGCTAC-3 Sonde (5-3 ) GGCACTGCAGGAGGAGAACCGCGA- B GGA- ATTCCCTCGGAAGAACT-B GGTCGGTGCTGGGTATGTAAGGA-B GGAATTCCCTCGGAAGAACT-B

3 A. Guerra et al.: Valore diagnostico degli oncogeni BRAF V600E e RET/PTC nei noduli tiroidei FTC. In tutti i campioni, è stata riscontrata l espressione della tireoglobulina, confermando la possibilità di effettuare la ricerca degli oncogeni. Complessivamente, la mutazione BRAF V600E veniva riscontrata in 39 campioni, mentre la ricombinazione RET/PTC in 58 (tabella 2). I risultati degli esami citologico, molecolare e istologico effettuati sui noduli sono riportati in tabella 3. Dei 18 noduli TIR 1 al FNC, 4 risultavano PTC all istologia. Di questi, 2 risultavano positivi per BRAF V600E e 1 per RET/PTC, mentre 2 benigni contenevano l oncogene RET/PTC. Dei 178 noduli TIR 2, 4 risultavano falsi negativi (2 PTC, 1 FTC). Di questi, 2 PTC contenevano BRAF V600E. I noduli TIR 3 all esame citologico erano 54. Di questi, 26 risultarono tumori maligni (19 PTC e 7 FTC). Dei 19 PTC, 11 contenevano BRAF V600E e 8 RET/PTC. I noduli sospetti per carcinoma (TIR 4) erano 28. I carcinomi erano Tabella 2. Numero di casi studiati e positività per l indagine molecolare. Campioni positivi per Istologia BRAF V600E RET/PTC Benigno PTC FTC Totale all esame istologico. Di questi, 10 e 6 esibivano rispettivamente BRAF V600E e RET/PTC. Infine, nessuno dei 21 FNC TIR 5 risultarono falsi positivi. Questi tumori erano tutti PTC, di cui 14 erano positivi per BRAF V600E e 8 per RET/PTC. Nessuno dei 222 noduli istologicamente benigni e dei 12 FTC erano positivi per BRAF V600E, mentre RET/PTC era documentato in 35 noduli benigni (15,8%), in 23 PTC (35,4%) e in nessun FTC. La prevalenza di BRAF V600E nel PTC era 60%, mentre non era mai presente nei noduli benigni e nel FTC. La ricerca di BRAF V600E nel materiale bioptico di FNC inconclusivo si dimostrava un utile strumento per perfezionare la diagnosi pre-operatoria dei noduli tiroidei. Discussione Questo studio mette in evidenza come l uso delle più recenti metodiche di biologia molecolare e la conoscenza di alcuni meccanismi patogenetici dei tumori tiroidei possano aiutare a migliorare la diagnostica citologica dei noduli tiroidei. Anche se l incidenza di carcinoma tiroideo è bassa, attestandosi intorno a 9 casi/anno per abitanti, la necessità di migliorare la diagnostica citologica dei noduli tiroidei è molto sentita per il gran numero di ago aspirati eseguiti annualmente. Infatti, il numero elevato di FNC inconclusivi determina un elevato numero di interventi di tiroidectomia a scopo diagnostico che è stimato essere in Italia alme- Tabella 3. Citologia, Istologia ed analisi molecolare di 299 campioni citologici. Citologia N Genotipo Istologia N BRAF V600E RET/PTC 0 2 B 14 TIR 1 Inadeguati PTC FTC B 174 TIR 2 Benigni PTC FTC B 28 TIR 3 Indeterminati PTC FTC B 6 TIR 4 Sospetti PTC FTC B 0 TIR 5 Maligni PTC FTC 0 Totale B= benigno; PTC= carcinoma papillare tiroideo; FTC= carcinoma follicolare tiroideo

4 418 Recenti Progressi in Medicina, 104 (7-8), luglio-agosto 2013 no all anno. Di questi interventi, solo una modesta percentuale risulterà essere composta di carcinomi all esame istologico. È quindi evidente il motivo per il quale tanti studi sono stati effettuati per migliorare l efficacia diagnostica del FNC. Le speranze di individuare dei marcatori tumorali sono state riversate soprattutto sulle mutazioni di RAS e sulle ricombinazioni del gene RET. Mutazioni attivanti di RAS sono state trovate nella maggior parte dei tumori umani ed anche nel FTC e più raramente nel PTC. Tuttavia, queste mutazioni sono presenti frequentemente anche negli adenomi tiroidei, rendendole di scarsa utilità come marcatore diagnostico. RET/PTC è una ricombinazione genica scoperta più di 20 anni fa. Nei primi studi, questo oncogene è stato associato strettamente al PTC, ma successivi studi con metodiche più sensibili hanno chiaramente dimostrato che è presente anche in noduli benigni e nella tiroidite linfocitaria cronica. In queste lesioni benigne, RET/PTC non è presente in tutte le cellule ma solo in un numero ristretto di esse. Per tale motivo, alcuni studi nei quali sono state utilizzate metodiche non sufficientemente sensibili, RET/PTC è apparso selettivo per il PTC. Tuttavia, finché non verrà standardizzata una metodica in grado di distinguere noduli benigni con poche cellule contenenti RET/PTC da noduli maligni con molte o tutte le cellule contenenti l oncogene, questo non potrà essere utilizzato per migliorare la diagnosi citologica. L oncogene BRAF V600E è un candidato ideale come marcatore tumorale. I numerosissimi studi condotti hanno dimostrato in modo inequivocabile che questa mutazione è, per quel che riguarda la tiroide, di esclusiva pertinenza del PTC. Nel nostro studio, BRAF V600E non era presente in nessuno dei 222 noduli benigni studiati. Questa assoluta specificità fa sì che un test diagnostico basato sull identificazione di questo marcatore molecolare abbia un valore predittivo positivo pari al 100%. La metodica impiegata per rintracciare la mutazione di BRAF è molto importante. Infatti, la sensibilità del test e la specificità si riducono fortemente quando vengono usate metodiche non sufficientemente sensibili o affidabili. Questo limite è particolarmente vero per il PTC per due ordini di fattori. Come per RET/PTC, anche la mutazione di BRAF può essere sub clonale ed essere presente solo in alcune cellule del tumore 19. Inoltre, l eterogeneità cellulare del tumore è variabile, anche in funzione di patologie concomitanti quali la tiroidite linfocitaria cronica, il linfoma o malattie sclerosanti della tiroide La metodica del pirosequenziamento, in quanto metodica quantitativa, appare come una delle più sensibili ed affidabili per ricercare la mutazione di BRAF in campioni citologici tiroidei Mentre la sua specificità, pari al 100%, lo rende un ottimo marcatore positivo, BRAF V600E ha una sensibilità ridotta. Infatti, non è mai presente nel FTC e la sua prevalenza nel PTC non supera il 60%. Nel nostro studio, la prevalenza di BRAF V600E nei PTC era pari al 60%. Questo consentiva di perfezionare con certezza la diagnosi di PTC in 23 noduli con citologia inconclusiva: 2 inadeguati, 11 indeterminati e 10 sospetti. Inoltre, consentiva il disvelamento di 2 falsi negativi. Il valore predittivo negativo di BRAF V600E nel nostro studio era dell 89,5%, un valore non sufficientemente alto per consentire di evitare la tiroidectomia diagnostica ai pazienti risultati negativi al test, ma certamente utile ad indirizzare 23 pazienti ad una chirurgia curativa e utile a ridurre i falsi negativi. Sulla base dei risultati ottenuti, la ricerca della mutazione di BRAF in campioni di citologici inconclusivi può essere considerata una risorsa utile a selezionare i pazienti da destinare ad intervento chirurgico terapeutico Bibliografia 1. Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, et al. Revised American Thyroid Association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2009; 19: Gervasi R, Orlando G, Lerose MA, et al. Thyroid surgery in geriatric patients: a literature review. BMC Surg 2012; 12 (suppl 1): S Zeppa P, Varone V, Cozzolino I, Salvatore D, Vetrani A, Palombini L. 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