Chlamydiosi. Dr. Ludovico Dipineto Facoltà di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Napoli Federico II

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1 Chlamydiosi Dr. Ludovico Dipineto Facoltà di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Napoli Federico II

2 Clamidiosi Clamidiosi è un termine generico per indicare l infezione sostenuta da Chlamydophila psittaci negli uccelli, nell uomo o altri mammiferi Negli uccelli è un infezione a decorso da acuto a cronico/asintomatico Infezione intestinale inapparente portatori sani, eliminatori intermittenti della clamidia

3 Clamidiosi La Chlamydophila psittaci è agente di zoonosi Psittacosi infezione trasmessa all uomo dagli Psittacidi Ornitosi infezione trasmessa all uomo da uccelli diversi dagli Psittacidi

4 Clamidiosi Malattia negli Uccelli Malattia sistemica, occasionalmente letale Sintomatologia variabile (specie ed età degli uccelli e ceppo di clamidia) letargia, ipertermia, scolo nasale ed oculare, diarrea, calo dell ovodeposizione Mortalità superiore al 30% Molti uccelli, soprattutto Psittacidi, portatori asintomatici ed escretori persistenti (alla necroscopia presentano splenomegalia, epatomegalia, aerosacculite fibrinosa, pericardite, peritonite)

5 Clamidiosi Malattia nell Uomo Infezione conseguente ad inalazione (tacchini, anatre e piccioni) Periodo di incubazione 5-14 giorni Malattia simile a quella causata da Chlamydophila pneumoniae (ceppo TWAR), che può decorrere da una forma inapparente ad una sistemica grave, con polmonite anche mortale Raramente letale (se opportunamente trattata) Sintomatologia emicrania, brividi, malessere generalizzato, mialgia, con o senza coinvolgimento respiratorio Di solito autolimitante senza diffusione secondaria

6 Eziologia Ordine Famiglia Genere Specie Chlamydiales Chlamydiaceae Chlamydophila Chlamydophila psittaci Recente classificazione della famiglia in 2 generi e 9 specie Chlamydia C.trachomatis (uomo), C.suis (suino), C.muridarum (topo, hamster) Chlamydophila C.psittaci (uccelli), C.felis (gatti), C.abortus (bovini, ovini, caprini), C.caviae (cavia), C.pecorum (bovini, ovini), C.pneumoniae (uomo)

7 Classificazione Sierotipi (immunofluorescenza con anticorpi monoclonali) Sierotipo Ceppi più rappresentativi Ospiti primari A VS1 Psittacidi B CP3 Piccioni, tortore C GR9 Anatre, oche D NJ1 Tacchini E MN Piccioni, tacchini F VS225 Psittacidi

8 Eziologia Microrganismi rotondeggianti, con una parete cellulare simile a quella dei Gram- (priva dell acido muramico), immobili e caratterizzati da parassitismo endocellulare obbligato Sono definiti energy parasites poiché dall ospite attingono energia, non avendo enzimi necessari alla sua produzione

9 Eziologia Morfologia Corpo elementare (CE) forma infettante extracellulare che si attacca alle cellule bersaglio dell epitelio colonnare e penetra nella cellula - denso, sferico, piccolo ( 0,2-0,3 m) - immobile, manca di flagelli e pili Corpo iniziale o reticolare (CR) forma scarsamente infettante intracellulare, metabolicamente attiva, che si divide per scissione binaria - più grande del CE ( 0,6-1,5 m)

10 Eziologia Morfologia Cellula L929 infettata con C.psittaci: EB Corpo elementare RB Corpo reticolare IB Corpo intermedio foto Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM) x

11 Eziologia Ciclo di sviluppo 1. Adesione e penetrazione del CE Adesione dei CE ai microvilli di cellule dell epitelio colonnare su siti recettoriali specifici (non ancora identificati, forse proteine) Penetrazione con un meccanismo di endocitosi selettiva per il parassita (indotto dalla cellula recettiva) Formazione di un vacuolo fagosomiale, che evade la fusione con i lisosomi e quindi la digestione enzimatica

12 Eziologia Adesione e penetrazione del CE Cellula BGM (Buffalo Green Monkey) 1 ora dopo l infezione con C.psittaci, attacco del Corpo Elementare ad un microvillo della cellula ospite. Cellula BGM (Buffalo Green Monkey) 1 ora dopo l infezione con C.psittaci formazione del vacuolo, da notare la vicinanza dei mitocondri (M).

13 Eziologia Ciclo di sviluppo 2. Trasformazione del CE metabolicamente inerte in CR metabolicamente attivo (8 h p.i.) Parete cellulare più sottile e flessibile (riduzione dei ponti disolfuro) Dispersione del nucleoide in filamenti di DNA Citoplasma più omogeneo ed aumento del numero di ribosomi

14 Eziologia Ciclo di sviluppo 3. Moltiplicazione del CR per scissione binaria e produzione di CR (10-20 h p.i.) Sintesi di DNA, RNA e proteine (precede la divisione) Divisione del CR per scissione binaria I CR sono incapaci di generare un proprio ATP, per cui sono costretti ad approvvigionarsene dai mitocondri della cellula ospite, attraverso una loro ATP-ADP traslocasi, e poi lo trasformano in ADP grazie ad una propria ATPasi I CR possiedono proiezioni superficiali cilindriche (18), che penetrano nella membrana endosomica permettendo la penetrazione di nutrienti dal citoplasma dell ospite

15 Eziologia Moltiplicazione del CR per scissione binaria e produzione di CR Cellula BGM 18 ore dopo l infezione con C.psittaci, moltiplicazione per scissione binaria del Corpo Reticolare (RB).

16 Eziologia Ciclo di sviluppo Moltiplicazione del CR all interno del vacuolo, circondato e protetto dalla membrana, che aumenta di volume fino ad occupare quasi tutto il citoplasma della cellula ospite (accumulo di glicogeno) Dopo h p.i. i vacuoli contenenti i CR si ingrandiscono talmente da divenire evidenziabili al microscopio ottico e a contrasto di fase Incluso basofilo (Giemsa) (contenente da 100 a 500 cellule figlie)

17 Eziologia Cellula BGM, 52 ore dopo l infezione con C.psittaci, da notare l espansione del vacuolo ed i mitocondri (M) allineati alla parete del vacuolo.

18 Eziologia Ciclo di sviluppo 4. Maturazione dei CR non infettanti in CE infettanti (dopo h p.i.) Addensamento centrale del contenuto citoplasmatico, con riduzione di volume dei CR Ispessimento della parete cellulare

19 Eziologia Ciclo di sviluppo 5. Rilascio di CE dalla cellula ospite (dopo h p.i.) Meccanismo non ancora completamente noto Liberazione degli enzimi contenuti nel lisosoma che porta alla dissoluzione della cellula ospite Lisi delle cellule ospiti circa 70 h p.i.

20 Eziologia Cellula BGM, 50 ore dopo l infezione con C.psittaci, lisi della cellula ospite e liberazione dei Corpi Elementari infettanti.

21 Eziologia Ciclo di sviluppo Il numero di CE che si liberano da una cellula è molto variabile (da 10 a circa 1000) e dipende da vari fattori fra cui il ceppo di clamidia, il tipo di cellula ospite, le condizioni colturali Durante il ciclo di sviluppo nella cellula ospite, un lipopolisaccaride specifico della clamidia viene espresso sulla superficie della cellula infetta, forse per ridurre la fluidità della membrana plasmatica proteggendo così la clamidia dall attacco dei linfociti T citotossici

22 Eziologia Colorazione La clamidia è sufficientemente grande da essere osservata al microscopio ottico o a contrasto di fase (800x) Gram negativa Giemsa porpora scuro Castaneda blu Macchiavello rossa Gimenez rossa

23 Eziologia Struttura antigenica Lipopolisaccaride (LPS) principale antigene superficiale di gruppo o genere-specifico (non si sa se gli anticorpi contro questo antigene sono protettivi). Possiede tre epitopi antigenici: - epitopo genere-specifico, espresso sui CE e CR - altri due epitopi espressi anche in altri batteri Gram- (cross-reazioni) Proteina di membrana (MOMP) esterna sierotipo-specifica (induce la formazione di anticorpi neutralizzanti) Proteina responsabile dell ipersensibilità ritardata a seguito di infezioni ripetute

24 Patogenicità Ceppi ad elevata patogenicità Epidemie acute e mortalità 5-30% Tacchino - Uccelli selvatici Alcuni ceppi ad elevata patogenicità del sierotipo D vengono detti tossigeni poiché inducono una malattia rapidamente letale e determinano lesioni congestizio-infiammatorie a carico di organi vitali

25 Patogenicità Ceppi a bassa patogenicità Epidemie lente e mortalità inferiore al 5% (quando non complicate da infezioni secondarie batteriche o parassitarie) Anatre, piccioni - raramente tacchini, passeri ed altri uccelli selvatici

26 Patogenesi Danni vascolari essudazione siero-fibrinosa e versamenti toraco-addominali, deposizione di fibrina sul pericardio, sui polmoni e su altri organi Flogosi anche purulente, unite ad emorragie e necrosi Reazioni proliferative in alcuni organi (fegato e milza) epato- e splenomegalia

27 Resistenza agli agenti fisico-chimici Molto sensibile a sostanze in grado di alterare il contenuto in lipidi o l integrità della loro parete cellulare (ad es. derivati dell ammonio quaternario e solventi lipidici) e ai comuni disinfettanti (benzalconio cloruro, soluzioni iodo-alcoliche, etanolo al 70%, acqua ossigenata al 3%, nitrato d argento) Meno sensibile alle soluzioni denaturanti le proteine, acidi ed alcali (metanolo, etanolo, solfato di ammonio o di zinco, fenolo, acido idrocloridrico, idrossido di sodio) Resistente al cresolo ed alla calce Le Clamidie eliminate con le feci come corpi elementari sono resistenti nell ambiente: 6 mesi nella lettiera e nelle penne essiccate dopo l eliminazione dai tacchini infetti

28 Incidenza e Distribuzione Distribuzione mondiale (variabile in base al ceppo di clamidia e alla specie aviare) Psittacidi e Piccioni Andamento endemico (frequente lo stato di portatore cronico) Tacchini e Anatidi Andamento epidemico (nelle anatre il sierotipo C è endemico)

29 Spettro d ospite Oltre agli uccelli domestici, 160 specie di uccelli selvatici possono essere ospiti transitori o permanenti di clamidia I giovani sono più sensibili degli adulti - Gli adulti possono non manifestare la malattia fino a quando non si verifica una condizione stressante (ad es. trasporto)

30 Spettro d ospite Le specie aviari più colpite dall infezione sono: Psittacidi (in natura ed in cattività) Piccione e tortora (sia domestici sia selvatici) Palmipedi (anatre ed oche sia domestiche sia selvatiche) Tacchino

31 Trasmissione Via orizzontale Contatto diretto Contatto indiretto Da animale malato ad animale sano Inalazione Ingestione Aerosol originato dalle feci essiccate e dalle secrezioni nasali

32 Trasmissione e Diffusione Possono diffondere l infezione anche acari e pidocchi (no moltiplicazione, solo contaminazione esterna) Diffusione veloce all interno di un gruppo (alla comparsa della malattia più del 90% degli animali ha sieroconvertito) La trasmissione verticale è accertata solo in qualche specie (anatra, parrocchetto, tacchino, pollo, gabbiano, oca delle nevi no piccione), ma sembra che non abbia importanza nel perpetuare la malattia

33 Periodo d incubazione Infezione sperimentale 3 gg. Infezione naturale 106 gg.

34 Sintomatologia Forma iperacuta: soprattutto nei giovani, decorso brevissimo, morte anche senza sintomi, oppure possibili sintomi a carico di più apparati: respiratorio, enterico (diarrea verdastra) e nervoso Forma acuta: rapida insorgenza di sintomi, quali sinusite, congiuntivite, difficoltà respiratorie con marcata depressione e anoressia, decorso breve, alta morbilità (80%) e mortalità (30%)

35 Sintomatologia Forma subacuta/subclinica: blanda sintomatologia e ritardi di crescita, mortalità ridotta ma perdurante nel gruppo Forma latente cronica: la Clamidia diffonde moderatamente sugli epiteli, soprattutto enterici, da cui viene eliminata intermittentemente con le feci e nelle cellule del sistema reticolo-istiocitario (splenomegalia) stress ed infezioni concomitanti, precarie condizioni igieniche, carenze alimentari, etc. possono risvegliare l infezione con la comparsa di sintomatologia

36 Lesioni anatomo-patologiche A seconda della forma clinica si possono trovare lesioni più o meno imponenti ed estese a vari apparati Congestione, emorragie petecchiali e formazione di depositi superficiali di essudato fibrinoso Congiuntivite, pericardite e periepatite fibrinosa, aerosacculite fibrinosa, congestione polmonare e polmonite, epato- splenomegalia

37 Malattia nei Tacchini È il più recettivo fra i volatili domestici ed anche quello da cui si isolano più frequentemente ceppi ad elevata virulenza La malattia si manifesta nei gruppi di soggetti tra 8 e 30 settimane d età e nei riproduttori La diffusione può anche essere lenta

38 Malattia nei Tacchini Periodo di incubazione Dipende dalla quantità e dalla virulenza del ceppo Ceppi ad elevata virulenza Sperimentalmente 5-10 giorni Ceppi a bassa virulenza Meno definito (~ 2-8 settimane) Decorso 2-4 settimane

39 Malattia nei Tacchini Morbilità Ceppi ad elevata virulenza 50-80% Ceppi a bassa virulenza 5-20% Mortalità Ceppi ad elevata virulenza 10-30% Ceppi a bassa virulenza 1-4%

40 Malattia nei Tacchini Sintomatologia Ceppi ad elevata virulenza Cachessia, anoressia, ipertermia, feci gialloverdastre e gelatinose, sintomi respiratori (tosse, rantoli, starnuti, dispnea), repentino calo dell ovodeposizione, transitorio (fino al 10-20%) Ceppi a bassa virulenza Anoressia, feci verdastre, calo dell ovodeposizione meno evidente

41 Malattia nei Tacchini Lesioni anatomo-patologiche Ceppi ad elevata virulenza Polmoni congestione diffusa ed essudato fibrinoso nella cavità pleurica Pericardio congestione ed ispessimento, con presenza di essudato fibrinoso Cuore aumento di volume e superficie ricoperta di placche di fibrina o essudato giallastro Fegato aumento di volume, con periepatite fibrinosa Sacchi aerei ispessimento, opacizzazione, con presenza di essudato fibrinoso

42 Malattia nei Tacchini Lesioni anatomo-patologiche Milza aumento di volume, di colorito scuro e friabile, con focolai grigio-biancastri di proliferazione cellulare Sierosa peritoneale e mesentere congestione vascolare ed essudato fibrinoso biancastro L essudato contiene un gran numero di cellule mononucleate, nelle quali sono presenti i corpi reticolari Ceppi a bassa virulenza Lesioni simili, ma meno gravi ed estese

43 Malattia nei Polli Sono molto resistenti alla malattia (più sensibili i giovani) Possono essere colpite galline ovaiole e pollastre Spesso l infezione è transitoria ed inapparente Sintomatologia dispnea, congiuntivite e aumento di mortalità Lesioni anatomo-patologiche epatomegalia, congiuntivite, pericardite, periepatite ed aerosacculite fibrinose

44 Malattia nel Fagiano Sono segnalati pochi focolai di malattia ed isolamenti di clamidie poco virulente Sono state rilevate sieropositività in fagiani selvatici Probabilmente il fagiano ha occasionali contatti con clamidie escrete da altri ospiti, ma non si osservano quadri acuti di clamidiosi

45 Malattia nella Faraona Nella faraona la clamidiosi è stata messa in relazione con: Malattia fulminante della faraona (MFF) grave patologia iperacuta che si manifesta nei giovani con modica enterite, grave prostrazione, anoressia, adipsia, e mortalità quasi del 100% in una settimana si manifesterebbe in anni molto freddi Sindrome respiratoria e digestiva cronica comparsa di una crescita stentata e disomogenea nei gruppi che colpisce soggetti più vecchi di quelli colpiti dalla MFF e non ha contagiosità e virulenza così elevate i sintomi sono leggera tosse e diarrea le lesioni sono splenomegalia e sierosite

46 Malattia nelle Anatre e nelle Oche Malattia molto grave, debilitante, spesso letale nei giovani Tremori, barcollamento e cachessia, anoressia, contenuto intestinale verdastro acquoso, scolo oculare e nasale sieroso o purulento Emaciazione e morte in preda a convulsioni Morbilità dal 10 all 80% Mortalità da 0 a 30%

47 Malattia nei Piccioni Infezione endemica, che si perpetua di generazione in generazione Il piccione è un importante serbatoio di clamidie Sintomatologia Anoressia e poi emaciazione, diarrea, congiuntivite, palpebre gonfie e rinite, difficoltà respiratoria e rantoli Infezione asintomatica o solo una live diarrea transitoria

48 Malattia nei Piccioni Lesioni anatomo-patologiche Essudato fibrinoso sui sacchi aerei, peritoneo e pericardio Fegato aumentato di volume, decolorato e friabile Milza iperplastica, molliccia e di colore più scuro Enterite catarrale

49 Immunità Scarsa e di breve durata Sono importanti sia l immunità umorale che cellulomediata nel determinare resistenza alla reinfezione

50 Diagnosi Dimostrazione diretta della Chlamydia Colorazione istochimica di essudati, campioni fecali e vetrini per impronta con il metodo Giemsa o Gimenez Colorazione immunoistochimica di strisci e preparazioni istologiche Colorazione con l Immunofluorescenza o l Immunoperossidasi ELISA si utilizzano kit sviluppati per uso umano che rilevano l antigene LPS genere-specifico e reagiscono con la Chlamydophila psittaci PCR

51 Diagnosi Campioni Sacchi aerei, milza, pericardio, cuore, polmoni, fegato, reni, intestino (colon) Tamponi coanali, orofaringei e oculari Tamponi cloacali e feci (raccolta per 3 giorni consecutivi) Altri campioni Sangue, raschiato congiuntivale, liquidi peritoneali, essudati

52 Diagnosi Isolamento ed Identificazione Colture cellulari Le linee cellulari più utilizzate sono McCoy, HeLa, Vero, BHK 21, BGM, cellule L di topo, L929 Dopo 2-3 oppure 5-6 gg. di incubazione Si osservano le tipiche inclusioni con l Immunofluorescenza diretta o indiretta, colorazioni immunoistochimiche, colorazioni istochimiche (colorazione di Gimenez, Giemsa, Macchiavello)

53 Diagnosi Isolamento ed Identificazione Uova embrionate Inoculazione nel sacco vitellino di uova embrionate di pollo incubate per 6-7 giorni a 39 C Si osserva morte dell embrione dopo 3-10 giorni p.i. e congestione vascolare del sacco vitellino Si eseguono vetrini ad impronta o si raccoglie il contenuto del sacco vitellino e si inocula in colture cellulari La presenza di clamidia si dimostra con l uso di colorazioni appropriate, Fissazione del complemento, Immunofluorescenza diretta o indiretta, ELISA diretto o indiretto

54 Diagnosi Sierologia Fissazione del Complemento E il test più utilizzato per rilevare anticorpi nel siero di animali infetti Titoli 64 sono indicativi di infezione in atto o recente Se i titoli sono bassi, si esegue il test dopo gg. Agglutinazione su latex Rileva IgG Agglutinazione dei corpi elementari Rileva IgM

55 Diagnosi Sierologia Immunofluorescenza Microimmunofluorescenza Agglutinazione rapida e lenta Agglutinazione capillare Emoagglutinazione passiva Immunodiffusione ELISA

56 Trattamento Sensibilità agli antibiotici Sensibilità tetracicline, cloramfenicolo, eritromicina, tilosina, tilmicosina e penicillina (meno) Resistenza streptomicina, vancomicina, kanamicina, bacitracina, gentamicina, neomicina Clortetraciclina (per almeno 2 settimane) nel tacchino Doxiciclina nei pappagalli: 50mg/Kg PO o IM fino a 100mg/Kg IM; 200mg/litro di acqua se somministrata in acqua da bere.

57 Prevenzione e Controllo Profilassi diretta Isolamento dei soggetti/allevamento da possibili portatori o eliminatori (uccelli selvatici, uomo, attrezzature, ecc.)