Metodi Fisici in Chimica Organica. a.a

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1 Università degli Studi di Siena Facoltà di Farmacia Metodi Fisici in Chimica Organica a.a Prof. Maurizio Taddei

2 Programma. 57 ore Introduzione generale alla determinazione strutturale di una molecola organica. Criteri di purezza e cenni sulle tecniche di purificazione. Accenni sullo spettro elettromagnetico e sui principî dell assorbimento UV. Principî base. Transizioni permesse e proibite. Applicazione dell UV nella determinazione strutturale. Legge di Lambert-Beer e applicazioni IR. Teoria dell IR. Strumentazione e preparazione del campione. Interpretazione degli spettri IR. Assorbimenti caratteristici dei vari gruppi funzionali della chimica organica. Spettrometria di Massa. Principî e strumentazione. Tecniche di ionizzazione: ionizzazione elettronica, ionizzazione chimica, FAB, electron spray, MALDI. Analizzatori. Campo magnetico, double focusing, filtro quadrupolare, time of flight, FT-ICR. Lo spettro di massa. Determinazione della formula molecolare. Calcolo delle insaturazioni Spettroscopia NMR. 1 H NMR. Principio NMR. Cenni sui modelli fisici e quanto meccanici. Modello del protone ruotante e del vettore magnetizzazione. Rilassamento. Spettroscopia in onda continua e in trasformata di Fourier. Strumentazione. Chemical shift. Fattori che influenzano il chemical shift al protone. Chemical shift dei vari gruppo funzionali in chimica organica. Integrale. Accoppiamento spin spin. Sistemi del primo ordine e di ordine superiore. Formalismo di Pople. Equivalenza chimica e magnetica. Protoni enantiotopici e diastereotopici. Sistemi a conformazione mobile. Accoppiamento virtuale. Costanti di accoppiamento 2 J, 3 J e long range. Sistemi di semplificazione dello spettro. Effetto NOE. 13 C NMR. Fattori che influenzano il chemical shift al 13 C. Chemical shift dei vari gruppi funzionali in chimica organica. Spettri off resonance, DEPT e APT. Correlation spectroscopy. COSY principio e applicazione. Lettura di uno spettro bidimensionale. Altri esempi di semplici esperimenti bidimensionali. Esercizi. Lo studente alla fine del corso deve essere in grado di risolvere una struttura organica attraverso l analisi degli spettri IR, massa, 1 H e 13 C NMR. Per questo durante tutto il corso verranno svolti esercizi di interpretazione di spettri. Risorse. Testo: R. M. Silverstein, F.X. Webster Identificazione spettroscopica dei composti organici, Casa Editrice Ambrosiana. Portale di spettroscopia nel quale si possono trovare links contenenti tutti gli argomenti trattati nel corso: Serie di esercizi senza soluzione per prepararsi all esame:

3 Identificazione e Caratterizzazione di una Molecola Organica Criteri di Purezza Punto di Fusione Punto di Ebollizione Unicità Cromatografica Analisi Elementare (C, H, N, X) Storia Chimica del Prodotto Saggi Chimici Spettroscopia Ultravioletta (uv) Spettrometria di Massa (MS) Spettroscopia Infrarossa (ir) Spettroscopia di Risonanza Magnetica (NMR)

4 Spettroscopia (di assorbimento) Una qualsiasi sostanza, irradiata da una sorgente che emette una radiazione di una certa frequenza (n) assorbe parte dell energia associata a questa frequenza (E = hν oppure E = hc/λ). Il modo di assorbimento dipende dal tipo di radiazione e dalla struttura molecolare. Pertanto un osservatore che registra tale assorbimento potrà avere informazioni sulla struttura della molecola in esame. Lo spettro elettromagnetico Ionizzazione Transizioni di elettroni di valenza Vibrazioni molecolari Transizioni rotazionali Transizioni di spin nucleare kcal/mol Raggi γ Raggi x Far uv uv visibile ir Far infrared microonde Onde radio m

5 L esempio più semplice di spettroscopia La luce bianca è composta da varie componenti con diverse lunghezze d onda La luce bianca può essere: Riflessa Assorbita Trasmessa

6 UV - Visibile uv 100nm 400nm nm 800 nm Transizione elettronica = passaggio di elettroni da un livello energetico fondamentale ad un livello eccitato E = Ee + Ev + Er Con Ee = energia elettronica Ev energia vibazionale Er energia rotazionale -log I/ I0 = εcd A = εcd A = ε 1 c 1 d + ε 2 c 2 d +... ε n c n d c = moli/lit d= cammino ottico ε = coeff. estinzione molare

7 Assorbanza, A = - log Io/I Trasmittanza T = Io/I Se non c è niente che assorbe, A = 0 e T = 1. In uno spettrometro commerciale di solito si ha una scala che va da A =O (100% di T, T = 1) a 2 (1% di trasmittanza, T= 0.01).

8 UV - Visibile Cromofori: gruppi capaci di assorbire in uv. La presenza di doppi legami e sistemi π delocalizzati comportano uno spostamento verso valori di λ maggiore (verso il visibile o verso il rosso, effetto batocromico). C-C, C-H, C-O-C C-N C=C C=O, C=N R R = H R = Cl R = CN R = NH nm 190 nm 300 nm 203 nm 209 nm 224 nm 230 nm

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10 Spettroscopia IR Near IR IR org. Far IR cm cm cm cm -1 Ascissa = trasmittanza (O-100%) Ordinata= numero d onda : n (cm-1) = 10 4/l L assorbimento in IR è legato ad una transizione di vibrazione molecolare : Vibrazione di legame, stretching -stiramento Vibrazioni di gruppo, bending -deformazione. A B Legge di Hooke (oscillatore armonico) ν A-B = 1/2πc ( f/m,) 1/2 f = cost. di forza M = M A M B /(M A +M B )

11 Sretching Simmetrico 3625 cm -1 Sretching Assimmetrico 3756 cm -1 Bending 1596 cm -1 Sono visibili in IR solo le vibrazioni che comportano una variazione di momento di dipolo cm-1: X-H stretching (X = C, N, O, S) cm-1: C-X stretching (X = C or N) cm-1: C=X stretching (X = C, N, O) cm-1: C-X stretching (X = C, N, O) cm-1: bending

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13 Registrazione spettro IR Onda Continua; Scansione di frequenze (doppio raggio) Light source IR

14 Registrazione spettro IR FT-IR Specchio mobile Specchio fisso Campione Spettro Analizzatore e convertitore Interferometro Sorgente IR

15 Dalla sorgente IR parte un raggio (monocromatico) che viene suddiviso in due raggi identici. Questi vengono inviati a due specchi. Uno specchio fisso rimanda il raggio al punto di partenza. L altro specchio si muove avanti e indietro (rispetto al suo asse) di pochi millimetri. I due raggi vengono ricombinati e mandati al campione. Poiché le due distanze che i raggi compiono sono una fissa e l altra variabile continuamente, il segnale ricombinato che esce fuori è un interferogramma, cioè un raggio in cui ogni dato (modulato in funzione della variazione di posizione dello specchio mobile) contiene le informazioni relative a tutte le frequenze (nel dominio dei tempi relativi alla sfasatura del secondo raggio). In altre parole si forma un treno di fotoni (IR) ognuno con un tempo di emissione diverso, riconducibile a un treno di frequenze diverse. Durante il passaggio nel campione la molecola assorbe alcune delle componenti (i fotoni che determinano le transizioni di stretching e bending). Al termine l interferogramma che ne risulta viene rielaborato con una trasformata di Fourier per passare al dominio delle frequenze ed ottenere uno spettro leggibile.

16 Vantaggi della Spettroscopia FT-IR. Rapidità nella registrazione: meno di un secondo per una singola acquisizione -interfacciabilità con una tecnica cromatografica. Sensibilità: La sensibilità intrinseca è maggiore. Inoltre possono essere registrati più interferogrammi consecutivi e quindi effettuare una trasformazione della IF accumulata. Possibilità di registrare uno spettro in riflettanza (su campioni non trasparenti). Semplicità meccanica (trasportabilità). Calibrazione interna via laser (possibilità di lavorare in un campo spettrale ampio).

17 Modi di registrazione dello spettro in trasmittanza - campione trasparente (assenza di diffrazione) Gas-fase Soluzione diluita in un solvente non IR attivo (doppia cella con il solvente). Liquido puro (tra due finestre di KBr). Nessun riferimento Solido macinato e disperso in Nujol (paraffina) - Si vedono i segnali della paraffina (C-H e C-C). Solido macinato e disperso in KBr. Questa dispersione solida viene pressata e trasformata in una pastiglia trasparente.

18 Il numero e la natura dei sostituenti possono modificare la frequenza di stretching e bending. Stretching Bending -CH ; ; CH CH Hal-CH

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21 Str. C=C Str. C-H out of plane

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23 overtones out of plane Str. C-H Str. C=C

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25 overtones

26 overtones

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28 str. C C Str. C H

29 str. C C Str. C H

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31 Il segnale dello str. O-H dipende dalle condizioni di registrazione e dal livello di legame a idrogeno con cui è impegnato

32 Str. OH

33 OH libero OH associato

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38 Str. NH 2 Def. NH 2

39 Str. NH 2 libero e associato Def. NH 2

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43 Il gruppo carbonilico str. C=O generalmente il segnale più intenso dello spettro Aldeidi semplici Chetoni semplici Aldeidi coniugate Chetoni coniugati Chetoni strained O O O O O La coniugazione diminuisce il carattere di C=O

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50 Acidi carbossilici e derivati -R-COOH OH (associazione H-bond) C=O (banda larga) -R-COOR C=O (banda stretta) -R-CONR 2 NH (una o due bande) C=O (banda larga e a volte sdoppiata) -R-COOCO-R C=O (bande sdoppiate) -RCOCl C=O (bande sdoppiate) La coniugazione abbassa di circa cm -1 la frequenza di assorbimento Lo strain di un ciclo innalza di circa cm -1 la frequenza di assorbimento

51 OH associato 1706

52 OH associato 1708

53 OH associato 1689

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56 OH associato

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58 Due bande NH 1642

59 Una banda NH 1646

60 Una banda NH?

61 NH

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63 Nitro derivati (aromatici) due bande intense intorno a 1550 e 1350 Nitrili Azidi Isocianati Alleni

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65 2230

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67 2262

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69 Problemi di spettroscopia IR (ed NMR) (con soluzione) (senza soluzione) Libreria di spettri :

70 Spettrometro di massa M M +, (M-X) +

71 Gli spettrometri di massa possono essere classificati sulla base del metodo impiegato per separare gli ioni carichi e/o sulla base della tecnica di ionizzazione. Ionizzazione Impatto elettronico EI Ionizzazione chimica CI Fast Atom Bombardment FAB Electrospray Ionization ES Matrix Assisted Laser Desorbtion Ionization MALDI Tecnica di separazione Campo Magnetico Double Focusing (High Resolution) Quadrupolo Mass Filter Ion trap Time of Flight FT-ICR (Ion Cyclotron Resonance) MS/MS (Tandem Ms )

72 Impatto elettronico (EI) E il metodo classico in spettreometria di massa.. Nella sorgente ionica ( mbar, 200 C C), un campione gassificato è bombardato con un fascio di elettroni a 70 ev generati da un filamento di tungsteno. In tal modo si toglie un elettrone alla specie e si genera uno ione molecolaere [M + ]. Poiché la pressione è bassa non dovrebbero avvenire reazioni intermolecolari. Lo ione formatosi si frammenta ulteriormente generando una serie di ioni che costituisce lo spettro. Poché l energia della fonte elettronica è tenuta costante, il numero e la quantità dei frammenti è costante per ogni tipo di apparecchio e dipende solo dal tipo di sostanza. Pertato con EI sono disponibili le librerie di spettri. Limite per molecole che gassificano, che sono termicamente stabili e che hanno masse > 800.

73 Ionizzazione Chimica (CI). La molecola (in fase gassosa) è ionizzata per trasferimento protonico (o di uno ione idruro) da parte della specie C 2 H 5 + MH + C 2 H 5 + MH C 2 H 4 MH + C 2 H 5 + M + + C 2 H 6 La specie C 2 H 5 + è formata introducento un largo eccesso di metano in un camera di impatto elettronico con produzione di CH 4 + e CH 3 + che poi reagiscono ancora col metano per formare CH 5 + and C 2 H 5+ : CH CH 4 --> CH CH 3 CH CH 4 --> C 2 H H 2 Problema: Si vede bene lo ione molecolare ma non si hanno frammentazioni

74 Fast-atom bombardment (FAB) In FAB un fascio di atomi ad alta energia, tipo Xe o Ar, urtano un campione solido causando un desorbimento dei componenti il campione e la loro ionizzazione. La specie da analizzare è posta in una matrice viscosa (glicerina) e depositata su una piastra metallica. Lo spettro FAB contiene spesso molto pochi frammenti e anche ioni pseudio molecolare tipo [M+H] +, [M+Na] +, La tecnica FAB é la più utilizzata per la determinazione di pesi molecolari esatti (double focusing). Si vedono i segnali della matrice.

75 Electrospray ionization (ESI) La sorgente ESI consiste in un ago finissimo che immette in forma di spray una soluzione del campione da analizzare. Le goccioline sono caricate positivamente quando escono dal capillare e allorché il solvente evapora l analita si ritrova il fase gassosa carico positivamente; Esso viene accelerato e mandato all analizzatore. Purtroppo con questo metodo si hanno specie con cariche multiple, per cui si ottengono una serie di picchi dovuti ai vari m/e. Una rielaborazione permette di risalire al valore della massa della specie in esame. Non c è frammentazione. Permette l analisi anche di macromolecole come proteine, peptidi e oligonucleotidi. E interfacciabile ad un HPLC.

76 Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) MALDI è una tecnica sviluppata per ionizzare grosse molecole biologiche come proteine e acidi nucleici. Tali molecole sono disperse in una matrice organica uv attiva (es acido nicotinico). Un raggio UV laser pulsato asporta la matrice dalla superficie su cui è deposta trasportando con se anche alcune molecole del campione in forma ionizzata così che esse possono essere estratte nello spettrometro. Col MALDI si possono analizzare molecole fino a 500 kda, con limite minimo di 3-5 kda. Poiché il laser è pulsato (dominio del tempo) è possibile utilizzare questa tecnica in sieme all analizzatore time of fly ed addirittura con un Fouriertransform mass spectrometer che è molto dispendioso ma molto efficace.

77 Quadrupolo Un analizzatore di massa quadrupolare è un filtro di masse. Combinando in un quadrupolo un idonea corrente di un certo voltaggio (dc) con una idonea radiofrequenza(rf) è possibile permettere il passaggio solo di un frammento di una certa m/e. Tutti gli altri ioni oscillano nel campo quadrupolare e si scaricano sui poli. Variando adeguatamente dc e rf è possibile analizzare uno spettro completo.

78 Time of fly Un apparecchio time of flight misura il tempo massa dipendente che è necessario a ioni di diversa massa a spostarsi dalla sorgente ionica al detector. Ciò richiede che il tempo di partenza sia ben definito. Pertanto gli ioni devono essere formati da una tecnica pulsata (generalmente il MALDI) ed una serie di campi elettrici variabili sono usati per rilasciare gli ioni dalla sorgente in un tempo molto breve.

79 L uscita di uno spettrometro di massa mostra un diagramma intensità relativa / rapporto massa /carica (m/e). Il picco più intenso dello spettro è detto picco base e corrisponde al frammento più stabile. Tutti gli altri picchi sono rapportati ad esso in termini di intensità percentuale. Il processo di frammentazione segue dei percorsi semplici e facilmente prevedibili in quanto gli ioni che si formano sono in genere i più stabili cationi e radicali-cationi possibili. Il picco a più alto peso molecolare dovrebbe rappresentare il peso molecolare della specie ed è detto picco molecolare (M + ).

80 Regola dell Azoto: Una molecola neutra con massa pari conterrà un numero pari (zero incluso) di atomi di azoto. Una molecola neutra con massa dispari conterà un numero dispari di atomi di azoto. Masse isotopiche. La presenza di elementi che presentano percentuali consistenti di isotopi può essere evidenziata dall osservazione di picchi tipo M + 1, M+2 in rapporti costanti che rispecchiano la distribuzione isotopica. 32 S, 33 S, 34 S 35 Cl, 37 Cl 79 Br, 81 Br

81 Double Focusing-Riconoscimento della Formula Molecolare. L introduzione di un campo elettrostatico dopo il campo magnetico permette di registrare uno spettro in alta risoluzione (massa con 4 cifre decimali certe). Ogni picco ha una massa determinata dalla somma dei pesi molecolari dei suoi componenti. Pertanto specie contenenti elementi isotopici ( 13 C, 17 O, 18 O, 15 N, ecc) avranno masse diverse ed intensità percentuali all abbondanza isotopica degli elementi costituenti il frammento. Calcolando la massa con 4 decimali (massa esatta) è possibile discernere la composizione elementare ella specie. Ad esempio l unità di massa 28 corrisponde a CO, N 2, CH 2 N, C 2 H 4. Considerando la massa esatta degli elementi avremo CO = N 2 = CH 2 N = , C 2 H 4 = Per tutti i vari frammenti sono tabulati i pesi molecolari esatti.

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87 Alkyl amines

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96 Indice di Insaturazione: si ricava dalla formula elementare ed indica il numero di doppi legami (e di cicli) presenti nella molecola. I (Hd) = C - (H/2) - (Cl,Br,I/2) + N/2 + 1 C 7 H 7 NO I (Hd) =7 - (7/2) - (0/2) + 1/2 + 1 = 5 O O NH 2 N O N C 9 H 9 NO C 14 H 15 NO

97 C8H10O

98 C5H10O2

99 C7H7NO

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101 Spettroscopia NMR (Nuclear Magnetic Resonance) La spettroscopia NMR è dovuta al fatto che ogni nucleo ha una carica. In alcuni nuclei questa carica ruota (spin) attorno all asse nucleare e questa rotazione genera un dipolo magnetico lungo tale asse. La meccanica quantistica ci dice che lo spin nucleare è definito dal numero quantico I. Nuclei diversi hanno valori di I diversi, ma unicamente nuclei con numero quantico di spin I 0 sono sensibili all azione di un campo magnetico. Nuclei con massa atomica e numero atomico pari hanno I = 0 ( 12 C, 16 O) e quindi sono insensibili. Nuclei con massa atomica pari e numero atomico dispari hanno I = intero (1,2 ecc) ( 14 N, 2 H, 10 B). Nuclei con massa dispari hanno I = 1/2 ( 1 H, 13 C, 15 N, 31 P) Lo stato di spin di un nucleo è quantizzato secondo la relazione : m = I, (I - 1), (I - 2),, dove m è definito numero quantico magnetico.

102 Nel caso di 1 H, 13 C, 15 N, 31 P che sono i nuclei più importanti in chimica organica il numero quantico magnetico può assumere due soli livelli caratterizzati da m = 1/2, -1/2 Se abbiamo un nucleo sensibile in condizioni normali i due livelli sono ugualmente popolati cioè le energie dei due livelli sono uguali. B o In presenza di un campo magnetico esterno i nuclei degli atomi di idrogeno si possono orientare in maniera parallela o in maniera antiparallela rispetto al campo magnetico esterno (Bo). Di conseguenza vi saranno due tipi di nuclei ad energia diversa.

103 µ = γ h / 4π B o Il Momento magnetico (µ), µ = γ I h / 2π è una grandezza vettoriale che definisce la forza del magnete nucleare cioè definisce la natura magnetica del nucleo h è la costante di Plank γ è il rapporto giromagnetico e dipende dalla natura di ogni nucleo

104 Con l applicazione del campo magnetico esterno B o abbiamo creato una differenziazione tra i nuclei, alcuni dei quali sono allineati con il campo, mentre altri sono antiparalleli. Dal punto di vista della meccanica quantistica abbiamo generato due livelli con energia diversa : β B o = 0 B o > 0 α ΔE = h ν Ogni livello presenta una diversa popolazione di nuceli (N), e la differenza di popolazione è data dall equazione di distribuzione di Boltzmman N α / N β = e ΔE / kt La differenza di popolazione per un campo magnetico B o = 9.5 T (tesla è 3.8 x 10-5 Kcal / mol N a / N b = La differenza è piccolissima e conseguentemente lo è anche l energia in gioco.

105 Poiché c è una differenza tra i due livelli, questo significa che, se il sistema è sottoposto ad una radiazione elettromagnetica di E adeguata ΔE = h ν, potrà avvenire una transizione di popolazione con conseguente assorbimento della radiazione L energia è molto bassa e quindi è necessario avere una radiazione con ν molto bassa (λ lunga) e quindi una radiofrequenza. La transizione determina un assorbimento di energia dalla radiazione che quindi può essere registrato. Ricapitolando: Se abbiamo un nucleo sensibile ( 1 H) e lo mettiamo in un campo magnetico si generano due livelli di spin nucleare a diversa energia e diversamente popolati. Se si irradia tale nucleo con una radiofrequenza di frequenza giusta, si induce una transizione con conseguente assorbimento della radiazione.

106 Da cosa dipende la differenza di energia tra i due livelli di spin nucleare? L energia in gioco è proporzionale al campo magnetico nucleare e al campo magnetico applicato: E = - µ. B o E (up) = γ h B o / 4π --- E (down) = - γ h B o / 4π ΔE = γ h B o / 2π Pertanto l energia che ogni singolo nucleo può assorbire (cioè l intensità del segnale e la sensibilità) del segnale dipende da B o : Quindi campi magnetici applicati maggiori danno spettri NMR con maggiore sensibilità (energie in gioco più grandi). Anche γ può influenzare la sensibilità dello spettro. 1 H è circa ~ 64 volte più sensitivo di 13 C proprio a causa di γ

107 Intensità del campo magnetico: B o si dovrebbe esprimere in tesla, ma si preferisce esprimere tale valore in MHz. Dire che un magnete ha una potenza di 200 MHz significa che il campo è tale che per indurre la transizione di un protone isolato è necessaria una radiofrequenza di 200 MHz. Chiaramente un campo di 400 MHz è più potente proprio sulla base dell equazione vista precedentemente. Magneti da 60, 100, 150 MHz sono magneti permanenti o elettromagneti Magneti da Mhz sono criomagneti dove il campo magnetico è generato da un superconduttore tenuto alla temperatura dell He liquido

108 Una volta definito il principio dell NMR doppiamo capire come applicare praticamente la radiofrequenza e misurare l energia assorbita. Per fare questo dobbiamo far ricorso ad un modello di maccanica classica. Un nucleo con I 0 immerso in un campo magnetico B o ruota con un moto di precessione allineandosi lungo l asse del campo magnetico (che per definizione è l asse z). La frequenza di questo movimento (frequenza di Larmor ) è ω : ω = 2πν ω o = γ B o (radianti) ω o µ B o

109 Il nucleo associato con il momento magnetico µ ruota come un fuso attorno a B o con una certa frequenza di Larmor. Quello che noi possiamo vedere è l effetto finale di una magnetizzazione macroscopica, M o, chè è proporzionale alla differenza di popolazione (N α - N β ),e nella quale sono mediati tutti i contributi dei vari µ presenti nel campione. z z x M o x y B o y B o In condizioni di stasi (no rf) il vettore magnetizzazione M o è diretto lungo l asse delle z. Al momendo in cui si manda la radiofrequenza si sposta il vettore M o verso il piano xy e si misurano le componenti della magnetizzazione in tale piano.

110 Per fare questo si applica una radiofrequenza ν 1 tale che la sua componente magnetica sia perpendicolare a B o e ruoti in maniera concorde con la precessione del nucleo. Per far questo si fa passare una correne alternata attraverso una spirale trasmittente posizionata lungo l asse y. z B 1 = C * cos (ω o t) M o x B 1 y i Transmitter coil (y) B o B 1 è un campo magnetico oscillante che può essere risolto in due componenti che ruotano in due direzioni opposte.

111 Una di queste componenti ruota nella stessa nella stessa direzione della precessione del nucleo in esame. y y y -ω o +ω o = + x x x Quando la frequenza di questa componente è ω o, noi otteniamo una situazione di risonanza. Pertanto il campo magnetico alternante M 1 ed il vettore magnetizzazione M o interagiscono, con il risultato che M o viene deflesso ed il sistema assorbe energia.

112 z z M o x B 1 off x B 1 y (or off-resonance) y M xy ω o ω o Poichè il sistema assorbe energia, l equilibrio esistente è alterato. Questo si riflette in una modifica della distribuzione di popolazione N α e N β. Nota bene che questo assorbimento avviene solo se è rispettata la condizione di risonanza, cioè la componente di B 1 è uguale ad ω o (1 quanto).

113 Fino a che B 1 è attiva M o se ne sta sull asse M xy. Appena viene a mancare B 1, M xy tenderà a ritornare in condizioni di M o (equilibrio) ricreando la distribuzione iniziale N α / N β (Rilassamento). M xy ritorna sull asse z precedendo sul piano <xy> Le oscillazioni di M xy generano un campo magnetico fluttuante che genera a sua volta una corrente in una spirale posta sulla componente x. z x y M xy ω o Receiver coil (x) NMR signal

114 Ricapitoliamo: Immergendo un elemento con I 0 in un campo magnetico B o si genera un vettore magnetizzazione che si allinea alla direzione di B o con un moto di precessione cratterizzato da un certo valore di ω 0. Mandando una radiofrequenza M 1 prodotta da una spirale lungo l asse y si spinge il vettore magnetizzazione nel piano xy. Questo soltanto se la componente magnetica della radiofrequenza è tale che la frequenza di Larmor ω y di una delle componenti di questo campo è uguale alla frequenza di Larmor del nucleo osservato. Il vettore M xy tende a tornare indietro generando un campo oscillante che può essere registrato come corrente sull asse x.

115 ω o = γ B o Se questo fosse vero dovremmo avere un unico segnale per ogni tipo di nucleo (H, C ecc). In realtà l equazione corretta è ω o = γ B eff dove B eff = B o - B loc --- B eff = B o ( 1 - σ ) con σ = costante di schermo In pratica in una molecola organica, in funzione dell intorno chimico, avremo delle variazioni del campo magnetico. Ogni nucleo risentirà di un campo magnetico locale schermato dalla presenza degli altri nuclei ω o HO-CH 2 -CH 3

116 Strumentazione NMR B o N S Magnete - Superconduttore B 1 Frequency Generator Recorder Recorder - XY plotter, computer, etc., etc. Detector Frequency generator - Crea la corrente alternata (ω 1 ) che induce B 1. Può essere ad onda continua (vecchio) o pulsato Detector - Sottrae la frequenza base (una costante molto vicina ad ω o ) alla frequenza in uscita.

117 Eccitazione in onda continua La scansione delle radiofrequenze è continua ( ω = γ B), con registrazione concomitante di come differenti componenti M o generino M xy a frequenze diverse. Il risultato è uno spettro a righe nel dominio delle frequenze. ω o or B o ω o or B o time

118 Fourier Transform - Eccitazione pulsata Anche qui noi possiamo eccitare tutte le frequenze contemporaneamente e registrare quali componenti sono state assorbite. Per realizzare un onda quadra che copra tutte le radiofrequenze si emette una brevissima pulsazione di radiofrequenze ad alta potenza. Tutti i vettori magnetizzazione vengono piegati. A questo punto la radiofrequena è spenta ed i vettori M xy tornano allo stato originale generando vari campi che vengono registrati sull asse y. Il risultato è la FID (free induction decay) che è un interferogramma del (tempo) di decadimento oscillante dei vari vettori M xy.

119 Attraverso la trasformata di Fourier si passa dal dominio dei tempi al dominio delle frequenze per cui, da un interferogramma come quello visto precedentemente, si può ottenere uno spettro leggibile S(ω) = s(t) e -iωt dt - s(t) = 1/2 π S(ω) e iωt dt -

120 Chemical shift Uno spettro viene registrato sempre nel dominio delle frequenze (Hz). La frequenza però ω o = γ B o ω = 2πν dipende da B o e quindi i valori osservati dipendono dall apparecchio utilizzato per registrare lo spettro. Pertanto si utilizza un parametro adimensionale (chemical shift o δ) definito come ω - ω ref δ = ppm (parti per milione) ω ref Come frequenza di riferimento si prende (per definizione) la risonanza del tetrametilsilano posta uguale a zero. Pertanto la risonanza NMR si esprime in ppm (δ) riferita al TMS.

121 B eff = B o - B loc --- B eff = B o ( 1 - σ ) σ = σ dia + σ para + σ l La costante di schermo è costituita da diversi contributi: σ dia contributo diamagnetico che dipende dallo schermo che la nuvola elettronica oppone a B o σ para termine paramagnetico che è generato dagli orbitali p. E dello stesso segno di B o σ l effetto dell intorno chimico (gruppi polari vicini nello spazio, effetti del solvente, aggregazione etc etc).

122 1 H NMR Relazioni struttura -chemical shift. Il campo di risonanza del protone è stretto, in tutto circa 20 ppm di cui diagnostici i primi 10. Lo schermo σ completo è calcolabile con l eq di Lamb. σ = µ o e 2 r ρ(r) dr 3 m e 0 Il parametro ρ(r) è la funzione d onda che descrive il nucleo in esame e tiene conto dei contributi dell orbitale molecolare di tutta la molecola. Data la difficoltà di un calcolo corretto si tiene conto dei vari contributi alla σ dia che sono dovuti principalmente a effeti induttivi, mesomeri e di anisotropia diamagnetica

123 H (1s) Un atomo di idrogeno isolato ha una simmetria sferica. Dall equazione di Lamb viene un valore di 17.8 ppm H (1s) C (sp 3 ) Introducendo un qualsiasi sostituente la densità elettronica attorno al nucleo dell H varia e viene deformata spostandosi sempre più verso il C (o l elemento a cui è legato) tanto più questo è elettronegativo o è a sua volta legato a gruppi elettronegativi. (Effetto induttivo) La densità elettronica attorno al nucleo dell H diminuisce e quindi esercita uno schermo minore al campo applicato. Per mettere il nucleo in risonanza, essendoci un minore schermo, sarà necessario un campo minore.

124 campi bassi deschermo Acidi aldeidi Aromatici Olefine CHX, protoni α a carbonili campi alti Alifatici schermo ppm TMS

125 Effetti induttivi Csp 3 -H Gli effeti di elettronegatività sono trasmessi attraverso gli orbitali molecolari e si risentono non solo sul H legato ad un C a sua volta legato direttamente ad X ma anche su H legati a C vicinali. H-CH 3 H-CH 2 I H-CH 2 Br H-CH 2 Cl H-CH 2 F E δ L effetto esiste anche con una sostituzione puramente alifatica che determina una parziale deformazione del legame H-CH 3 H-CH 2 -CH 3 H-CH 2 -CH 2 -CH 3

126 Effetti di anisotropia diamagnetica (Csp 2 -H e Csp-H) Quando un qualsiasi legame covalente è sottoposto ad un campo magnetico esterno B o, il movimento degli elettroni impegnati nel legame genera delle linee di forza. L effetto globale della costante di schermo determinato da queste linee di forza può essere calcolato. Si determinano così delle zone, i cosidetti coni di anisotropia diamagnetica, che si possono sommare o opporre (schermare o deschermare + o - ) al campo B o B o C C 1 σ = ( χ - χ ) ( 1-3cos 2 θ ) 3r 3 4π

127 Per un Csp 3 l angolo θ è di circa 57 e quindi il valore è 0 - C + + C H - Per un Csp 2 il H cade in una zona di deschermo (CH=C tra 5 e 7 ppm, CH=O tra 9 e 10 ppm) - C + + C H - Per un Csp il H cade in una zona di schermo (CHC tra 1 e 3 ppm) - + C C - H +

128 Un effetto ancora più evidente si ha quando ci sono anelli aromatici cioè 4n+2 elettroni liberi di muoversi in una corrente d anello B ring e - B o Questo determina un deschermo molto elevato per i protoni aromatici che risuonano tra 7 e 8 ppm (conferma sperimentale regola di Huckel) H

129 Effetti della corrente d anello H H H 7.41 H -2.9 H H H H H H 9.28 H H 0.38

130 Approccio empirico al calcolo del chemical shift. Regole di Shoolerey (vedi Silverstein, Chap. 4 appendix A-E). Sulla base dell osservazione dei dati sperimentali, è possibile quantizzare gli effetti sul chemical shift di un protone dovuti alla presenza di vari gruppi funzionali. Poiché tali effetti sono spesso additivi, ecco che è possibile applicare delle formule semplici per la predizione del chemical shift (attenzione a σ l che può spesso alterare il valori tabulati). In ogni caso per 1 H i valori tabulati (o calcolati) possono essere considerati affidabili con un incertezza di ± ppm Da un punto di vista dell analisi dello spettro è necessario ricordare delle zone di chemical shif attribuibili a certi tipi di segnali per visualizzare le famiglie di H-C presenti nella molecola. All interno delle zone poi le attribuzioni più precise potranno essere fatte con l ausilio dei calcoli (e di eventuali software

131 W H H Z Regole di Shoolery per Csp 3 -H δ = Σ (σ) ; δ = σ W + σ Z Substituent σ -H C=C C C C 6 H CO-R OH O-R O-CO-R NR 2 (H 2 ) Br Cl 2.53 Substituent σ -CH alkyl C N C 6 H CO-Ph CO- NR 2 (H 2 ) O-Ph O-CO-Ph NH-CO-R I F 3.30

132 H H =2.54 H H O = 5.07 O

133 Regole di Shoolery per Csp 2 -H H C C R cis δ = R gem + R trans + R cis R gem R trans Sub δ gem δ cis δ trans H Alkyl Cycloalk COOH Ar C=C OR Cl Sub δ gem δ cis δ trans CH 2 -X C C C N CO CO-N OCO-R NR Br

134 = 6.53 H H H = 3.99 H OH = 6.28

135 Regole di Shoolery per Aromatici H δ = R ortho + R meta + R para R ortho Substituent δ ortho δ meta δ para H CH NO COOH OCH Cl F CONH CH=CH SO 3 H R para R meta

136 Chemical shift per strutture varie O O 2.60 NH 2 OH O 9.87 O O NH N H O O O 3.50 N O O O O OH O O O 8.77 NO N N N N O O 7.48

137 Protoni mobili (C-X-H) Questi sono protoni scambiabili nel senso che formano legami a H con altre molecole della stessa natura e con acqua e/o acidi presenti nel solvente. Il loro δ pertanto è variabile e dipende dalla concentrazione, purezza e temperatura. I segnali di questo tipo di protoni scompaiono registrando uno spettro in presenza di D 2 O. R-OH Ph-OH RCOOH RNH 2 R 2 NH ArNH 2 NH acidi RSH ppm ppm >10 ppm ppm ppm ppm ppm Solventi per NMR CDCl 3 (7.26-1) d 6 -DMSO (2.49-5), CD 2 Cl 2 (5.32-3) D 2 O ( b) CD 3 OD (4.78-1; ) d 6 -acetone (2.04-5)

138 Integrazione Ad ogni segnale è associato un integrale, cioè un dato numerico proporzionale all area sottesa del picco e quindi proporzionale al numero di H che risuonano a quel valore di δ.

139 Struttura fine dello spettro (concatenazione) Nuclei attivi (protoni) che sono legati (o concatenati) tra loro accoppiano. Questo accoppiamento detemina una separazione tra righe, cioè il segnale relativo ad un protone appare come un insieme di linee. Vedere un segnale con una molteplicità di linee significa che il protone in esame vede un altro protone. In tal modo è possibile avere informazioni sulla concatenazione della molecola. J = 0 J 0 I S I S

140 19 F 1 H Nucleus B o Electron 19 F 1 H Immaginiamo di avere HF (due nuclei attivi) e di osservare il 19 F. Il momento magnetico del nucleo produce una piccola polarizzazione degli elettroni di legame e questa è trasmessa attraveso la sovrapposizione orbitalica all altro nucleo. Quindi per il F non vi sarà un unica transizione F α -F β ma 2 possibili transizioni F β α β H α F β α β H α F α β α H β F α α β H β

141 1 H 1 H B o C La stessa cosa avviene per un CH 2 con la differenza che l interazione si propaga attraverso gli elettroni di legame H-C-H (sp 3 ) L energia di interazione tra i due spin A-X è : E = J AB I A I B J AB è la costante di accoppiamento scalare (tra i legami) ed è indipendende dal sistema di riferimento usato

142 Se abbiamo due nuclei A-X che non interagiscono i due stati avranno la stessa energia (J = 0). Ma se i due nuclei interagiscono (J > 0) vi saranno due possibilità una con energia di transizione minore ed una con energia di transizione maggiore. Lo stesso (in valore assoluto) avviene con J>0) A X J = 0 J > 0 A X E 4 B o E 3 E 2 A 2 A 2 E A 1 A 1 E 1 J = 0 A 2 J > 0 A 1 A 2 A 1 ν A 1 = ν A 2 ν A 1 ν A 2

143 Possiamo dire in generale che se un certo nuclo A è accoppiato con n nuclei uguali X, la molteplicità di A sarà 2nI X +1. Quindi, per I = 1/2, n+1 Questa regola discende da l introduzione di una serie di semplificazioni e quindi vale per sistemi del primo ordine, cioè sistemi per i quali esiste un rapporto Δν / J 10. Se il valore è minore le semplificazioni non sono possibili ed il numero di linee aumenta a dismisura. CH 3 CH 2 OCOMe αα αβ βα ββ ααα ααβ αβα βαα αββ βαβ ββα βββ CH 3 CH2 J (Hz) CH 3 CH ppm 1.5 ppm

144 Il numero di linee che otteniamo per accoppiamento con nuclei uguali è l espansione binomiale nota come triangolo di Tartaglia 1 : n / 1 : n ( n - 1 ) / 2 : n ( n - 1 ) ( n - 2 ) / 6 : Per I = 1/2 abbiamo che ogni livello ci indica la molteplicità per l accoppiamento ed i numeri ci danno l intensità delle righe. 7 Hz) CH 3 -CHR-CH 2-12 righe o tripletto di quartetti 5 Hz)

145 Sistema di spin (notazione di Pople) Un sistema di spin è l insieme di nuclei (protoni) che accoppiano tra di loro. Saper analizzare un sistema di spin permette di avere un idea precisa sulle molteplicità attese per i vari gruppi di protoni equivalenti e quindi avere informazioni sulla connettività. Protoni chimicamente equivalenti: sono protoni che presentano lo stesso intorno chimico. Per essi si usa una lettera dell alfabeto con un numeratore che indica il numero di protoni equivalenti ( A 2 ). Se i sistemi sono del primo ordine Δν / J 10 si usano lettere lontane dell alfabeto (AX, A 2 X) se sono di ordine superiore Δν / J < 10 si usano lettere vicine (AB, XY ecc). H H H Caso del CH 3 CH 2 -O H H H H H H Caso del ClCH 2 CH 2 -O H H H OR Cl OR H H H H H H OR H OR H H Cl H H Cl OR H OR H H H

146 O Br O A 3 A 2 X 2

147 Tipi di J (H-H) 2 J Geminali (dipendono dall angolo 0-30 Hz). 3 J Vicinali (dipendono dall angolo diedro) relazione di Karplus (da 0-11 Hz, valor medio per libera rotazione circa 7 Hz) H H H S 4 S 2 H S 3 S 1 S 2 S 3 S 4 S 1 3 J trans >> 3 J cis ( Hz Hz) 4 J long range (sistemi W, allilica) 0-3 Hz orto J > meta J > para J (0-8 Hz)

148 Equivalenza chimica ed equivalenza magnetica. Due o più protoni sono chimicamente equivalenti se risultano equivalenti dopo aver effettuato una qualunque operazione di simmetria (o un rapido processo dinamico). H H H H COOH enantiotopici (A 2 ) HO H COOH diastereotopici (AB) H H H H HO OH HO H diastereotopici (AB) H H eq per rapida interconversione H H non equivalenti Tutti i CH 2 di una molecola chirale sono diastereotopici

149 Due o più protoni che sono chimicamente equivalenti sono anche magneticamente equivalenti se, rispetto ad un qualsiasi altro protone con cui accoppiano, presentano costanti di accoppiamento uguali. H H NO 2 H H H H Cl OR H H Cl OR AA XX CH 3 AA BB (AA XX ) Consideriamo il sistema AA XX, poiché le due J sono diverse, i livelli di energia dei due H- orto sono diverse e quindi dovremo considerare anche un accoppiamento J (A- A ). Quindi per H(A) avremo 2 x 2 x 2 componenti e per A altre 2 x 2 x 2 componenti AA XX

150 Analisi dei sistemi di spin Δν >> J COOH Cl COOH O O Δν = 0

151 OH O 7 Cl OH PPM O PPM

152 O O HO PPM O OH PPM

153 O O O O PPM HO PPM

154 OH PPM OH PPM

155 Disaccoppiamento selettivo OH PPM dec PPM

156 3 H 2 H 2 H 1H Exchange

157 2 H 2 H 3 H 3 H

158 4 H 1 H 1 H 2 H

159 5 H 3 H 1 H 2 H

160 C 9 H 12 I(Hd)= 4

161 C 10 H 12 O I(Hd)= 5

162 C 8 H 6 O 2 I(Hd)=6

163 C 5 H 8 O I(Hd)=2

164 C 6 H 12 O 2 I(Hd)=1

165 C 7 H 5 NO 4 I(Hd)=6

166 13 C NMR Anche se il 12 C non è attivo, il 13 C ha I = 1/2 come il protone. L abbondanza naturale del 13 C è 1.1 % e la sua sensitività magnetica (γ) 1,6% quella del protone per cui globalmente il nucleo è 1/5700 volte meno sensitivo del protone. Necessario usare quantità maggiori di prodotto Per registrare spettri al 13 C è necessario lavorare in trasformata di Fourier e (possibilmente) con campi alti. La frequenza di risonanza del 13 C è 1/4 di quella del protone, quindi un apparecchio che lavora a 200 MHz per H, lavora a 50 mhz per il C. Il C accoppia con il H attraverso una serie di J. Valgono le regole di molteplicità del protone (I = 1/2), per cui il CH 3 del prodotto seguente sarebbe 4 x 3 x 3 = 36 H H C H H H H H Cl 1 J = Hz 2 J = Hz 3 J = 10-1 Hz

167 Per questa ragione gli spettri routinari al 13 C vengono registrati in completo disaccoppiamento del protone (broad band decoupling) e pertanto i vari carboni (non equivalenti) risultano come delle righe singole. L intensità del segnale dipende dal tempo di rilassamento del C (che spesso è lungo alcuni secondi). Se al momento in cui arriva un secondo impulso il vettore magnetizzazione non è tornato sull asse z (completamente), la deflessione porta il vettore Mo al di sotto del piano xy. Pertanto una parte della componente del vettore lungo x viene persa. Al termine dell acquisizione, Carboni che hanno T 1 molto diversi hanno intensità diverse. T1 (meccanismo di rilassamento spin lattice) CH 3 >CH 2 >CH>>C z z B 1 M o x B 1 90 x Movimento che non contribuisce al segnale y y M xy ω o ω o

168 Il campo spettrale del 13 C è circa 230 ppm (dal TMS) B eff = B o - B loc --- B eff = B o ( 1 - σ ) σ = σ dia + σ para + σ l Nella detereminazione del Chemical shift prevale il termine σ para (legato all ibridazione del C ed al numero di sostituenti diversi dal H presenti sul C).

169 Csp ppm Csp ppm Csp ppm Anche in 13 C vi sono effetti induttivi ed effetti sterici dei sostituenti che possono essere previsti sulla base di parametri diversi Come si vede gli effetti sono legati moltissimo al tipo di sostituente a cui è legato il C (confrontare i 2 metili). Per la lista dei parametri per il calcolo dei chemical shift di un alcano vedi tabelle Silverstein. # "! Y # " Y! " #

170 Alcheni ed aromatici ppm CO ppm O O O H H H O O O X δ(n) = Σ(n) O O O OH OH OH O 170 O O 168 OH O 172 N H O 166 NH 2 N H O 164 O

171 Tecniche speciali in 13 C. Off resonance. Lo spettro è disaccoppiato con il disaccoppiatore all H adiacente al campo di risonanza del protone (circa 1000 Hz a sinistra). In tal modo le J C-H vengono ridotte di una unità di grandezza. Pertanto scompaiono le J 100 ( 2 J, 3 J etc) e rimane una frazione di 1 J. Pertanto un CH 3 apparirà come un quartetto, un CH 2 come un tripletto, un CH come un doppietto, un C quat. come un singoletto. APT. Utilizzando una sequenza di impulsi modulata si ottiene uno spettro a righe singole dove i C pari (C quaternari e CH 2 ) hanno una fase e C dispari (CH 3 e CH) ne hanno un altra. DEPT. Registrando spettri successivi con sequenze di impulsi diversi si hanno prima solo i CH, (impulso a 45 ) poi i CH e i CH 3 (impulso a 90 ) ed infine i CH 3 e CH su e CH 2 giu (impulso a 125 ).

172 3 2H 2H exch. 2 2

173 d d d d t t q s s

174

175 3H 3H 2H 2H 2H 2H

176 t t q t q t s

177 Correlation NMR Spectroscopy. Un normale spettro 1 H registrato in FT consiste di un impulso, acquisizione e di un intervallo di tempo necessario a permettere il rilassamento (Mo torna sull asse z). 90 y 90 y t 2 t d t 2 t d Consideriamo di introdurre un tempo di evoluzione prima di ogni acquisizione. Questo comporta una ulteriore modifica del vettore magnetizzazione prima dell acquisizione y y t 1 t 2

178 Questo tempo di evoluzione può essere fatto variare in maniera ciclica con piccoli incrementi successivi (t d1-n ). La sorte del vettore magnetizzazione sarà la seguente t Dn t D1 t D2 t D3 Dopo il primo impulso a 90 il vettore magnetizzazione tende a tornare (ruotando) all asse z. Se aspettiamo un tempo t 1 brevissimo troveremo tale vettore nello spazio intermedio. Il secondo impulso a 90 lo manderà nello spazio sottostante per cui le componenti nel piano xy daranno due vettori di cui quello su x rimane invariato e l altro avrà intensità minore. Ripetendo n volte questo effetto l intensità del segnale subirà una variazione ciclica (oscillante).

179 Se riportiamo il risultato globale in una serie di spettri registrati in sequenza avremo ω o f 2 (t 2 ) t 1 A(t 1 ) t 1 Pertanto avremo dati di frequenza su un asse (f 2, derivanti da t 2 ), e dati nel dominio dei tempi (t 1 ). Poichè la variazione di ampiezza di t 1 è anch essa periodica, io posso costruire una pseudo FID se mi riferisco a una certa serie di punti per ogni linea di frequenza f 2.

180 Avremo quindi una FID in t 1, e quindi fare una FT sul dominio dei tempi t 1 (la prima era già stata fatta rispetto al dominio t 2 ottenendo così uno spettro bidimiensionale. Avremo quindi lo spettro monodimensionale (nel dominio delle frequenze) in una dimensione, lo stesso nell altra dimensione e una serie di picchi corrispondenti alla diagonale dell rettangolo che si forma (in pratica uno spettro a tre dimensioni) ω. ω o o f 1 ω o f 1 ω o f 2 f 2 Poiché il sistema per uno spettro reale è complesso da leggere si riporta il così detto contour plot cioè uno spettro dove sono rappresentate delle linee isobare corrispondenti al picco con una scala di colori che serve a dare l idea dell altezza del segnale

181 Se noi applichiamo questa tecnica ad un generico sistema AX otteniamo uno spettro di questo genere. Oltre ai picchi sulla diagonale, che rappresentano i due doppieti nelle due dimensioni, otteniamo due crosspeacks fuori diagonale. Da questo deduciamo che i due segnali sono in correlazione tra loro, cioè accoppiano. In tal modo abbiamo ottenuto uno spettro COSY cioè uno spettro di correlazione homo-nucleare ω A ω X ω X f 1 ω A f 2

182 αβ A ββ X βα J (Hz) X A αα A X Consideriamo il sistema AX. Se osserviamo A ed applichiamo entrambe gli impulsi a π / 2, avremo una parziale inversione della popolazione degli spin di X e questo avrà un effetto su A (polarization transfer). In generale osserveremo un cambio del segnale di X (dopo un impulso) come funzione della risonanza di A e della J AX secondo l equazione A X (t 1,t 2 ) = A o * sin( ω A * t 1 ) * sin (J AX * t 1 ) * sin( ω X * t 2 ) * sin (J AX * t 2 ) Questo porta, dopo la FT, ad un plot dove nuclei per i quali c è un accoppiamento generano dei segnali fuori diagonale.

183 Spettro reale del pulegone O f

184

185 d t t q q t q s s s

186 La correlazione non è necessariamente homonucleare ma può essere anche eteronucleare. Ad esempio la sequenza di implusi può coinvolgere 1 H e 13 C C: H: t 1 { 1 H} Come già visto nel COSY, in funzione della variazione di t 1 che usiamo avremo un invesione nella variazione di popolazione del protone. Questa variazione di dipende da una serie di parametri tra cui la J CH

187 αβ 2 13 C 4 ββ 1 H 1,2 3,4 1 H αα 1 13 C 3 βα 1,3 2,4 C H t 1 (ω 1H ) In quanto l intensità del segnale in 13 C analizzata attraverso t 2 è modulata attraverso la frequenza del protone ad esso accoppiato, la FID 13 C avrà informazioni sulle frequenze 13 C e 1 H. Matematicamente l intensita delle linee del doppietto del 13 C dipenderà da ω 1H e J CH secondo un equazione A 13C (t 1, t 2 ) trig(ω 1H t 1 ) * trig(ω 13C t 2 ) * trig(j CH t 1 ) * trig(j CH t 2 ) ω 13C f 2 (t 2 )

188 Di nuovo, la FT in entrambe I domini porta ad un contour plot non simmetrico in quanto abbiamo due assi con frequenze diverse. Inoltre la J CH divide i segnali in due (o più componenti) con il rischio di sovrapposizioni di diversi sistemi di spin. ω 13C J CH ω 1H f 13 C: 1 f t 1 / 2 t 1 / E possibile però rifocalizzare la magnetizzazione con un impulso a 180 sul 13 C. 1 H: t 1 Δ 1 Δ 2 { 1 H}

189 In tal modo noi operiamo un disaccoppiamento che non dovrebbe essere possibile in un proceso di trasferimento di polarizzazione. Lo spettro risultante è una serie di cross peaks esistenti tra i segnali che accoppiano solo attraverso una 1 J. ω 1H f 1 f 2 ω 13C Con lo stesso principio di base si possono realizzare diversi tipi di sequenze per avere spettri bidimensionali che servono ad avere informazioni strutturali diverse: HMBC (hetcor con long range) INADEQUATE (homonucleare C-C) TOCSY (correlazione di coerenza) NOES ROESY (effetto NOE long range).

190 Fenomeni di rilassamento Il rilassamento è il modo con cui il vettore magnetizzazione torna nelle condizioni iniziali. Poichè le energie in gioco sono molto basse, l emissione avviene attraverso dei meccanismi assistiti: Rilassamento longitudinale o Spin-Lattice (T 1 ): Agisce sulla componente della magnetizzazione allineata lungo l asse z (M z ). La perdita di energia avviene attraverso un meccanismo che coinvolge altri spin presenti o specie paramagnetiche (orientazione degli spin) Rilassamento trasversale o Spin-Spin (T 2 ): Agisce sulla componente della magnetizzazione che giace sul piano <xy> (M xy ). C è defasamento di M xy Interazione dell omogeneità del magnete (fanning out). z z M z x x y y M xy

191 Per avere una trattazione matematica rigorosa di come si evolve la un sistema di spin immerso in un campo magnetico nel tempo, potremmo utilizzare l equazione di Bloch dm x (t) / dt = γ [ M y (t) * B z - M z (t) * B y ] - M x (t) / T 2 dm y (t) / dt = γ [ M z (t) * B x - M x (t) * B z ] - M y (t) / T 2 dm z (t) / dt = γ [ M x (t) * B y - M y (t) * B x ] - ( M z (t) - M o ) / T 1 Generalmente viene applicata al caso di B 1 nel piano <xy> e M o sull asse z. In ogni caso può essere usata in ogni caso e descrivere variazioni di M per ogni tempo.

192 Nuclear Overhauser Effect (NOE) Un modo attraverso il quale in sistema può rilasciare energia è il NOE che è profondamente legato ai fenomeni di rilassamento. In particolare il NOE è correlato con lo scambio di energia tra due spin che non sono accoppiati scalarmente ma (poichè interagiscono) si dice che sono accoppiati in modo dipolare. (J IS = 0), Il NOE è caratterizzato dall incremento (di intensità) di un certo segnale in uno spettro quando l equilibirio (o la distribuzione delle popoalzioni dei livelli) sono perturbati. Consideriamo il diagramma di energia di un sistema a due spin. ( ) αβ W 1I W 1S W 0IS W 2IS ββ () W 1S W 1I βα ( ) αα ( ) W rappresenta la velocità alla quale una certa transizione può avere luogo. Per un sisterma all equilibrio avremo che le transizioni W 1I e W 1S, che rappresentano transizioni single quantum sono le più probabili. W 0IS e W 2IS sono transizioni zero e double quantum e sono proibite dalle regole di selezione (o è più improbabile che avvengano)