etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx.

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1 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx DETERINAZIONE DEGLI ENTEROBATTERI PATOGENI: SHIGELLA 0. Generalità e definizioni Il enere Shiella comprende microranismi bastoncellari di dimensioni di 0,7-, 2- µm, appartenenti alla familia delle Enterobatteriacee, ram neativi, non mobili, aerobi e anaerobi facoltativi con metabolismo sia respiratorio, sia fermentativo. Le shielle fermentano solo pochi carboidrati senza produzione di as e idroeno solforato. Sono patoeni intestinali per l'uomo e per li altri primati e aenti ezioloici della dissenteria bacillare. La dose minima infettante è bassa ed è pari a 0-02 oranismi. La trasmissione dell infezione può avere luoo per contatto diretto o per inestione di alimenti e acqua contaminati. I sintomi sono evidenti dopo circa 2-96 ore. Numerosi possono comunque essere i casi asintomatici. La malattia, che ha una durata di circa 4-7 iorni, si manifesta di solito con diarrea, nausea e vomito di limitata ravità (tranne nei soetti anziani, nei defedati, neli immunocompromessi, nei malati di AIDS e nei bambini). Nel enere sono comprese 4 specie o sottoruppi all interno dei quali sono distinuibili uno o più sierotipi. La classificazione si basa su caratteristiche biochimiche ed antieniche e permette di distinuere: Sottoruppo A: Shiella dysenteriae. Non fermenta la mannite, comprende 0 sierotipi diversi in cui sono inclusi microranismi oriinariamente denominati Sh. schmitzii, Sh. ambiua, Sh. arabinotard e shielle del ruppo Larei-Sachs. Sottoruppo B: Shiella flexneri. Fermenta la mannite. Comprende 8 sierotipi principali in cui sono inclusi i bacilli oriinariamente indicati come paradissenterici, quali Sh. saionensis, Sh. newcastle e Sh. rio. Sottoruppo C: Shiella boydii. Fermenta la mannite e si differenzia dal sottoruppo B per altri caratteri biochimici oltre che antienicamente. Comprende sierotipi. Sottoruppo D: Shiella sonnei. Fermenta la mannite e, lentamente, il lattosio. Comprende due varietà sieroloiche. Le shielle posseono antieni somatici (O) di natura polisaccaridica. Essendo immobili sono sprovviste di cilia, e pertanto non sono dotate di antiene ciliare, ma possono presentare, nonostante la mancanza della capsula, un antiene K termolabile, che può inibire l'alutinazione deli antieni somatici con li antisieri corrispondenti. Oltre alla endotossina di natura polipeptido-lipidopolisaccaridica, Shiella dysenteriae produce una potente esotossina: è l'unico caso tra le Enterobatteriacee. L'isolamento di Shiella da acque superficiali e potabili non è frequente; i membri del ruppo non si riscontrano frequentemente né neli scarichi né in acque fecalizzate. Infatti, il microranismo risulta essere molto sensibile alle condizioni ostili del mezzo acquoso, all antaonismo di microranismi interferenti e, soprattutto, presenta una particolare sensibilità ai trattamenti di disinfezione. Shiella è infatti inattivata con 0,0 m/l di cloro in 0 minuti. Qualora vena rilevata nelle acque potabili, la sua presenza può essere messa in relazione ad inefficienza dei trattamenti (in particolare alla disinfezione) ed a marcate carenze del sistema di distribuzione. Shiella deve essere ricercata nelle acque destinate al consumo umano nell ambito della verifica del parametro Enterobatteri patoeni, inserito tra quelli elencati nel pararafo Avvertenza dell Alleato I del Decreto Leislativo n. del 200. Quale patoeno umano, Shiella deve essere obbliatoriamente assente nelle acque destinate al consumo umano.

2 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx. Campo di applicazione La procedura analitica viene utilizzata per il rilevamento di Shiella nelle acque sorive, sotterranee e superficiali, destinate o da destinare al consumo umano. 2.. etodi di analisi 2.. etodo 2... Principio del metodo Il metodo consente di valutare la presenza/assenza di Shiella in un determinato volume di acqua. La procedura analitica consiste in una serie di fasi successive che possono comprendere: Arricchimento, Isolamento ed, eventualmente, Conferma biochimica e Conferma sieroloica Strumentazione e vetreria. Normale attrezzatura di laboratorio (Appendice ) Volume da analizzare. Il volume di campione da analizzare, eneralmente pari a, è comunque in funzione della tipoloia e della qualità dell acqua da esaminare Terreni di coltura e reaenti Brodo GN Hajna Triptosio Glucosio D-annitolo Sodio citrato Sodio desossicolato Fosfato dipotassio Fosfato monopotassio Sodio cloruro ph 7,0±0, , 4, Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara seuendo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata, riscaldare aitando frequentemente. Dopo avere sciolto la polvere distribuire in beute in raione di 00 /beuta e sterilizzare a 2± per min. Conservare a ± per non più di un mese in condizioni ottimali. Il preparato è classificato come irritante (Xi) per la presenza di sodio desossicolato. Consultare la scheda di sicurezza prima dell impieo. 2

3 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx Xilosio Lisina Desossicolato Aar Xilosio L-Lisina Lattosio Saccarosio Cloruro di sodio Estratto di lievito Desossicolato di sodio Tiosolfato di sodio Citrato di ferro ammoniacale Rosso fenolo Aar ph 7,4±0,2, 7, 7, 2, 6,8 0,8 0,08 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara seuendo le istruzioni aitando frequentemente. Non surriscaldare e non sterilizzare. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di una settimana in condizioni ottimali. Esistono in commercio diversi substrati usati per l isolamento di Shiella che arantiscono buoni risultati in fase analitica anche se non esiste un unico substrato in rado di far crescere tutti i sierotipi di Shiella presenti. Il preparato è classificato come irritante (Xi) per la presenza di sodio desossicolato e sodio tiosolfato. Consultare la scheda di sicurezza prima dell impieo. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Enterococcus faecalis ATCC Aar nutritivo Peptone Aar ph 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Sterilizzare a 2± per min. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali Aar al ferro di Klier Estratto di lievito Peptone Sodio cloruro Lattosio Glucosio Ferro citrato Sodio tiosolfato , 0,

4 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx Rosso fenolo Aar ph 7,4±0,2 0 m 2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Distribuire in tubi in raione di circa 0 /tubo e dopo sterilizzazione a 2± per min. Lasciare solidificare su un piano inclinato per ottenere una superficie a becco di clarino. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Escherichia coli ATCC Soluzione di tetrametilparafenilendiamina dicloridrato all % N,N,N,N tetrametilparafenilendiamina dicloridrato 00 Dischetti o tamponi adatti all'uopo sono anche disponibili in commercio; in alternativa scioliere N,N,N',N'-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato in acqua distillata, preparando la soluzione al momento dell'uso. È da senalare che tale prodotto viene classificato, ai sensi della direttiva 67/48/CEE e successivi adeuamenti, come sostanza pericolosa Procedura 2... Fase di arricchimento Consiste in una fase di rivitalizzazione dei microranismi in idoneo brodo di coltura non selettivo. Rispettando le comuni norme di asepsi, filtrare almeno di campione su una membrana di 47 mm di diametro (porosità nominale 0,4 µm). Se è necessario, per la presenza di particolato in sospensione, la filtrazione può essere eseuita su più membrane. Trasferire sterilmente la membrana/e in 00 del brodo di arricchimento (2..4..) e incubare a 6± per 6-8 ore Fase di isolamento Dal brodo di arricchimento eseuire, prelevando un ansata, 2 subcolture per strisci multipli sul terreno di isolamento ( ): la prima dopo 6 ore di incubazione del brodo, la seconda dopo 8 ore. Incubare a 6± per 22±2 ore. Su Xilosio Lisina Desossicolato le colonie sospette di Shiella si presentano rosse Conferma biochimica Per l accertamento dell appartenenza delle colonie sospette al enere Shiella è opportuno procedere all esecuzione delle seuenti prove di conferma: prova della presenza della citocromossidasi e della fermentazione dei carboidrati. È possibile altrimenti effettuare direttamente l identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica disponibili in commercio. 4

5 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx Prima di effettuare le prove di conferma è necessario, onde verificarne la purezza, subcoltivare le colonie sospette su Aar Nutritivo (2..4..) incubando a 6± per 2± ore. Eseuire le prove su colonie con non più di 24 ore di sviluppo Prova della citocromossidasi Prelevare, seuendo le usuali reole di asepsi, con un'ansa sterile la colonia cresciuta sul terreno Aar Nutritivo (2..4..). Strisciare su una carta da filtro imbibita del reattivo (2..4..) preparato al momento dell'uso o saiare sui dischetti o con i tamponi adatti all'uopo distribuiti in commercio. Una reazione neativa si evidenzia quando non si produce alcuna colorazione; se positiva si sviluppa entro pochi secondi una colorazione blu-violetto. Shiella è ossidasi-neativa Prova della fermentazione dei carboidrati Dall Aar Nutritivo (2..4..) prelevare con un ansa sterile la colonia sospetta e trasferire, per infissione e successivo strisciamento, sulla superficie inclinata del terreno Aar al ferro di Klier ( ) Incubare a 6± per 8-24 ore. È essenziale che i risultati siano reistrati dopo 8-24 ore di incubazione. Shiella spp. non modifica la colorazione del terreno sulla superficie del becco di clarino e produce un viraio del terreno al iallo (reazione acida ) sul fondo Conferma sieroloica Qualora si ritena opportuno, si può procedere alla tipizzazione delle colonie mediante conferma sieroloica. È necessario senalare che molti sierotipi di Shiella possono essere confusi con quelli di Escherichia coli. Pertanto prima di procedere alla conferma sieroloica è necessario verificare con attenzione che le caratteristiche biochimiche siano tipiche del enere Shiella. La tipizzazione può essere eseuita utilizzando sieri polivalenti e sieri monovalenti anti-o, oppure inviando li stipiti ai centri di riferimento. Per lo svolimento della procedura si rimanda ai testi specifici Espressione dei risultati Considerare prodotte da Shiella le colonie che sono state individuate sulla base delle caratteristiche colturali e biochimiche. Riportare il risultato ottenuto come Shiella Assente o Presente in L e, se del caso, il sierotipo individuato. 2.2 etodo Principio del metodo Il metodo consente di valutare la presenza/assenza di Shiella in un determinato volume di acqua. La procedura analitica consiste in una serie di fasi successive che possono comprendere: Arricchimento, Isolamento ed, eventualmente, Conferma biochimica e Conferma sieroloica Strumentazione e vetreria. Normale attrezzatura di laboratorio (Appendice ).

6 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx Volume da analizzare. Il volume da analizzare, eneralmente pari a, è comunque in funzione della tipoloia e della qualità dell acqua da esaminare Terreni di coltura e reaenti Brodo GN Hajna Triptosio Glucosio D-annitolo Sodio citrato Sodio desossicolato Fosfato dipotassio Fosfato monopotassio Sodio cloruro ph 7,0±0, , 4, Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara seuendo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata, riscaldare aitando frequentemente. Dopo avere sciolto la polvere distribuire in beute in raione di 00 /beuta e sterilizzare a 2± per min. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali Salmonella Shiella Aar Peptocomplex Lattosio Sali biliari n Sodio citrato Sodio tiosolfato Citrato ferrico Aar Verde brillante Rosso neutro ph 7,0±0,2 0 8, 8, 8,, 0, 2 m m Il terreno si trova in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata, riscaldare fino ad ebollizione aitando frequentemente e non sterilizzare. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Enterococcus faecalis ATCC Aar nutritivo 6

7 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx Peptone Aar ph 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Sterilizzare a 2± per min. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali Aar al ferro di Klier. Estratto di lievito Peptone Sodio cloruro Lattosio Glucosio Ferro citrato Sodio tiosolfato Rosso fenolo Aar ph 7,4±0, , 0, 0 2 m Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Distribuire in tubi in raione di circa 0 /tubo e dopo sterilizzazione a 2± per min. Lasciare solidificare su un piano inclinato per ottenere una superficie a becco di clarino. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Escherichia coli ATCC Soluzione di tetrametilparafenilendiamina dicloridrato all % N,N,N,N tetrametilparafenilendiamina dicloridrato 00 Dischetti o tamponi adatti all'uopo sono anche disponibili in commercio; in alternativa scioliere N,N,N',N'-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato in acqua distillata, preparando la soluzione al momento dell'uso. È da senalare che tale prodotto viene classificato, ai sensi della direttiva 67/48/CEE e successivi adeuamenti, come sostanza pericolosa Procedura Fase di arricchimento Consiste in una fase di rivitalizzazione dei microranismi in idoneo brodo di coltura non selettivo. 7

8 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx Rispettando le comuni norme di asepsi, filtrare almeno di campione su una membrana di 47 mm di diametro (porosità nominale 0,4 µm). Se è necessario, per la presenza di particolato in sospensione, la filtrazione può essere eseuita su più membrane. Trasferire sterilmente la membrana/e in 00 del brodo di arricchimento ( ) e incubare a 6± per 6-8 ore Fase di isolamento Dal brodo di arricchimento eseuire, prelevando un ansata, 2 subcolture per strisci multipli sul terreno di isolamento ( ): la prima dopo 6 ore di incubazione del brodo, la seconda dopo 8 ore. Incubare le piastre a 6± per 22±2 ore. Su Salmonella Shiella Aar le colonie sospette si presentano incolori, eneralmente con marini netti, anche se spesso Sh. sonnei si presenta con marini irreolari. Le colonie ruose di Shiella sono inibite Conferma biochimica Per l accertamento dell appartenenza delle colonie sospette al enere Shiella è opportuno procedere all esecuzione delle seuenti prove di conferma: prova della presenza della citocromossidasi e della fermentazione dei carboidrati. È possibile altrimenti effettuare direttamente l identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica disponibili in commercio. Prima di effettuare le prove di conferma è necessario, onde verificarne la purezza, subcoltivare le colonie sospette su Aar Nutritivo ( ) incubando a 6± per 2± ore. Eseuire le prove su colonie con non più di 24 ore di sviluppo Prova della citocromossidasi Prelevare, seuendo le usuali reole di asepsi, con un'ansa sterile la colonia cresciuta sul terreno Aar Nutritivo ( ). Strisciare su una carta da filtro imbibita del reattivo ( ) preparato al momento dell'uso o saiare sui dischetti o con i tamponi adatti all'uopo distribuiti in commercio. Una reazione neativa si evidenzia quando non si produce alcuna colorazione; se positiva si sviluppa entro pochi secondi una colorazione blu-violetto. Shiella è ossidasi-neative Prova della fermentazione dei carboidrati Dall Aar Nutritivo ( ) prelevare con un ansa sterile la colonia sospetta e trasferire, per infissione e successivo strisciamento, sulla superficie inclinata del terreno Aar al ferro di Klier ( ). Incubare a 6± per 8-24 ore. È essenziale che i risultati siano reistrati dopo 8-24 ore di incubazione. Shiella spp. non modifica la colorazione del terreno sulla superficie del becco di clarino e produce un viraio del terreno al iallo (reazione acida ) sul fondo Conferma sieroloica Qualora si ritena opportuno, si può procedere alla tipizzazione delle colonie mediante conferma sieroloica. È necessario senalare che molti sierotipi di Shiella possono essere confusi con quelli di Escherichia coli. Pertanto prima di procedere alla conferma sieroloica è necessario verificare con attenzione che le caratteristiche biochimiche siano tipiche del enere Shiella. La tipizzazione può essere eseuita utilizzando sieri polivalenti e sieri monovalenti anti-o, oppure inviando li stipiti ai centri di riferimento. Per lo svolimento della procedura si rimanda ai testi specifici. 8

9 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx Espressione dei risultati Considerare prodotte da Shiella le colonie che sono state individuate sulla base delle caratteristiche colturali e biochimiche. Riportare il risultato ottenuto come Shiella Assente o Presente in L e, se del caso, il sierotipo individuato... etodo... Principio del metodo Il metodo consente di valutare la presenza/assenza di Shiella in un determinato volume di acqua. La procedura analitica consiste in una serie di fasi successive che possono comprendere: Arricchimento, Isolamento ed, eventualmente, Conferma biochimica e Conferma sieroloica...2. Strumentazione e vetreria. Normale attrezzatura di laboratorio (Appendice ).... Volume da analizzare. Il volume di campione da analizzare, eneralmente pari a, è comunque in funzione della tipoloia e della qualità dell acqua da esaminare...4.terreni di coltura e reaenti..4.. Brodo GN Hajna Triptosio Glucosio D-annitolo Sodio citrato Sodio desossicolato Fosfato dipotassio Fosfato monopotassio Sodio cloruro ph 7,0±0, , 4, Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara seuendo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata, riscaldare aitando frequentemente. Dopo avere sciolto la polvere distribuire in beute in raione di 00 /beuta e sterilizzare a 2± per min. Conservare a ± per non più di un mese in condizioni ottimali. Il preparato è classificato come irritante (Xi) per la presenza di sodio desossicolato. Consultare la scheda di sicurezza prima dell impieo. 9

10 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx Hektoen Enteric Aar Triptone Estratto di lievito Sali biliari n. Lattosio Saccarosio Salicina Cloruro di sodio Tiosolfato di sodio Citrato ferrico ammoniacale Aar Blu di bromotimolo Fucsina acida ph 7,4±0, , 6 0, m Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara seuendo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata. Riscaldare fino ad ebollizione aitando frequentemente. Non sterilizzare. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali. Esistono in commercio diversi substrati usati per l isolamento di Shiella, che arantiscono buoni risultati in fase analitica, questo substrato è comunque particolarmente adatto alla crescita di Shiella. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Enterococcus faecalis ATCC Aar nutritivo Peptone Aar ph 6,8±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Sterilizzare a 2± per min. Distribuire in capsule di Petri e lasciare solidificare. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali Aar al ferro di Klier Estratto di lievito Peptone Sodio cloruro Lattosio Glucosio Ferro citrato Sodio tiosolfato Rosso fenolo Aar , 0, m

11 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xx ph 7,4±0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni aitando frequentemente. Distribuire in tubi in raione di circa 0 /tubo e dopo sterilizzazione a 2± per min. Lasciare solidificare su un piano inclinato per ottenere una superficie a becco di clarino. Conservare a ± per non più di due settimane in condizioni ottimali. Per controlli di qualità utilizzare come controllo positivo Shiella flexneri ATCC 2022 e come controllo neativo Escherichia coli ATCC Soluzione di tetrametilparafenilendiamina dicloridrato all % N,N,N,N tetrametilparafenilendiamina dicloridrato 00 Dischetti o tamponi adatti all'uopo sono anche disponibili in commercio; in alternativa scioliere N,N,N',N'-tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato in acqua distillata, preparando la soluzione al momento dell'uso. È da senalare che tale prodotto viene classificato, ai sensi della direttiva 67/48/CEE e successivi adeuamenti, come sostanza pericolosa.... Procedura... Fase di arricchimento Consiste in una fase di rivitalizzazione dei microranismi in idoneo brodo di coltura non selettivo. Rispettando le comuni norme di asepsi, filtrare almeno di campione su una membrana di 47 mm di diametro (porosità nominale 0,4 µm). Se è necessario, per la presenza di particolato in sospensione, la filtrazione può essere eseuita su più membrane. Trasferire sterilmente la membrana/e in 00 del brodo di arricchimento (..4..) e incubare a 6± per 6-8 ore Fase di isolamento Dal brodo di arricchimento eseuire, prelevando un ansata, 2 subcolture per strisci multipli sul terreno di isolamento (..4.2.): la prima dopo 6 ore di incubazione del brodo, la seconda dopo 8 ore. Incubare a 6± per 22±2 ore. Sul terreno Heckoen Enteric aar Shiella cresce con colonie verde chiaro senza viraio del terreno. I coliformi crescono come colonie color salmone ed il terreno vira al rosa tendente all arancio e si opacizza per la precipitazione dei sali biliari. Le colonie di Salmonella si presentano di colore verde-blu o blucon o senza centro nero.... Conferma biochimica Per l accertamento dell appartenenza delle colonie sospette al enere Shiella è opportuno procedere all esecuzione delle seuenti prove di conferma: prova della presenza della citocromossidasi e della fermentazione dei carboidrati. È possibile altrimenti effettuare direttamente l identificazione delle colonie sospette utilizzando i sistemi miniaturizzati di identificazione biochimica disponibili in commercio.

12 etodi analitici ufficiali per le acque destinate al consumo umano ai sensi del D.Ls. /200 Reparto di Iiene delle Acque Interne Rapporti ISTISAN 0/xxx Prima di effettuare le prove di conferma è necessario, onde verificarne la purezza, subcoltivare le colonie sospette su Aar Nutritivo (..4..) incubando a 6± per 2± ore. Eseuire le prove su colonie con non più di 24 ore di sviluppo Prova della citocromossidasi Prelevare, seuendo le usuali reole di asepsi, con un'ansa sterile la colonia cresciuta sul terreno Aar Nutritivo (..4..). Strisciare su una carta da filtro imbibita del reattivo (..4..) preparato al momento dell'uso o saiare sui dischetti o con i tamponi adatti all'uopo distribuiti in commercio. Una reazione neativa si evidenzia quando non si produce alcuna colorazione; se positiva si sviluppa entro pochi secondi una colorazione blu-violetto. Shiella è ossidasi-neativa.... Prova della fermentazione dei carboidrati Dall Aar Nutritivo (..4..) prelevare con un ansa sterile la colonia sospetta e trasferire, per infissione e successivo strisciamento, sulla superficie inclinata del terreno Aar al ferro di Klier (..4.4.) Incubare a 6± per 8-24 ore. È essenziale che i risultati siano reistrati dopo 8-24 ore di incubazione. Shiella spp. non modifica la colorazione del terreno sulla superficie del becco di clarino e produce un viraio del terreno al iallo (reazione acida ) sul fondo Conferma sieroloica Qualora si ritena opportuno, si può procedere alla tipizzazione delle colonie mediante conferma sieroloica. È necessario senalare che molti sierotipi di Shiella possono essere confusi con quelli di Escherichia coli. Pertanto prima di procedere alla conferma sieroloica è necessario verificare con attenzione che le caratteristiche biochimiche siano tipiche del enere Shiella. La tipizzazione può essere eseuita utilizzando sieri polivalenti e sieri monovalenti anti-o, oppure inviando li stipiti ai centri di riferimento. Per lo svolimento della procedura si rimanda ai testi specifici...6. Espressione dei risultati Considerare prodotte da Shiella le colonie che sono state individuate sulla base delle caratteristiche colturali e biochimiche. Riportare il risultato ottenuto come Shiella Assente o Presente in L e, se del caso, il sierotipo individuato. BIBLIOGRAFIA American Public Health Association. Standard methods for the Examination of Water and Wastewater. A.P.H.A., A.W.W.A. (Ed.), 8th ed. Washinton D.C.: APHA, 992. IRSA-CNR etodi analitici per i fanhi. Quaderno 64, CNR-ISTITUTO DI RICERCA SULLE ACQUE, Roma: 98. Ottaviani., Bonadonna L. etodi analitici per le acque destinate al consumo umano Vol. II Parte 2. etodi microbioloici. Roma: Istituto Superiore di Sanità; (Rapporti ISTISAN 00/4). 2