zafferano Fingerprint e caratterizzazione molecolare per la tracciabilità della qualità

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1 LABORATORIO zafferano Fingerprint e caratterizzazione molecolare per la tracciabilità della qualità Foto di Emilie40 Una spezia il cui valore la rende la più cara al mondo e anche quella più suscettibile ad adulterazioni e sofisticazioni. Lo zafferano contiene un gran numero di principi attivi che ne fanno un colorante naturale per gli alimenti in grado di unire al caratteristico giallo anche un aroma unico, che si incontra in tante preparazioni culinarie dell area mediterranea e dell Oriente. A garanzia di queste preziose proprietà è necessario attuare importanti accorgimenti nella lavorazione dei fiori e nell essicazione degli stigmi, oltre a un rigoroso controllo di qualità del prodotto finito. 38 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

2 * Caterina Miotti Lo zafferano (Crocus sativus L.) è una pianta erbacea perenne, con altezza da 10 a 30 cm che si sviluppa a partire da un cormo (bulbo-tubero). I fiori sono ermafroditi e possiedono tre stami e uno stilo lungo, diviso nella parte superiore in tre stigmi di colore rosso vivo che hanno una lunghezza paragonabile a quella della corolla (2,5-3,7 cm) e sono costituiti da un filamento sfrangiato e dilatato sulla sommità. È una pianta triploide e di conseguenza non può produrre semi e viene propagata per via agamica dall uomo attraverso cormi (Gresta et al. 2008). Esistono molte specie del genere Crocus, la maggior parte delle quali coltivate a scopo ornamentale a causa dell elegante colorazione dei sepali e dell insolito periodo di fioritura autunnale-invernale. Il genere sativus viene coltivato da millenni nel bacino mediterraneo (Spagna, Francia, Italia, Grecia, Turchia, Libia, Egitto, Marocco) e in Medio Oriente, con particolare prosperità in Iran ma anche in Azerbaijan, Pakistan, India e, in epoca relativamente recente, anche in Nuova Zelanda e Australia (Caballero-Ortega et al. 2005). In Italia l andamento della sua coltivazione è stato abbastanza altalenante: dai 450 ha stimati tra il 1830 e il 1900, distribuiti principalmente tra Abruzzo, Sardegna, Toscana e Umbria, fino ai pochi ettari stimati alla fine secolo scorso (Di Francesco 1990, Negby et al. 1989). Tale decadenza ha spiegazioni socio-economiche diverse a seconda delle regioni, ma la direttrice comune è stata l avvento dei coloranti di sintesi prodotti dalle industrie chimiche a prezzi irrisori rispetto a quelli dello zafferano (Di Francesco 1990). Il nuovo desiderio di riscoperta degli antichi sapori e una virata dei gusti verso mercati biologici ha riportato in auge questa preziosissima spezia, che attualmente trova nella nostra penisola una sempre crescente area di coltivazione. La raccolta dei fiori (da metà ottobre) deve essere effettuata entro le prime luci dell alba poiché, con il depositarsi della rugiada sopra gli stigmi, si avrebbe perdita dei principi attivi. Il periodo della fioritura è scalare e dura circa 20 giorni, 10 dei quali vedono sbocciare con maggior intensità il prezioso manto violaceo. Entro poche ore dalla raccolta i fiori devono essere distesi su tavoli e deve essere fatta, rigorosamente a mano, la separazione degli stigmi dal calice (sfioratura). In passato i secondi e i terzi venivano buttati o utilizzati per adornare le case dei contadini prima della marcescenza, ma negli ultimi anni analisi chimiche effettuate se questi prodotti di scarto hanno mostrato la possibilità di un loro impiego come seconde materie prime in altri cicli produttivi. Gli stigmi freschi vengono tradizionalmente posti in un setaccio da farina e asciugati sulla brace presso il camino per minuti, effettuando ogni operazione con estrema cura poiché è da essa che dipende la qualità della droga che sarà prodotta. Il disseccamento deve giungere al punto in cui gli stigmi, se premuti tra due dita, non si rompono ma mantengono una buona elasticità: l umidità residua deve essere stimata tra il 10 e massimo il 20%. Entro poco tempo dalla fine dell essiccazione, la droga deve essere riposta in sacchetti o barattoli ermeticamente chiusi perché essendo igroscopica, se mal conservata, si incorre in una drastica riduzione della sua qualità e shelf-life. Ambiente climatico e pedologico Per lungo tempo lo zafferano è stato trascurato dai ricercatori e dagli agricoltori fino a venir considerato una coltura minore e venir utilizzato solo per la diversificazione agricola. Negli ultimi anni ha acquisito un particolare interesse come coltivazione organica e a basso impatto ambientale dato che quasi non necessita irrigazione, fertilizzanti chimici o diserbanti. Le uniche cure che devono essere praticate sono l impianto dei cormi, la raccolta dei fiori, la separazione degli stigmi e l estrazione dei bulbo-tuberi dal terreno, tutte effettuate manualmente (Gresta et al. 2007). Questo spiega l elevato prezzo e il progressivo gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 39

3 LABORATORIO abbandono nel ventennio passato della coltura. La droga La droga, presente in F.U., è costituita dagli stigmi essiccati di Crocus sativus L. Si presenta come una massa di filamenti che risultano untuosi al tatto, elastici e flessibili, nella quale filamenti più grossi, di colore rosso-aranciato scuro, sono mescolati a filamenti più sottili di colore giallo. Gli stigmi tubulosi sono di colore più cupo e misurano da 20 a 40 mm di lunghezza allo stato secco e da 35 a 50 mm dopo imbibizione con acqua. I tubuli vanno gradualmente allargandosi verso la sommità, sono incisi su un lato, aperti e a margine finemente dentato (Lodi, 1978). Lo stilo, lungo 5 mm al Figura 1. Ingrandimento degli stigmi di zafferano. massimo, è giallo chiaro e porta 3 stigmi, la cui forma e dimensione sono evidenziate in Figura 1. L odore, che si sviluppa soltanto dopo l essiccazione, è caratteristico e il sapore è aromatico, debolmente amaro e può presentare note floreali o fruttate; masticata, colora la saliva in giallo e si polverizza con difficoltà (Coccovilli, 1938). La polvere, osservata al microscopio, presenta granuli di polline sferoidali e lisci, frammenti di epidermide con papille degli stigmi e piccoli vasi spiralati (Wichtl et al. 2006). Viene venduto sia in forma non lavorata, cioè in stigmi interi, sia macinato. La quasi totalità dei prodotti commerciali si trova in quest ultima forma. Nel commercio lo zafferano si distingue poi, a seconda della provenienza, in vari tipi: italiano o de L Aquila, spagnolo o di Castilla la Mancha, greco, ecc. Le diversità tra gli zafferani di varia provenienza si determinano dalla tipologia di coltivazione, dai fattori di adattabilità ambientale (clima e suolo) e dal contenuto percentuale dei fitocomplessi degli stigmi. Lo zafferano dunque non è sempre lo stesso in tutti i paesi: per esempio quello delle Colline Fiorentine si caratterizza per l elevato potere colorante. La qualità cosiddetta superiore viene privata totalmente degli stili (i quali sono inattivi) mentre la quantità che presenta non più del 10% del prodotto di femminelle è detta naturale (Coccovilli 1938; Taddei e Giachetti 1980). Composizione chimica degli stigmi L analisi della composizione chimica dello zafferano ha rilevato circa il 10-15% di acqua, 12-14% di sostanze azotate, 5-8% di grassi, 0,4-2% di olio essenziale, 5% di minerali, 5% di fibre grezze, % di zuccheri tra i quali amido, zuccheri ridotti, pentosi, gomme, pectine e destrine, in più riboflavina (la concentrazione di vitamina B2 è tra le più elevate tra gli alimenti), tracce di tiamina (vitamina B1), α-tocoferolo (vitamina E) e sostanze fenoliche. Il range di concentrazione dei costituenti può variare molto a seconda delle condizioni di crescita e del paese di origine. Le componenti bioattive responsabili del profilo sensoriale e dell effetto farmacologico sono quattro: crocina, crocetina, picrocrocina e safranale, tutte con struttura terpenoidica. Sono stati identificati carotenoidi sia lipofili sia idrofili e, tra questi ultimi, il più importante è la crocina, che rappresenta dal 6 al 16% della sostanza secca, secondo il germoplasma, le condizioni di crescita, metodo di essiccazione e conservazione. Essa è un glucoside nel quale l aglicone è rappresentato da una molecola di crocetina (C 20 H 24 O 4 ) esterificata alle estremità carbossiliche con uno o due molecole zuccherine, generalmente di gentiobiosio unite tra loro con legame glucosidico di tipo β. Tra queste la più abbondante è la crocina-4, che conferisce elevata idrosolubilità alla molecola. La picrocrocina [(R)-4-(β-D-glucopiranosilossi)-2,6,6-trimetil-1-cicloeseno-1-carbossialdeide] è il principio amaro dello zafferano e rappresenta il secondo costituente quantitativamente più abbondante (tra l 1 e il 13%) nel prodotto fresco. Annusando stigmi freschi di zafferano si potrà notare che il caratteristico odore pungente è completamente assente, è infatti durante l essiccazione che l elevato calore e/o la beta glicosidasi provocano la perdita della frazione zuccherina e formazione dell idrossisafranale (HTCC) che, per cessione di una molecola di acqua, dà luogo all aldeide terpenoidica safranale (Figura 2). 40 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

4 Figura 2. Trasformazione della picrocrocina in safranale. Questo processo continua in modo notevole anche durante la conservazione, così che l aroma che si sprigiona dopo pochi mesi dall essiccazione sarà leggermente diverso da quello che possiamo percepire dopo nove mesi di stoccaggio. La molecola maggiormente presente nell olio essenziale è il safranale (2,2,6-trimetil-4,6-cicloesadiene-1-aldeide), un aldeide terpenica ciclica isolata per la prima volta nel 1884 da R. Kayser dall essenza di Crocus, in forma glucosidica. Alla formazione del complesso bouquet aromatico contribuiscono oltre 160 piccole molecole volatili generate durante l essiccazione, tra le quali troviamo anche α e β pinene, 1,8 cineolo, alcool β-feniletilico, naftalene, acido isobutenoico, aldeidi monoterpeniche, isoforone e suoi derivati, come il 2,2,6-trimetil-1,4-cicloesene-dione, il 4-ketoisoforone, il 2-idrossi-4,4,6-trimetil-2,5- cicloesadien-1-one e il 2,6,6-trimetil-1,4-cicloesadiene-1-carbossialdeide (Corradi C. e Micheli G., 1979; Dewick P.M., 2001; Giachetti e Taddei, 1980; Liakopoulou e Kyruakidis, 2002; Wichtl M. et al., 2006; Winterhalter e Straubinger, 2000 ). Negli stigmi di zafferano è anche presente una certa concentrazione di flavonoidi, costituita principalmente da flavonoli derivati da kampferolo e quercetina (Carmona et al., 2005, Vignolini et al., 2008) Metodo di essiccazione e sviluppo proprietà sensoriali Il processo con il quale lo zafferano viene essiccato cambia molto secondo la tradizione del paese d origine. Nell area mediorientale (Iran e Marocco) e in India è usanza lasciare gli stigmi a seccare a temperatura ambiente (18-20 C) sotto la luce diretta del sole o in luoghi ombreggiati e ben arieggiati. Il tempo necessario per raggiungere un umidità dell 8 10% può variare tra le 24 ore (Iran) e i 2-4 giorni (India). In Italia questo processo viene effettuato utilizzando aria calda o altra fonte di calore: tradizionalmente gli stigmi vengono stesi ad asciugare su di un setaccio sopra a una brace viva di legno di rovere e rimestati per favorire un essiccazione omogenea. Una temperatura di C per circa 75 minuti è sufficiente affinché gli stigmi raggiungano il 5-20% di umidità, equivalente a una consistenza elastica che gli consenta, se premuti tra due dita, di piegarsi senza sgretolarsi. In Spagna l essiccazione tradizionale è effettuata su stufe a legna o caminetto rustico, alla temperatura di 55 C per 75 minuti anche se, sempre più frequentemente, viene applicato un nuovo metodo nel quale si ha un iniziale somministrazione di calore a C per 20 minuti seguito da un essiccamento continuativo a temperatura più bassa (43 C). Per far luce sul meccanismo col quale ottenere la massima concentrazione di principi attivi Del Campo nel 2010 ha simulato le quattro modalità di essiccazione sopra citate (compresa quella a elevate temperature), avvalendosi di forni elettrici per la standardizzazione di tempi e temperature. Tali valori sono riportati in Tabella 1. Dalle analisi qualitative dei prodotti ottenuti è emersa una notevole variazione di principi attivi a seconda del metodo post-raccolta utilizzato: il campione 1 risulta quello con aroma meno intenso e più povero in crocine a causa del lungo tempo di arieggiamento che favorisce la degradazione enzimatica degli esteri della crocetina. Gli studi hanno evidenziato che il processo per ottenere la migliore qualità dello zafferano è quello spagnolo modificato, smentendo la tesi di Raina del 1994 che indicava temperature di 40 ± 5 C come le ottimali per il maggiore sviluppo di crocine. È stata convalidata la tesi di Carmona del 2007 secondo la quale lo sviluppo di queste molecole venisse implementato con elevate temperature per brevi lassi di tempo, anche se tra i gruppi 2 e 3 non ci sono differenze significative. Nello studio di Del Campo emerge che utilizzando temperature medio-alte aumenta la formazione delle trans-crocine e si riduce quella delle cis-crocine. Ciò si traduce, dato il minor coefficiente di estinzione molare di queste ultime, in un potere colorante del campione 4 di quasi 10 punti ucs (Units of colouring strength, unità di misura con la quale, nella normativa ISO/TS :2003, si stabilisce il potere colorante dello zafferano; la soglia minima consentita per un prodotto di prima categoria sono 190 ucs) superiore rispetto all 1. Applicando il metodo spagnolo modificato il contenu- PAESE TEMPERATURA ( C) TEMPO 1 Iran, India ore 2 Italia minuti 3 Spagna minuti 4 Spagna modificato minuti min n.d. Tabella 1. Temperature e tempi impiegati in alcuni paesi per essiccare gli stigmi di zafferano. gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 41

5 LABORATORIO to di picrocrocina, responsabile del gusto amaro, aumenta considerevolmente ed è stato possibile ottenere uno sviluppo di safranale fino a 25 volte superiore rispetto a un prodotto essiccato a temperature intermedie (Carmona et al., 2007; Del Campo et al., 2010; Raina et al., 1996). Sostanze comunemente impiegate nelle sofisticazioni Costo ingente, ridotta produzione ed elevata domanda sul mercato hanno reso lo zafferano, fin dai tempi antichi, una droga altamente soggetta ad adulterazioni e sofisticazioni; basti pensare che nel Medioevo, a Norimberga, importante snodo commerciale per i traffici europei, esisteva un autorità preposta al controllo della merce in arrivo, e coloro che tentavano di vendere zafferano adulterato andavano incontro a pene tremende: il truffatore poteva anche essere bruciato o seppellito vivo. Adesso, per l ingresso sul mercato internazionale, è previsto che la droga soddisfi i requisiti della normativa ISO del 2003, che prevedono test chimici e microbiologici per valutare non soltanto la sicurezza ma anche la qualità di un prodotto. Ricordiamo che un prodotto si definisce adulterato quando subisce una sostituzione di una parte con un altra di qualità inferiore o di natura diversa o sottrazione dei principi attivi o aggiunta di sostanze inerti, mentre è falsificata quando subisce una sostituzione integrale, o quasi, con un altro prodotto che ne ha solo l aspetto. Un esempio molto frequente è quello in cui gli stili non vengono separati dagli stigmi prima dell essiccazione, aggiungendo al prodotto finale dal 30 al 50% di sostanza che non possiede alcun valore commerciale. Le sofisticazioni e adulterazioni alle quali va incontro questa spezia sono divise in tre categorie: 1) miscelazione con diverse parti di piante; 2) aggiunta di sali inorganici o composti organici volti ad aumentare il peso; 3) aggiunta di zafferano invecchiato e nuovamente colorato con sostanze artificiali. Le parti di piante che vengono più frequentemente individuate durante i controlli sono: femminelle (stili) e altre parti inattive dei fiori di Crocus sativus L., stigmi di varietà di zafferano selvatico (Crocus vernus All. e Crocus Luteus Gelb.), parti di piante diverse dallo zafferano ma che, se essiccate e arrotolate, ne possono assumere le sembianze, come i fiori di Carthamus tinctorius L. (zafferanone) o di Arnica montana L., i flosculi di Cynara cardunculus L. e di Calendula officinalis L. o i fiori tagliati in strisce di Papaver rhoeas L. (rosolaccio) o di Punica granatum L. (melograno), radichette di Allium pollium L. e stili di Zea mays L. Sono state trovate anche fibre di Beta vulgaris L. (barbabietola), di Cannabis sativa L. (canapa) colorate artificialmente, e carne secca sfilacciata (Hagh-Nazari e Keifi, 2007). Per aumentare il peso dello zafferano e ridurne il suo valore commerciale sono state individuate le più svariate sostanze: sali inorganici, solfati di bario, di calcio (gesso), di magnesio e di sodio, carbonati di calcio e di potassio, fosfati, borace, allume, cloruro di sodio, nitrati, sali ammoniacali, tartrato neutro di potassio, argilla e simili che spesso vengono mescolate a sostanze organiche che ne assicurano l aderenza agli stigmi, come miele, glicerina, sciroppo, glucosio e grassi. Lo zafferano vecchio, data la perdita di brillantezza, viene addizionato di coloranti artificiali, come Giallo di Martins, tropeolina, fucsia, acido picrico, eritrosina, scarlatto o ponceau 4R, azorubina, giallo di quinoleine, giallo aranciato, giallo naftolo, o più frequentemente tartrazina (E 102) (Hagh-Nazari e Keifi, 2007; Libro bianco), causa di molte allergie e intolleranze, perché stimola la liberazione di istamina; è particolarmente tossica per i bambini perché, se associata ad acido benzoico (E 210) è causa di iperattività (Basso, 2009). Lo zafferano in polvere presenta un grado di sofisticazione estremamente elevato e a esso possono essere addizionati, oltre ai coloranti sopra citati, Curcuma longa (curcuma), paprica o legni tintorei. È pertanto raccomandabile acquistare soltanto la droga in stigmi perché le sofisticazioni sono più facilmente individuabili. Legislazione Italiana e Norma ISO A tutela del prodotto in Italia vi sono attualmente poche leggi: il R.D.L n Norme per la tutela della denominazione di zafferano, il Regolamento n. 178/2002 del Parlamento Europeo e del Consiglio che stabilisce i principi e requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l Autorità Europea e fissa le procedure per la sicurezza alimentare e il D.P.R n. 283 In materia di disciplina igienica della produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande. Nei loro articoli sono riportate norme di carattere generale, alle quali anche lo zafferano deve attenersi. Le specifiche tecniche alle quali deve rispondere non sono univoche in tutti i paesi europei e in Italia sono quelle stabilite dall ISO (International Organization of Standardization), secondo la classificazione ISO/ TS 3632 (2003), comprendente un ampio numero di parametri chimici e fisici volti a sancirne la 42 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

6 qualità. Lo zafferano è uno delle poche spezie capace di trasmettere colore, sapore e aroma agli alimenti e quello di elevata qualità deve avere la maggior concentrazione possibile dei principi attivi che impartiscono queste caratteristiche. Affinché sia valorizzato il suddetto prodotto devono essere determinati sia i parametri propri della spezia (intrinseci) attraverso saggi qualitativi, sia i requisiti esogeni (estrinseci) attraverso saggi macroscopici e microscopici, che le qualità sensoriali attraverso l analisi sensoriale (Libro bianco). Per l individuazione dei parametri estrinseci è prevista un analisi macro e microscopica con microscopio ottico mentre per l analisi delle caratteristiche intrinseche è previsto che i risultati ottenuti dai test di seguito elencati rientrino all interno di parametri fisico-chimici stabiliti dalla ISO Le analisi sono: determinazione dell umidità e del contenuto della frazione volatile, contenuto di residui floreali e materie estranee, di ceneri totali e di quelle insolubili in acido cloridrico, contenuto in fibra grezza o cellulosa grezza, quello di azoto totale, identificazione dei pigmenti, la presenza di coloranti artificiali e il contenuto dell estratto acquoso. Questo ultimo viene scandagliato attraverso analisi Gas Cromatografica, dello spettro UV-Visibile e HPLC /DAD (Sánchez et al., 2009) e viene quantificata l assorbanza alle lunghezze d onda 440 nm, 257 nm e 330, corrispondenti rispettivamente alla crocetina e i suoi esteri (potere colorante), alla picrocrocina (potere amaricante) e al safranale (odore). Come evidenziato in Tabella 2, ISO ha stilato una classifica, suddivisa in tre categorie qualitative, dello zafferano che possiamo trovare sul mercato. A determinare la bontà della spezia concorrono, inoltre, l analisi dei residui di pesticidi che devono essere nei limiti elencati dalle normative europee sulle spezie e la presenza di microrganismi contaminanti la cui carica deve essere al di sotto dei limiti previsti dalla legislazione. Alla luce di quanto sopra riportato, i diverse Consorzi e Associazioni di tutela dello zafferano, per garantire la qualità e la tracciabilità dei propri prodotti, hanno stilato dei disciplinari di produzione, cioè delle norme con valore legale che definiscono i requisiti produttivi e commerciali di un prodotto DOP. Utilizzo nel settore alimentare Il maggiore utilizzo dello zafferano viene fatto nell industria alimentare, come aromatizzante nei settori lattiero-caseari, dei coloranti naturali per alimenti e soprattutto in cucina. Nel settore dolciario, prima dell avvento dei coloranti sintetici, era lo zafferano che impartiva aroma e colore a dolci tradizionali come panettone e pan di spagna; lo stesso discorso vale per l industria liquoristica e delle bevande analcoliche, nel settore delle quali vede il suo impiego più massiccio: aperitivi alcolici come amari, vermouth, fernet ACCADEMIA DEllA TISANA LE ERBE DI QUALITÀ Laboratori Biokyma s.r.l. Località Mocaia, 44B Anghiari (AR) gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 43

7 LABORATORIO CARATTERISTICHE CATEGORIE I II III Residui floreali % max 0,5 3,0 5,0 Corpi estranei (foglie steli, paglia, altro materiale vegetale) % max 0,1 0,5 1,0 Umidità e componenti volatili % max: Zafferano in filamenti Zafferano in polvere Ceneri sulla SS % max Potere amaricante espresso in lettura diretta dell assorbanza della picrocrocina a 257 nm sul secco Potere aromatico espresso in lettura diretta dell assorbanza del safranale a 330 nm sul secco Min Max Potere colorante espresso in lettura diretta dell assorbanza di crocina a 440 nm sul secco Coloranti acidi artificiali idrosolubili Assenti Assenti Assenti Tabella 2. Caratteristiche chimico-fisiche e merceologiche alle quali deve rispondere lo zafferano secondo la classificazione ISO uniscono le capacità di colorante e aromatico alle proprietà di tonico e stomachico. È prezioso anche come colorante nell industria lattiero-casearia in quanto, con un grammo di polvere di zafferano, possiamo colorare litri di latte (Interlandi, 2010). Lo incontriamo nella preparazione di piatti tradizionali non solo della nostra penisola (risotto alla milanese e arancini siciliani) ma anche di altri paesi, come la spagnola Paella Valenciana, la francese Bouillabaisse, l iraniano Shole Zard o l indiano Lassi di Zafferano. È ben nota l importanza del colore come fattore di gradimento di un alimento, tanto da riuscire ad alterare la percezione del gusto, e l ingresso sempre maggiore di additivi nei prodotti sulle nostre tavole dovrebbe indurci a prestare maggiore attenzione alla posizione salutare che occupa un colorante naturale rispetto a uno artificiale. Dati gli effetti benefici riscontrati con il consumo costante in dosi non terapeutiche di zafferano, nel 2011 Nehvi ha proposto il suo inserimento nella lista degli alimenti funzionali, sostanze la cui definizione, secondo il FU.FO.S.E. (Functional Food Science in Europe) è quella di alimenti che dimostrino in maniera soddisfacente di avere effetti positivi e mirati su una o più funzioni specifiche dell organismo, che vadano oltre i normali effetti nutrizionali, in modo tale che sia rilevante per il normale funzionamento dello stato di salute e di benessere e/o per la riduzione del rischio di malattia. Fermo restando che gli alimenti funzionali devono continuare a essere alimenti e devono dimostrare la loro azione nella quantità in cui vengono assunti normalmente nella dieta. Perché lo zafferano possa rientrare nella suddetta categoria è importante fare una discriminazione tra i prodotti italiani certificati e quelli generalmente presenti nei supermercati, dei quali spesso, oltre alla qualità, è difficile stabilire anche la provenienza. Per potergli attribuire delle proprietà fisiologiche è infatti necessario che il suo contenuto di principi attivi sia il più elevato e costante possibile, sicurezza che solo una certificazione di garanzia come quella rilasciata da una associazione di Tutela del Prodotto può dare. Il marchio DOP di cui si vanta lo zafferano proveniente da San Gavino Monreale (Sardegna), Città dell Aquila (Abruzzo), Fiesole (Toscana) e Città della Pieve (Umbria) assicura la tracciabilità dell alimento, la sua coltivazione in modo etico e trasparente e l elevata qualità. Aspetti economici della produzione La produzione annuale mondiale di zafferano è di circa 178 tonnellate di cui il 90% viene prodotto in Iran e il restante 10% in India, Grecia, Marocco, Spagna e Italia. Il maggior esportatore a livello mondiale è l Iran, seguito dalla Spagna. In Italia la produzione annua è strettamente connessa all andamento climatico e si può stimare una forbice produttiva tra i 450 kg e i 600 kg, su una superficie di circa ettari. Le regioni maggiormente interessate sono: Sardegna, Abruzzo, Toscana, Umbria, Marche mentre realtà cooperative o singoli produttori stanno emergendo in Sicilia, Cinque Terre, Valtellina, Puglia e nella Tuscia (Associazione Zafferano Italiano). Non è un caso che lo zafferano sia la spezia più cara al mondo: la sua produzione richiede un grande impiego di mano d opera e la meccanizzazione è scarsa o assente data la delicatezza delle operazioni che devono essere compiute (Libro bianco; Di Francesco, 1990). La sua produzione a oggi richiede un investimento iniziale abbastanza elevato, a partire dai bulbi, il prezzo dei quali si aggira intorno ai 15 euro/kg per una media di 1,1-1,3 kg/m², passando per gli attrezzi per lavorare il terreno, gli anticrittogamici e, soprattutto, 44 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

8 la mano d opera. È stato stimato che uno stame pesi circa 12 mg e che ogni fiore ne formi mediamente 3, perciò per produrre un grammo di prodotto fresco sarà necessario raccogliere fiori mentre per un grammo di stigmi secchi tale valore sale a fiori (Landi e Bertelli, 2001). In Italia, un appezzamento di terra di 1000 m² produce fiori del peso totale di kg (3,4-3,6 g per fiore), dai quali possono essere ottenuti 5-8 kg di stigmi freschi, che si riducono a 1-1,5 kg di prodotto secco. Questo si traduce, stimando il tempo di raccolta di 1000 fiori in 55 minuti e il tempo di mondatura degli stigmi in altri minuti, in ore di lavoro per la produzione di 1 kg di stigmi secchi. Al prodotto finale, oltre alle spese di produzione, bisogna addizionare quelle di confezionamento e commercializzazione: nelle zone dove la realtà è costituita da pochi ettari coltivati, distribuiti in piccoli appezzamenti, tali operazioni sono effettuate dal produttore stesso o da cooperative fondate da più agricoltori associati. Per quanto riguarda la grande distribuzione, i prezzi sul mercato italiano sono invece estremamente ingenti, poiché intermediari di vendita e alcuni terzisti, che si occupano del rifornimento di ristoranti e supermercati, arrivano ad aumentare il prezzo finale dalle 3 alle 5 volte il suo valore reale. Il valore indebitamente aggiunto alle confezioni primaria e soprattutto secondaria incidono in maniera significativa sul costo finale ed è ben comprensibile come la grande distribuzione trovi meno appetibile commerciare una spezia DOP italiana: una materia prima prodotta in modo etico, con tracciabilità garantita e di elevata qualità ha un prezzo iniziale superiore rispetto a una che non offre nessuna di queste garanzie. Accade persino che un prodotto importato sia venduto con la dicitura italiano, incrementando smisuratamente i guadagni degli autori della frode e screditando immeritatamente lo zafferano locale. Dato che il sistema di Normazione Internazionale annovera nella categoria I anche prodotti con scarso contenuto in esteri della crocetina e safranale, i Consorzi e le Associazioni di Tutela italiane si sono poste come scopo quello di realizzare azioni destinate a migliorare la politica di promozione dello zafferano che si fregia delle certificazioni DOP, dando impulso alle attività necessarie nell ambito dell accreditamento della qualità, della certificazione di tracciabilità e della sicurezza alimentare (Pampanini et al., 2012). Un esempio concreto a tal proposito è stata la recente fondazione dell Associazione Italiana Zafferano, il cui scopo è quello di rendere più omogeneo il livello di qualità chimico-fisico e merceologico, nonché il prezzo sul mercato dello zafferano DOP. Per raggiungere questo scopo è stato redatto un disciplinare che prevede l applicazione di tecnologie di coltivazione e di processo comuni e un metodo unico di essiccazione degli stigmi così da mantenere concentrazioni di principi attivi il più possi- LAVORAZIONI C/TERZI Integratori alimentari in capsule, liquidi e liofilizzati Si eseguono produzioni di piccoli e medi lotti - Integratori in capsule formato 0 - Integratori liquidi in monodose da 10 e 15 ml - Integratori con contagocce - Liquidi e soluzioni in flaconi fino a 1000 ml - Liofilizzazione in monodose con sigillatura sottovuoto - Integratori di nostra produzione con possibilità di personalizzazione - Lavorazione materie prime fornite dal cliente - Confezionamento finale - Assistenza per formulazioni personalizzate - Assistenza per la procedura di notifica ministeriale Tecno-lio S.r.l. Via Riviera Berica, Vicenza Tel fax info@tecno-lio.it Website: gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 45

9 LABORATORIO bile elevate e costanti su tutta la nazione. A oggi l Associazione Italiana Zafferano include quasi tutti i produttori toscani, umbri, sardi e della zona di L Aquila. Lo zafferano di Castilla la Mancha è attualmente considerato il migliore al mondo grazie alle sue caratteristiche chimico-fisiche e organolettiche e, davanti alle crescenti esigenze del mercato, è necessario introdurre norme volte a incrementare la competitività del prodotto Italiano a livello Nazionale ma non solo, promuovendo quello di eccellenza e proteggendo gli interessi delle denominazioni d origine (Libro bianco). Scopo di questo lavoro è quello di promuovere e tutelare il prodotto locale, mettendo in evidenza l elevata qualità che si rispecchia nell alto contenuto di principi aromatici e potere colorante, attenzione all ambiente, al lavoratore e alle certificazioni di provenienza che accompagnano il marchio DOP di Sardegna, Toscana, Umbria e Abruzzo. Per fare ciò si propone: - Caratterizzazione quali-quantitativa di zafferani toscani e confronto con altri zafferani italiani (Cascia, Città della Pieve.) e stranieri (es. Iraniani). - Messa a punto di una scheda panel degli stigmi in linea con le normative europee. - Potenziamento degli scarti di lavorazione (attraverso la caratterizzazione quali-quantitativa di tessuti di scarto provenienti da parte diverse di Crocus sativus non utilizzate per la produzione di zafferano: petali e stami). - Messa a punto di prodotti contenenti stigmi, petali e stami, volti a incrementare il fatturato degli agricoltori riducendo al contempo la produzione di scarti di lavorazione. - Definizione di un fingerprint tramite analisi NMR per la caratterizzazione del germoplasma dello zafferano. - Utilizzo di tecnologie alternative al fine di evidenziare la correlazione tra una determinata area geografica e la qualità dei prodotti che vi vengono coltivati, col fine di promuovere l ideazione di un meta-marchio che valorizzi il territorio e tuteli produttori e consumatori MATERIALI E METODI Descrizione dei campioni Le analisi sono state condotte su 6 diversi campioni commerciali di zafferano, le caratteristiche dei quali sono riportate in Tabella 3. Sono state condotte analisi anche sulle parti del fiore di Crocus sativus L. non impiegate nella produzione dello zafferano. Nella Tabella 4 sono riassunte le caratteristiche e le provenienze di ciascun campione. Metodo di essiccazione In Italia non viene usato un metodo standardizzato per l essiccazione degli stigmi poiché quello tradizionale prevede l impiego di brace viva, la cui temperatura è difficilmente controllabile. Alcuni agricoltori, che hanno di recente iniziato a usare il fornetto elettrico per tale procedura, stanno mettendo a punto un metodo che si avvicini il più possibile a quello storicamente impiegato, impostando temperature comprese tra 40 e 50 C per 75 minuti. Non ci sono dati per quanto riguarda l essiccazione dei campioni Iraniani. Metodi di estrazione Per recuperare i principi attivi dalle matrici sono stati utilizzati vari metodi di estrazione idonei al tipo di estratto che si voleva ottenere. Estrazione idroalcolica - Applicata a tutti i campioni analizzati. Estrazione con glicerolo - Applicata soltanto ai fiori dei campioni provenienti da Cascia e da Fiesole. Estrazione con glicerolo ed etanolo - Applicata soltanto ai fiori dei campioni provenienti da Cascia e da Fiesole Estrazione con alcool alimentare - Eseguita sui campioni di zafferano proveniente da Fiesole. Estrazione per analisi NMR - Un campione di stigmi italiano (pro- CAMPIONE PROVENIENZA ASPETTO RACCOLTO Zafferano 1 Italia Città della Pieve stigmi 2012 Zafferano 2 Italia Cascia stigmi 2012 Zafferano 3 Italia Fiesole stigmi 2012 Zafferano 4 Iran - Gonabad stigmi 2012 Zafferano 5 Iran -Torbat stigmi 2012 Zafferano 6 Iran -Ghaien stigmi 2012 Tabella 3. Caratteristiche, provenienze e anno di raccolta di ciascun campione impiegato nella produzione dello zafferano. CAMPIONE PROVENIENZA PARTE DELLA RACCOLTO PIANTA A Fiesole Tepali 2012 B Fiesole Stami 2012 C Cascia Tepali 2012 D Cascia Stami 2012 Tabella 4. Caratteristiche e provenienze di ciascun campione di parti di fiore non impiegate nella produzione dello zafferano. 46 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

10 veniente da Cascia) e uno iraniano (proveniente da Torbat) sono stati posti in una soluzione di acqua: D2O 9:1 per un ora e successivamente studiati e messi a confronto mediante NMR ad alta risoluzione, alla ricerca di possibili marcatori differenziali. RISULTATI E DISCUSSIONI Analisi degli estratti idroalcolici di Crocus sativus L. Analisi degli stigmi L analisi degli stigmi è stata condotta allo scopo di effettuare una caratterizzazione quali-quantitativa dei campioni a nostra disposizione, in modo da poter effettuare un confronto tra i prodotti italiani e quelli iraniani. Caratterizzazione qualitativa degli stigmi Analisi HPLC/DAD sono state effettuate con lo scopo di individuare i principi attivi presenti negli stigmi di zafferano dei 6 campioni. Nei campioni analizzati è stata evidenziata la presenza di analoghi della crocina (glicosidi della trans-crocetina) e per alcuni è stato possibile separare e identificare anche gli stereoisomeri, sono stati individuati flavonoidi come derivati del kaempferolo (kaempferolo-3-soforoside-7-glucoside, kaempferolo-3,7,4 -triglucoside e kaempferolo-3-soforoside), la picrocrocina e il safranale. Caratterizzazione quantitativa degli stigmi Le analisi quantitative sono state condotte in HPLC/DAD tramite l ausilio di curve di calibrazione costruite con standard rappresentativi delle diverse sottoclassi di componenti presenti (R 2 > 0,999). Dai dati ottenuti è emerso che la trans-crocina 4 è il carotenoide più abbondante in tutti i campioni analizzati, superando di circa tre volte la concentrazione del secondo maggior componente, la trans-crocina 3. Tra gli stigmi analizzati quelli provenienti dalle Colline Fiorentine (Fiesole) presentano il maggior contenuto in crocine, circa 200 mg/g in più rispetto a 2 dei 3 campioni iraniani. Anche il contenuto in picrocrocina è maggiore nel campione di Fiesole ( mg/g), e anche in questo caso risulta essere 2-4 volte superiore rispetto ai campioni Iraniani ( mg/g). Tale dato è molto rilevante poiché questa sostanza ha la duplice funzione di conferire piacevole sapore amaro alla spezia ed essere il precursore della molecola che gli conferisce l odore. Come precedentemente spiegato, il safranale si forma per scissione della frazione zuccherina dalla picrocrocina durante la tostatura e alcuni autori hanno proposto, considerando il fatto che l aroma subisce variazioni durante il processo di cottura, che a un elevato valore di picrocrocina corrisponda la formazione di ulteriore safranale dopo riscaldamento (Carmona et al., 2007). Lo zafferano italiano presenta concentrazioni molto superiori anche di safranale, presente comunque in tutti i campioni. I flavonoidi identificati sono quelli riportati in letteratura (Vignolini gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 47

11 LABORATORIO et al., 2008) con concentrazioni quasi sempre paragonabili nei campioni analizzati. Dai dati riportati emerge che lo zafferano italiano presenta alte concentrazione di principi attivi, decisamente superiori rispetto a quello iraniano. Questo potrebbe essere dovuto a molteplici fattori, quali il differente processo di essiccazione impiegato nei due paesi, le condizioni di conservazione o il germoplasma. Caratterizzazione di tepali e stami L analisi dei fiori si prefigge lo scopo di individuare e quantificare i principi biologicamente attivi presenti nei tessuti di scarto dello zafferano, con il fine di valorizzarne il contenuto e favorirne l introduzione in cicli produttivi alternativi, come quello alimentare, cosmetico e fitoterapico. Ciò apporterebbe il duplice beneficio di ridurre l impatto ambientale causato dallo smaltimento dei fiori (si parla di circa kg di materia fiorale per ogni kg di stigmi secchi) e di implementare le rendite degli agricoltori. Analisi qualitativa di tepali e stami I campioni di tepali e stami di Cascia e Fiesole (A, B, C, e D) sono stati analizzati in HPLC/DAD utilizzando un metodo di eluizione per l analisi delle crocine e dei flavonoidi e uno per gli antociani. Le analisi sono state acquisite a lunghezze d onda specifiche per ogni classe di molecole investigate. Per confermare l appartenenza alle classi di interesse dei picchi rilevati, sono stati acquisiti gli spettri UV-Vis per ciascuna sostanza eluita. In particolare negli estratti di tepali è stata evidenziata la presenza di antociani e di flavonoidi in accordo a precedenti lavori (Vignolini et al., 2008) Negli estratti analizzati è emersa la presenza di derivati del kampferolo e della quercetina (Vignolini, 2008; Goupy, 2013), oltre a tracce di crocine. Analisi quantitativa di tepali e stami I dati ottenuti hanno mostrato che i prodotti di scarto della lavorazione dello zafferano contengono una interessante quantità di flavonoidi, molecole dal riconosciuto potere antiossidante (Goupy et al., 2013). Estratti di zafferano per uso alimentare e cosmetico Il solvente utilizzato per la caratterizzazione dei vari tessuti di zafferano (EtOH/Acqua 70/30 acidificato con HCOOH) è ritenuto il più adatto per l estrazione dei principi attivi, ma non risulta compatibile come ingrediente nelle formulazioni di cosmetici e alimenti, per questo motivo sono stati preparati estratti glicerici o con alcool alimentare compatibili con la loro destinazione finale Estratti con glicerolo I campioni di fiori (petali e stami) sono stati sottoposti a estrazione glicerica e successivamente tali estratti sono stati sottoposti ad analisi quali-quantitativa HPLC/ DAD. L analisi quantitativa è stata condotta con l ausilio di curve di calibrazione specifiche (R 2 >0,9999), in particolare i flavonoidi sono stati calibrati utilizzando la quercitrina come standard di riferimento. L analisi HPLC/DAD ha permesso di evidenziare la presenza di composti flavonoidici e tracce di crocine. Estratti con glicerolo-etanolo Gli estratti sono stati sottoposti ad analisi quali-quantitativa HPLC/DAD. L analisi quantitativa è stata condotta con l ausilio di curve di calibrazione specifiche (R 2 >0,9999), in particolare i flavonoidi sono stati calibrati utilizzando la quercitrina come standard di riferimento. Anche in questo caso, come nel caso dell estratto di glicerolo al 100%, sono presenti composti flavonoidici. Confrontando i dati quantitativi degli estratti glicerici emerge una scarsa capacità estrattiva del solo glicerolo rispetto alle componenti flavonoidiche della matrice vegetale. Migliori risultati sono stati ottenuti miscelando a esso una parte di etanolo, solvente compatibile con le preparazioni cosmetiche sia con funzione di conservante che di enhancer di penetrazione dei principi attivi Estratti con alcool alimentare Gli estratti sono stati sottoposti ad analisi quali-quantitativa HPLC/DAD; l analisi quantitativa è stata condotta con l ausilio di curve di calibrazione specifiche (R 2 >0,9999), in particolare i flavonoidi e le crocine sono stati calibrati utilizzando la quercitrina e la curcumina, rispettivamente, come standard di riferimento. Dai dati ottenuti emerge una concentrazione non rilevante di safranale e un basso contenuto di picrocrocina in entrambi i campioni. Il liquore ottenuto attraverso la macerazione dei soli stigmi contiene anche un basso contenuto di flavonoidi rispetto a quello ricavato dalla macerazione del fiore di zafferano proprio per la presenza dei tepali che contengono elevate quantità di tali sostanze. Caratterizzazione del germoplasma tramite NMR Ulteriore obiettivo del lavoro è stato la definizione di un fingerprint, tramite analisi NMR, per la caratterizzazione del germoplasma dello zafferano. Alcuni dei segnali ottenuti dagli spettri dell analisi sono stati attribuiti a safranale, crocine o picrocrocina utilizzando sia standard di riferimento (in commercio sono disponibili solo quello di safranale, un pool di crocine e non esiste standard di picrocrocina) che assegnazioni pubblicate in letteratura (Straubinher et al. 48 t natural 1 gennaio - febbraio 2016

12 ,1997; Straubinger et al., 1998; Huu Tung e Shoyama, 2013). Ideazione di una scheda panel Il panel test è un metodo di analisi sensoriale effettuato da un gruppo di esperti che tramite assaggio dello zafferano ne valuta e certifica le caratteristiche organolettiche: sapore, colore, odore e aspetto. Per risultare il più riproducibile possibile, la prova di assaggio viene pianificata in base a una procedura standard, che prevede la preparazione del campione, l isolamento del giudice, l emissione di un giudizio in schede individuali e l elaborazione di queste ultime da parte di un capo panel. Attraverso il test viene valutata l assenza di difetti e la conformità al profilo aromatico, tramite un equipe allenata a identificare gli stimoli sensoriali sulla base di standard precedentemente memorizzati e a quantificarli su una scala suddivisa in 10 unità di punteggio. In questo lavoro è stato proposto un prototipo di scheda, partendo da quella formulata da Carmona e Alonso, nel quale sono state approfondite le procedure di standardizzazione per la preparazione del campione e i descrittori del flavour da inserire nella scheda stessa. Affiancando la scheda panel ad analisi chimiche di tipo quali-quantitativo è stato possibile correlare i diversi gradi di concentrazione di principi attivi con la percezione del loro flavour e capacità colorante. L ulteriore ottimizzazione di una scheda valutativa ha lo scopo di creare uno strumento tecnico per la caratterizzazione dello zafferano che corrisponda a esigenze normative e sia allo stesso tempo utile come strumento di marketing per testare il livello di gradimento del consumatore. Essa costituirà lo strumento tecnico di base, oltre che per il controllo del prodotto, anche per la potenziale formazione delle nuove figure professionali di giudici panel e capo panel esperti di zafferano. Conclusioni In questo lavoro sono stati caratterizzati stigmi, tepali e stami di zafferano di diverse provenienze italiane ed estere, allo scopo di individuare particolari descrittori idonei alla definizione della qualità chimica, organolettica e tecnologica. Dall analisi HPLC/DAD è emerso che gli zafferani di origine italiana contengono una elevata quantità di principi attivi, come garantito dal marchio DOP, e tutti si trovano in concentrazione quasi doppia rispetto a quelli iraniani, dei quali non è stato garantito nessun passaggio della produzione. A causa dell elevato contenuto di flavonoidi è stata data particolare rilevanza ai tepali, tessuti fino a oggi considerati di scarto, allo scopo di identificare nuove produzioni sia food che cosmetiche. La presenza di tali principi attivi attribuisce un valore aggiunto alle loro formulazioni e riduce l impatto ambientale causato dallo smaltimento dei tessuti secondari di lavorazione, oltre che costituire ulteriore fonte di rendita per gli agricoltori. Particolare attenzione è stata rivolta anche alla definizione di schede sensoriali, utili per l ideazione di un modello per consumer test atto a definire caratteristiche e descrittori percepibili dal normale consumatore, oltre che costituire le fondamenta per nuovi modelli di scheda, armonici con le richieste Normative, atte a formare e definire nuove figure professionali quali esperti panel e capo panel per lo zafferano. È in fase di perfezionamento il fingerprint dello zafferano, strumento attraverso il quale sarà possibile definire il germoplasma della spezia al fine di tutelare sia i produttori che i consumatori, affidando a questi ultimi uno strumento che li aiuti a fare chiarezza sul concetto di qualità. Nel caso di zafferani garantiti da marchio DOP o Associazione Italiana Zafferano, tale termine comprende i più ampi concetti di tutela e valorizzazione dell identità territoriale e attraverso progetti che prevedono la riduzione di scarti di lavorazione, il rispetto dell ambiente. È in fase di studio il potenziale utilizzo di tecnologie alternative, al fine di evidenziare la correlazione tra una determinata area geografica e la qualità dei prodotti che vi vengono coltivati, con lo scopo di promuovere l ideazione di un meta-marchio che valorizzi il territorio. Parallelamente agli studi sulla composizione, è in via di sperimentazione l utilizzo di estratti di zafferano nella cura della degenerazione maculare retinica correlata all età (AMD, Age-related Macular Degeneration), una delle principali patologie oculistiche che causa la perdita progressiva della visione centrale. Attualmente tali ricerche sono condotte utilizzando zafferano proveniente dalla città di L Aquila (considerato il migliore in Italia), ma scopo di questi studi e dell Associazione Italiana Zafferano è anche quello di promuovere tecnologie produttive e di essiccazione mirate alla creazione di un prodotto con composizione elevata e costante su tutto il territorio nazionale, in modo da poter estendere l utilizzo dello zafferano alle ricerche mediche innovative. * UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE Il presente articolo rielabora la tesi di laurea in Tecniche Erboristiche svolta dall Autrice presso la Scuola di Scienze della Salute Umana dell Università degli Studi di Firenze, relatore prof.ssa Annalisa Romani. La bibliografia completa dell articolo è disponibile sul sito gennaio - febbraio 2016 natural 1 t 49