METODOLOGIE ANALITICHE PER LA TUTELA DEI FORMAGGI A LATTE CRUDO OVINO.

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1 II Congresso Lattiero-Caseario Torino, 21 settembre 2010 METODOLOGIE ANALITICHE PER LA TUTELA DEI FORMAGGI A LATTE CRUDO OVINO. C. Piga, M. F. Scintu, G. Sanna, P. Piu, G. Piredda Agenzia regionale per la ricerca in agricoltura REGIONE AUTONOMA DELLA SARDEGNA Università degli Studi di Sassari Dipartimento di Chimica 1

2 La Caseificazione del Latte Crudo Rappresenta una forma di produzione molto antica, tipica soprattutto di quelle nazioni ove la tradizione lattiero-casearia ha raggiunto elevati vertici di esperienza ed affidabilità. Garantisce il mantenimento della flora casearia autoctona e di gran parte del corredo enzimatico nativo del latte Contribuisce allo sviluppo dei sapori e dei profumi tipici che assicurano ai prodotti un legame unico con il territorio che lo ha espresso 2

3 Il Latte Ovino in Sardegna Produzione annua di circa 340 mila tonnellate rappresenta* Il 57% della produzione Nazionale (560 mila tonn.)* Il 3,7% della produzione Mondiale (9.000 mila tonn.)* Viene interamente trasformato in prodotti lattiero-caseari. Il 70% di questa produzione è costituita da tre prodotti a Denominazione d Origine Protetta D.O.P. Pecorino Romano Pecorino Sardo Fiore Sardo * fonte dati Istat

4 Trattamento Termico Prodotto Fiore Sardo Tipo di Latte Crudo Pecorino Romano Pecorino Sardo Termizzato Crudo, Termizzato, Pastorizzato Pecorino Sardo Pecorino Romano Fiore Sardo Nasce con lo scopo di garantire la sicurezza alimentare attraverso il trattamento di bonifica termica D.P.R. 54/97 in materia di trattamenti termici individua degli indici che attestino l avvenuto trattamento di bonifica termica (pastorizzazione). NON individua indici per verificare che il trattamento termico non sia stato eseguito 4

5 Indici Analitici Prodotto Fiore Sardo Tipo di Latte Crudo Pecorino Romano Termizzato Pecorino Sardo Crudo, Termizzato, Pastorizzato ENZIMI ENDOGENI α-l-fucosidasi [inattivazione C] γ-glutamiltransferasi [inattivazione C ] Zehetner [1996], Blel [2002] ESIGENZA ANALITICA indici per verificare che il trattamento termico non sia stato eseguito 5

6 Indici Analitici Accertarne la presenza di entrambi gli enzimi nel latte ovino Mettere a punto delle metodiche analitiche per la loro determinazione nel latte e nel formaggio di origine ovina Validare le metodiche analitiche Verificarne il campo di inattivazione termica Studiarne la variabilità di attività enzimatica in rapporto ai parametri zootecnici ENZIMI ENDOGENI α-l-fucosidasi [inattivazione C] γ-glutamiltransferasi [inattivazione C ] 6

7 Determinazione Analitica α-l-fucosidasi [inattivazione C] γ-glutamiltransferasi [inattivazione C ] Andrews, A.T., Anderson, M., Goodenough, P.W., (1987). A study of the heat stabilities of a number of indigenous milk enzymes. Journal of Dairy Research, 54, Baumrucker, R.C., (1979). γ-glutamyl Transpeptidase of Bovine Milk Membranes: Distribution and Characterization. Journal of Dairy Science, 62,

8 Metodica Spettrofotometrica Il metodo spettrofotometrico utilizzato per la determinazione della γ- glutamiltransferasi nel latte vaccino 1) non è risultato applicabile al latte ovino Il processo di chiarificazione del latte, indispensabile per una corretta lettura spettrofotometrica, risultava essere incompleto Clarifying Reagent Matrice A (U.A.) 340 nm 400 nm Latte vaccino 2) 0,1400 0,0900 Latte ovino 0,4139 0,2529 Il bianco reagenti del latte ovino presentava un opalescenza residua nettamente superiore al latte vaccino, generando un errore sistematico nel metodo 1) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Studies on the thermal sensitivy of γ-glutamyltranspeptidase measured with a modified test procedure and compared with that of alkaline phosphatase and lactoperoxidase in milk. Lait, 82, ) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal 8 of Dairy Research, 73,

9 Metodica Spettrofotometrica Il metodo spettrofotometrico utilizzato per la determinazione della γ- glutamiltransferasi nel latte vaccino 1) non è risultato applicabile al latte ovino Il processo di chiarificazione del latte, indispensabile per una corretta lettura spettrofotometrica, risultava essere incompleto Clarifying Reagent Specie Solidi totali % Grasso % Proteine % Lattosio % Ceneri % Vacca 12,7 3,7 3,4 4,8 0,7 Pecora 19,3 7,4 4,5 4,8 1,0 Opalescenza del latte 1) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Studies on the thermal sensitivy of γ-glutamyltranspeptidase measured with a modified test procedure and compared with that of alkaline phosphatase and lactoperoxidase in milk. Lait, 82, ) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal 9 of Dairy Research, 73,

10 Chiarificazione del latte Ovino La scrematura del latte non ha avuto alcun effetto positivo sull opalescenza residua Aggiunta di un agente chelante (100 µl EDTANa 4 [0,2 M] ) capace di coordinare il Ca 2+ e destabilizzare le sub-micelle caseiniche Matrice A (U.A.) 340 nm 400 nm Latte vaccino 1) 0,1400 0,0900 Latte ovino 0,4139 0,2529 Latte ovino con EDTA 0,0015 0,0130 Clarifying Reagent Evidente riduzione dell assorbanza, indice di una perfetta chiarificazione Pone la tecnica da noi messa a punto su livelli di sensibilità ben superiori a quella messa a punto per il latte vaccino 1) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal of Dairy 10 Research, 73,

11 Chiarificazione del latte Ovino Abs a 410 nm Ovino Vaccino α-l-fucosidasi 1) 0,45 γ-glutamiltransferasi 2) 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0, ,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 [p-nitrofenolo] mm Tale accorgimento permette di ottenere delle rette di taratura perfettamente sovrapponibili Abs a 410 nm ovino vaccino 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, ,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 [p-nitroanilina] mm Latte Equazione della retta r 2 Vaccino y = (0,971 ± 0,027)x 0,004 ± 0,002 0,997 Ovino y = (0,953 ± 0,007)x 0,003 ± 0,001 0,999 Latte Equazione della retta r 2 Vaccino y = (2,713 ± 0,033)x 0,003 ± 0,002 0,999 Ovino y = (2,724 ± 0,024)x 0,003 ± 0,002 0,999 Test del t di Student t c p-nitroanilina t c p-nitrofenolo t t 0,05/2,4 Coefficienti angolari 0,584 1,333 Intercette 0,515 1,685 2,776 1 Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F., Sanna G., Analytical methods for the evaluation of α-l-fucosidase activity in sheep milk. Food Analytical Methods, 2010, 3, Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F. Sanna G, Assessment and validation of methods for the determination of γ-glutamyltransferase activity in sheep milk, 11 Food Chemistry, 2009, 115,

12 Metodica Cromatografica Determinazione dell α L-fucosidasi nel latte vaccino mediante tecnica RP-HPLC 1) maggiore sensibilità analitica maggiore stabilità della soluzione chiarificata (15 giorni a 4 C) maggiore semplicità operativa al protocollo 12 1) De Noni, I., (2006). Study on the variabilità of fucosidase activity in bovine milk by means of HPLC. International Dairy Journal, 16, 9-17

13 Metodica Cromatografica O - O N + O O CH 3 OH OH OH O - HO N + O α-l-fucosidasi 1) O Applicata con successo alla determinazione nel latte ovino HO O NH 2 O N H N + O - O N + O - H 2 N γ-glutamiltransferasi 2) 1 Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F., Sanna G., Analytical methods for the evaluation of α-l-fucosidase activity in sheep milk. Food Analytical Methods, 2010, 3, Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F. Sanna G, Assessment and validation of methods for the determination of γ-glutamyltransferase activity in sheep milk, 13 Food Chemistry, 2009, 115,

14 Guida EURACHEM Limite di rivelabilità mu ml -1 Limite di quantificazione mu ml -1 Range dinamico lineare Precisione ripetibilità (r) C.V.% (n=10) Validazione α-l-fucosidasi γ-glutamiltransferasi Confronto oggettivo delle performance analitiche di entrambe le metodiche UV-Vis RP-HPLC UV-Vis RP-HPLC 2,37 1,24 2,84 1,52 3,23 1) 1,5 2) 7,1 3) n.d. 7,11 3,72 8,52 4,56 9,69 1) 4,5 2) 21,3 3). n.d µm µm µm µm µm 1) 0,1 150 µm µm n.d. 4,3 4,5 3,5 2,9 6,0 1) 6,0 2) 3,0 3) n.d. OVINO VACCINO Accuratezza (bias) 1) McKellar, R.C., Piyasena, P., (2000). International Dairy Journal 10, ) De Noni, I., (2006). International Dairy Journal, 16, ) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Lait, 82,

15 Validazione Guida EURACHEM Limite di rivelabilità mu ml -1 Limite di quantificazione mu ml -1 Range dinamico lineare Precisione ripetibilità (r) C.V.% (n=10) Accuratezza (bias) U/mL (spettrofotometro) Confronto oggettivo delle performance confronto tra le metodiche analitiche analitiche di entrambe α-fuc le metodiche UV-Vis RP-HPLC UV-Vis RP-HPLC 2,37 1,24 2,84 1,52 3,23 1,5 7,1 n.d. 7,11 3,72 8,52 4,56 09,69 4,5. 21,3. n.d µm µm µm µm U/mL (spettrofotometro) confronto tra le metodiche analitiche γ-gtp????? 0,1 150 µm µm n.d. 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 R 2 = 0, U/mL (HPLC) 4,3 4,5 3,5 2,9 6,0 6,0 3,0 R n.d. 2 = 0,9787 0,03 0,02 0, ,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 U/mL (HPLC) y=(0,9531±0,065)x-(2,640±1,927) y=mx+q m=1 q=0 m) t sp = 0,7 q) t sp = 1,3 t c(0,05/2,9) = 2,262 y=(0,9281±0,052)x-(0,0031±0,0030) y=mx+q m=1 q=0 m) t sp = 1,43 q) t sp = 1,03 t c(0,05/2,9) = 2,262 15

16 Accertata la presenza di entrambi gli enzimi nel latte ovino Messe a punto delle metodiche analitiche per la loro determinazione nel latte Validate le metodiche analitiche Verificarne il campo di inattivazione termica Studiarne la variabilità di attività enzimatica in rapporto ai parametri zootecnici Determinarne l attività enzimatica nel formaggio 16

17 Inattivazione Termica C Pastorizzato Termizzato Crudo sec Lunghezza = 50 mm; Diametro interno = 5 mm; Volume = 1 ml I trattamenti termici sono stati eseguiti a 7 temperature comprese tra 40 e 80 C per nove intervalli di tempo compresi tra 0 e 1200 secondi, su campioni di latte intero proveniente da pecore di razza Sarda. Tipo di trattamento Temperatura/tempo Pastorizzazione 71,7 C/15 s Termizzazione C/15 s Crudo < 40 C D.P.R. 54/97 17

18 Inattivazione Termica α-l-fucosidasi range termico d inattivazione dell enzima è compreso tra i 57 ed i 70 C. a 57 C trattamenti di circa 300 secondi azzerano quasi l attività residua. Oltre i 68 C sono sufficienti solo tempi di qualche decina di secondi per inattivare completamente l enzima. γ-glutamiltransferasi rimanga pressoché stabile fino a 60 C per decrescere vistosamente passando a 75 e 80 C. a 70 C la sua attività viene dimezzata per trattamenti di 300 secondi a 75 C lo stesso grado di inattivazione è provocata da un trattamento di 35 secondi 18

19 Variabilità dell attività enzimatica PARAMETRI Stagionali Alimentari Campionamento condotto durante le 14 settimane di lattazione tra febbraio - maggio nelle 2 mungiture giornaliere Gregge Carico di pascolamento Alimentazione AB Alto Biologico BB Basso Biologico AC Alto Convenzionale Pecore di razza Sarda (n=36) dell azienda zootecnica di AGRIS Sardegna BC Basso Convenzionale 19

20 Variabilità dell attività enzimatica Risultati ottenuti in seguito all indagine hanno permesso di affermare che l attività enzimatica per entrambi gli enzimi: Non è influenzata: dal carico dal tipo di alimentazione Nel corso della lattazione è risultata: crescente per l α-l-fucosidasi sostanzialmente costante per la γ-glutamiltransferasi α-l-fucosidasi γ-glutamiltransferasi Media (U/ml) Min (U/ml) Max (U/ml)

21 Attività enzimatica nel formaggio La maggiore sensibilità dimostrata dalla metodica RP- HPLC ha permesso di determinare l attività enzimatica dell α-l-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi nel formaggio ovino α-l-fucosidasi γ-glutamiltransferasi Media (U/g ss ) Min (U/g ss ) Max (U/g ss )

22 Conclusioni E stata accertata e caratterizzata l attività enzimatica dell α-lfucosidasi e della γ-glutamiltransferasi nel latte ovino Sono state messe a punto e validate due metodiche analitiche indipendenti per la determinazione spettrofotometrica e RP- HPLC di entrambi gli enzimi nel latte ovino E stato verificato che il range di inattivazione termica dell α- L-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi coincide rispettivamente con il trattamento di termizzazione e pastorizzazione 22

23 Conclusioni L attività enzimatica non è risultata essere influenzata dall alimentazione e dal carico di pascolamento L α-l-fucosidasi presenta un attività enzimatica fortemente crescente durante la lattazione E stata determinata l attività enzimatica di entrambi gli enzimi nel formaggio ovino 23

24 GRAZIE PER L ATTENZIONE 24