Capitolo 21 La trasposizione

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1 Capitolo 21 La trasposizione Abbiamo appreso che il DNA di un organismo non resta invariato nel corso della vita dell organismo stesso. Nel Capitolo 18 abbiamo visto come il DNA possa subire dei danni ed essere riparato e come possa risultare mutato proprio in seguito al riparo. Nel Capitolo 20 abbiamo visto che il DNA può essere soggetto a fenomeni di ricombinazione per dare luogo a nuovi geni. Il DNA può, inoltre, essere soggetto a ricombinazione sito-specifica, per la quale è richiesta una omologia di sequenza molto meno elevata rispetto a quella necessaria per la ricombinazione omologa. Questo tipo di ricombinazione interessa, nella maggior parte dei casi, sequenze di DNA definite, da cui il termine sito-specifica. Un esempio lampante è rappresentato dall inserzione del DNA del fago λ all interno del DNA dell ospite, come accade in E. coli, e dalla successiva escissione del DNA fagico. Al contrario, la trasposizione richiede un minimo di omologia tra le due molecole di DNA che ricombinano e perciò non è sito-specifica. La trasposizione sarà l argomento di questo capitolo I trasposoni batterici Quando si verifica un evento di trasposizione, un elemento trasponibile, o trasposone, si sposta da una regione di DNA a un altra. Barbara Mc-Clintock fu la prima a scoprire i trasposoni negli anni 40 durante i suoi studi sulla genetica del mais. Da allora, i trasposoni sono stati trovati in tutti i tipi di organismi, dai batteri all uomo. Iniziamo a parlare dei trasposoni batterici. La scoperta dei trasposoni batterici James Shapiro e altri studiosi gettarono le fondamenta per la scoperta dei trasposoni batterici con la loro scoperta, nei tardi anni 60, di mutazioni fagiche che non si comportavano in maniera canonica. Per esempio, non revertivano immediatamente come invece fanno le mutazioni puntiformi, e i geni mutanti contenevano lunghi tratti di DNA extra. Shapiro dimostrò questo fenomeno avvalendosi del fatto che occasionalmente il fago λ, si appropria di un pezzo del DNA dell ospite durante l infezione litica delle cellule di E. coli, incorporando il DNA di passaggio nel proprio genoma. Shapiro fece in modo che le particelle di fagi λ si appropriassero sia di un gene di E. coli di tipo selvatico necessario per l utilizzazione del galattosio (gal + ) che della sua controparte mutante (gal ) e, successivamente, misurò le dimensioni delle molecole ricombinati di DNA

2 W2 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII che contenevano il DNA di λ assieme a quello dell ospite. Misurò le dimensioni delle molecole di DNA misurando le densità dei due tipi di fagi utilizzando la centrifugazione a gradiente di cloruro di cesio (Capitolo 18). Dal momento che il rivestimento del fago è costituito da proteine e possiede sempre lo stesso volume, e poiché il DNA è molto più denso di una proteina, maggiore è la quantità di DNA che il fago contiene maggiore sarà la sua densità. Il risultato fu che i fagi che contenevano il gene gal - avevano una densità maggiore di quelli che contenevano il gene gal + e quindi lo avevano mutato. Infatti, esperimenti successivi avevano rivelato la presenza di inserti di bp nel gene gal mutante che non erano stati ritrovati nel gene di tipo selvatico. Nei rari casi in cui questi mutanti avevano revertito, avevano anche perduto il DNA extra. Queste molecole extra di DNA che potevano inattivare un gene attraverso l inserzione proprio all interno del gene stesso, erano i primi trasposoni scoperti nei batteri e vengono chiamate sequenze di inserzione (IS). Le sequenze di inserzione: i più semplici trasposoni batterici Le sequenze di inserzione batteriche contengono solo gli elementi necessari per la trasposizione. Il primo di questi elementi è un gruppo di sequenze particolari localizzate all estremità del trasposone, una delle quali è la ripetizione invertita dell altra. Il secondo elemento è un gruppo di geni che codificano gli enzimi che catalizzano la trasposizione. Dal momento che le estremità di una sequenza di inserzione sono invertite, se una estremità della sequenza di inversione è 5 -ACCGTAG, l altra estremità sarà quella complementare invertita: CTACGGT-3. Le sequenze invertite qui riportate sono ipotetiche e servono a illustrare il punto centrale della questione. Le sequenze di inversione tipiche possiedono ripetizioni invertite anche più lunghe, da 15 a 25 coppie di basi. IS1, per esempio, possiede delle ripetizioni invertite lunghe 23 bp. Trasposoni più grandi possono avere delle ripetizioni invertite lunghe anche fino a centinaia di basi. Stanley Cohen ha fornito una dimostrazione grafica delle sequenze invertite poste alle estremità dei trasposoni con l esperimento illustrato in Figura Cominciò con un plasmide contenente un trasposone con la struttura mostrata nella parte alta a sinistra della Figura 21.1a. Il plasmide originale era legato alle estremità del trasposone, che erano ripetizioni invertite. Cohen pensò che se il trasposone realmente avesse avuto delle ripetizioni invertite alle proprie estremità, sarebbe stato possibile separare i due filamenti del plasmide ricombinante per ottenere che le ripetizioni invertite su un filamento si appaiassero con le complementari sull altro, formando una struttura a forcina con un gambo, come quella mostrata nella parte destra della Figura 21.1a. Il gambo è quello costituito dal DNA a doppio filamento composto dalle due ripetizioni invertite: le anse, invece, sono quelle costituite dal resto del DNA a singolo filamento. La foto al microscopio elettronico riportata in Figura 21.1b mostra l attesa struttura a forcina con il gambo. La parte principale di una sequenza di inserzione codifica almeno due proteine che catalizzano la trasposizione. Queste proteine sono note come trasposasi; discuteremo del loro meccanismo di azione più in là in questo capitolo. Sappiamo che queste proteine sono necessarie per la trasposizione perché alcune mutazioni all interno delle sequenze di inserzione rendono il trasposone incapace di spostarsi. Un altra caratteristica di una sequenza di inserzione, in comune con molti trasposoni più complessi, si trova appena fuori dal trasposone stesso. Si tratta

3 GGGTCTGCAGACCC GTCTGGGCCCAGAC Biologia molecolare 2/ed Capitolo 21 La trasposizione W3 (a) CCCAGAC GTCTGGG Ripetizioni terminali invertite CCCAGAC GGGTCTG Geni interni Elementi trasponibili Ripetizioni terminali invertite GTCTGGG CAGACCC Separazione dei filamenti GGGTCTG CAGACCC Appaiamento all'interno dello stesso filamento DNA plasmidico (b) Figura 21.1 I trasposoni contengono ripetizioni terminali invertite. (a) Rappresentazione schematica dell esperimento. I due filamenti separati di un plasmide contenente un trasposone sono fatti appaiare separatamente. Le ripetizioni terminali invertite formano un braccio a doppio filamento compreso tra due strutture ad ansa a singolo filamento, che corrispondono ai geni interni del trasposone (ansa piccola, in verde) e al plasmide ospite (ansa grande, in rosso e viola). (b) Risultati sperimentali. Il DNA è stato trattato con un metallo pesante e sottoposto a microscopia elettronica. Risulta evidente la struttura ad ansa-braccio-ansa. Il braccio è costituito da centinaia di coppie di basi, mostrando come le ripetizioni terminali invertite presenti in questo trasposone siano molto più lunghe di quanto mostrato nella parte (a) della figura. (Da: (b) Cortesia di Stanley N. Cohen, Stanford University.) di un paio di corte sequenze ripetute dirette, nella regione di DNA immediatamente circostante il trasposone. Queste ripetizioni non si osservano se non dopo che il trasposone si è inserito; risultano dal processo stesso di inserzione e suggeriscono che la trasposasi tagli il DNA in maniera sfalsata piuttosto che tramite due tagli uno di fronte all altro. La Figura 21.2 mostra come i tagli sfalsati sui due filamenti di DNA nel sito dell inserzione conducano automaticamente alla ripetizione diretta. La lunghezza di queste ripetizioni dirette dipende dalla distanza tra questi due tagli nei filamenti del DNA. Questa distanza dipende a sua volta dalla natura della sequenza di inserzione. La trasposasi di IS1 produce due tagli a una distanza pari a 9 bp l uno dall altro e quindi genera delle ripetizioni dirette lunghe 9 bp. SOMMARIO Le sequenze di inserzione sono l esempio più semplice di trasposoni batterici. Contengono solo gli elementi necessari alla loro trasposizione: corte ripetizioni invertite alle loro estremità e almeno due geni che codificano un enzima chiamato trasposasi responsabile della trasposizione. La trasposizione determina la duplicazione di una breve sequenza nel DNA bersaglio; una copia di questa breve sequenza fiancheggia la sequenza di inserzione da ciascun lato, dopo la trasposizione. I trasposoni più complessi Le sequenze di inserzione e i trasposoni sono a volte definiti DNA egoista volendo significare con questo termine che si replicano a spese del loro ospite, apparentemente non fornendo nulla in cambio. Tuttavia, alcuni trasposoni

4 W4 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII (a) CATAGCCTGAT GTATCGGACTA Taglio in corrispondenza delle frecce Plasmide accettore bersaglio (b) CATAGCCTGA G T TATCGGACTA (c) CATAGCCTGA G Inserzione del trasposone T TATCGGACTA (d) CATAGCCTGA G TATCGGACT Riempimento delle interruzioni ATAGCCTGA T TATCGGACT A Figura 21.2 Formazione di ripetizioni dirette in un DNA ospite fiancheggiante un trasposone. (a) Le frecce indicano le posizioni dove i due filamenti di DNA ospite verranno tagliati in modo sfalsato, a 9 coppie di basi di distanza. (b) Dopo il taglio. (c) Il trasposone (in giallo) è stato ligato con un filamento del DNA ospite su ciascun lato, lasciando due interruzioni di 9 coppie di basi ciascuna. (d) Dopo che le interruzioni sono state riempite, a ciascuna estremità del trasposone compaiono ripetizioni di 9 coppie di basi del DNA ospite (rettangoli rosa). portano geni preziosi per i loro ospiti, molti dei quali sono geni che conferiscono resistenza ad antibiotici. Questo non solo rappresenta un notevole beneficio per l ospite batterico, ma è un aiuto prezioso per i biologi molecolari, poiché rende il trasposone più facilmente rintracciabile. Per esempio, consideriamo la situazione rappresentata in Figura 21.3, in cui si parte da un plasmide donatore che contiene un gene per la resistenza alla kanamicina (Kan r ) e che porta un trasposone (Tn3) con un gene per la resistenza alla ampicillina (Amp r ); inoltre, abbiamo un plasmide bersaglio con un gene per la resistenza alla tetraciclina (Tet r ). Dopo la trasposizione, Tn3 Figura 21.3 Determinazione dell avvenuta trasposizione tramite l uso di geni per la resistenza agli antibiotici. Si comincia con due plasmidi: il più grande (in blu) conferisce la resistenza alla kanamicina (Kan r ) e contiene il trasposone Tn3 (in giallo), che conferisce la resistenza all ampicillina (Amp r ); il plasmide più piccolo (in verde) conferisce la resistenza alla tetraciclina (Tet r ). Dopo la trasposizione, il plasmide piccolo contiene entrambi i geni Tet r e Amp r. Amp r Tn3 Amp r Kan r Kan r Tet r Trasposizione Amp r Tet r

5 Capitolo 21 La trasposizione W5 si è replicato e una copia si è spostata nel plasmide bersaglio. Così, questo plasmide è in grado di conferire entrambe le resistenze, alla tetraciclina e alla ampicillina, proprietà che si possono facilmente rilevare trasformando batteri sensibili a questi antibiotici con il plasmide bersaglio e crescendo questi batteri in un mezzo contenente entrambi gli antibiotici. Se i batteri sopravvivono devono aver necessariamente acquisito i geni per la resistenza agli antibiotici; perciò Tn3 deve necessariamente aver migrato nel plasmide bersaglio. Meccanismi di trasposizione Grazie alla loro capacità di spostarsi da un posto a un altro, i trasposoni vengono spesso definiti geni che saltano. Tuttavia questo è un termine ambiguo, perché comporta il fatto che il DNA si sposti sempre da un posto per finire in un altro. Questo meccanismo di trasposizione si chiama trasposizione non replicativa in quanto entrambi i filamenti del DNA originale si spostano insieme da una regione all altra senza replicarsi. Tuttavia, di frequente la trasposizione coinvolge la replicazione del DNA, cosicché una copia del trasposone rimane nel suo sito originario mentre l altra si inserisce in un nuovo locus. Questa è la trasposizione replicativa in quanto il trasposone che si sposta da una regione a un altra replica anche sé stesso. Vediamo più in dettaglio in che modo si verificano i due tipi di trasposizione. Trasposizione replicativa di Tn3 Tn3, la cui struttura è mostrata in Figura 21.4, ci dà modo di illustrare uno dei meccanismi meglio conosciuti di trasposizione. Oltre al gene bla, che codifica una b-lattamasi che inattiva l ampicillina, Tn3 contiene due geni che sono fondamentali per la trasposizione. La trasposizione di Tn3 avviene in due passaggi, ognuno dei quali richiede uno dei prodotti del gene Tn3. La Figura 21.5 mostra una versione semplificata della sequenza degli eventi. Si comincia con due plasmidi; il donatore, che porta Tn3, e il bersaglio. Nel primo dei due passaggi i due plasmidi si fondono, in seguito alla replicazione di Tn3, a dare un plasmide cointegrato in cui essi risultano accoppiati mediante le due copie di Tn3. Questo passaggio richiede la ricombinazione tra i due plasmidi, che è catalizzata da una trasposasi, prodotto del gene tnpa di Tn3. La Figura 21.6 mostra una rappresentazione dettagliata di come tutti e quattro i filamenti di DNA coinvolti nella trasposizione interagiscano per formare il cointegrato. Le figure 21.5 e 21.6 illustrano la trasposizione tra i due plasmidi, ma il DNA donatore e il bersaglio possono essere anche DNA di tipo diverso, inclusi i DNA fagici o il cromosoma batterico stesso. Bersaglio (o accettore) Trasposone Fusione tnpa Risoluzione tnpr Cointegrato IR tnpa tnpr bla Figura 21.4 Struttura di Tn3. I geni tnpa e tnpr sono necessari per la trasposizione; res è il sito dove avviene la ricombinazione durante la fase di risoluzione della trasposizione; il gene bla codifica la b-lattamasi, che protegge i batteri dall antibiotico ampicillina. Questo gene viene anche chiamato Amp r. Ripetizioni invertite (IR) sono presenti a ciascuna estremità. Le frecce indicano la direzione di trascrizione di ciascun gene. res IR Figura 21.5 Schema semplificato in due passaggi della trasposizione di Tn3. Nel primo passaggio, catalizzato dal prodotto del gene tnpa, il plasmide (in nero) contenente il trasposone (in blu) si unisce al plasmide bersaglio (in verde, bersaglio in rosso) per formare un cointegrato. Durante la formazione del cointegrato, il trasposone si replica. Durante il secondo passaggio, catalizzato dal prodotto del gene tnpr, il cointegrato si risolve formando il plasmide bersaglio, in cui è inserito il trasposone, e il plasmide originario contenente il trasposone.

6 W6 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII Figura 21.6 Schema dettagliato della trasposizione di Tn3. Passaggio 1: I due plasmidi vengono tagliati per formare le estremità libere marcate a-h. Passaggio 2: Si uniscono le estremità a & f, così come le estremità g & d. Vengono lasciate libere le estremità b, c, e & h. Passaggio 3: Due delle estremità libere (b & c) servono da innesco per la replicazione del DNA, mostrata nel dettaglio della regione di replicazione. Passaggio 4: La replicazione continua fino a quando l estremità b non raggiunge l estremità e, e l estremità c non raggiunge l estremità h. Queste estremità vengono ligate per completare il cointegrato. Si noti come l intero trasposone (in blu) sia stato replicato. I siti res appaiati (in viola) sono mostrati qui per la prima volta, anche se un sito res esisteva già nei passaggi precedenti. Il cointegrato viene rappresentato con un ansa al suo interno per rendere più evidente la sua derivazione dalla rappresentazione precedente; tuttavia, se l ansa venisse aperta, il cointegrato assomiglierebbe a quello rappresentato in Figura Passaggi 5 e 6: un crossover ha luogo tra i due siti res nelle due copie del trasposone, generando due plasmidi indipendenti, ciascuno contenente una copia del trasposone. Questo precesso viene mostrato per le due forme del cointegrato, a sinistra e a destra. Trasposone (Passaggio 3) Replicazione del trasposone b e a f g d h c c d (Passaggio 4) Completamento della replicazione a b b e g d Target (Passaggio 1) Taglio del DNA a f e f g h (Passaggio 2) Unione delle estremità c h c e g d = a f h b (Passaggio 5) Ricombinazione tra i siti res (Passaggio 6) Il secondo passaggio della trasposizione di Tn3 è la risoluzione del cointegrato, nella quale il cointegrato si suddivide in due plasmidi indipendenti, ognuno dei quali porta una copia di Tn3. Questo passaggio, catalizzato dal prodotto del gene resolvasi tnpr, è una vera e propria ricombinazione tra i siti omologhi su Tn3 stesso, chiamati siti res. Numerose sono le evidenze che provano che la trasposizione di Tn3 è un processo che avviene in due fasi. In primo luogo, i mutanti nel gene tnpr non sono in grado di risolvere i cointegrati e perciò portano alla formazione di cointegrati come prodotto finale della trasposizione. Questo dimostra che il cointegrato è un intermedio della reazione di trasposizione. Poi, anche se il gene tnpr è difettoso, i cointegrati possono essere risolti qualora venga fornito un gene tnpr funzionale median-

7 Capitolo 21 La trasposizione W7 te un altra molecola di DNA, per esempio il cromosoma dell ospite o un altro plasmide. Trasposizione non replicativa Le figure 21.5 e 21.6 illustrano il meccanismo di trasposizione replicativa, ma la trasposizione non avviene sempre seguendo questa strada. Alcuni trasposoni (Tn10 per esempio) si spostano senza replicarsi, lasciando semplicemente il DNA donatore e comparendo su quello bersaglio. Come avviene questo processo? Potrebbe essere che la trasposizione non replicativa cominci nella stessa maniera di quella replicativa, con l incisione e la successiva saldatura dei filamenti del DNA donatore e di quello bersaglio, ma dopo accade qualcosa di diverso (Figura 21.7). Invece della replicazione del trasposone, compaiono nuove incisioni nel DNA donatore dall altro lato del trasposone. Questo rilascia il DNA donatore, ma lascia il trasposone ancora legato al DNA bersaglio. Le incisioni rimanenti nel DNA bersaglio possono essere riparate, a dare un DNA ricombinante con il trasposone integrato al suo interno. Il DNA donatore presenta una interruzione a doppio filamento e quindi può andare perso, oppure, come mostrato qui, può essere riparato. + Riparo delle interruzioni a doppio filamento Donatore DNA r inciso a singolo filamento in corrispondenza delle frecce Riempimento delle interruzioni e riparo delle incisioni SOMMARIO Molti trasposoni contengono geni a parte rispetto a quelli necessari per la trasposizione. Questi sono, solitamente, i geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, Tn3 contiene un gene che conferisce la resistenza all ampicillina. Tn3 e i suoi simili traspongono attraverso un processo che avviene in due fasi (trasposizione replicativa). Nel primo il trasposone si replica e il DNA donatore si fonde al DNA bersaglio, formando un cointegrato. Nel secondo passaggio, il cointegrato viene risolto in due molecole di DNA circolari, ognuna delle quali porta una copia del trasposone. Un meccanismo alternativo di trasposizione, non utilizzato da Tn3, è la trasposizione conservativa, nella quale non si osserva alcuna replicazione del trasposone. Figura 21.7 Trasposizione non replicativa. I primi due passaggi sono identici a quelli della trasposizione replicativa, e la struttura rappresentata in alto è identica a quella presente tra i passaggi 2 e 3 della Figura Tuttavia, successivamente avvengono nuovi tagli nelle posizioni indicate dalle frecce. In questo modo si libera il plasmide donatore privo del trasposone, che rimane associato al DNA bersaglio. Il riempimento delle interruzioni e la ligazione dei tagli a singolo filamento completano il plasmide bersaglio con il suo nuovo trasposone. Le estremità libere del plasmide donatore possono unirsi o meno. In ogni caso questo plasmide ha perso il suo trasposone Trasposoni eucariotici Sarebbe sorprendente se i procarioti fossero gli unici organismi contenenti elementi trasponibili, specialmente perché questi elementi presentano potenti capacità selettive. In primo luogo, molti trasposoni portano geni che recano vantaggio ai loro ospiti. Perciò i loro ospiti possono moltiplicarsi a spese di altri organismi competitori e possono moltiplicare i trasposoni assieme al resto del proprio DNA. In secondo luogo, anche se i trasposoni non fossero vantaggiosi per i loro ospiti, possono replicare sé stessi all interno dell ospite, in maniera egoista. Infatti, gli elementi trasponibili sono presenti anche negli eucarioti. In effetti, anzi, furono scoperti per la prima volta negli eucarioti. I primi esempi di elementi trasponibili: Ds e Ac del mais Barbara McClintock scoprì i primi elementi trasponibili durante uno studio sul mais nei tardi anni 40. Da tempo era noto che la variegazione nei colori,

8 W8 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII (a) (b) (c) Figura 21.8 Effetti delle mutazioni e delle reversioni sul colore del chicco di mais. (a) Un chicco di tipo selvatico possiede un locus C attivo che determina la sintesi del pigmento porpora. (b) Il locus C ha subito una mutazione, che impedisce la sintesi del pigmento porpora, e il risultato è un chicco incolore. (c) Le macchie corrispondono a gruppi di cellule in cui la mutazione del locus C è revertita, permettendo nuovamente la sintesi del pigmento. (Da: F.W. Goro, from Fedoroff, N., Transposable genetic elements in maize. Scientific American 86 (June 1984).) osservata nei chicchi del cosiddetto mais indiano, era dovuta a una mutazione instabile. In Figura 21.8a, per esempio, possiamo vedere un chicco colorato. Questo colore è dovuto a un fattore codificato nel locus C del mais. La Figura 21.8b mostra cosa succede quando il gene C è mutato; in questo caso non viene prodotto alcun pigmento color porpora e il chicco appare quasi completamente bianco. Il chicco provvisto di macchie in Figura 21.8c mostra i risultati dovuti alla reversione in alcune delle cellule del chicco. In tutti i punti in cui la mutazione ha revertito, la cellula revertante e la sua progenie saranno in grado di produrre il pigmento, dando come risultato una macchia scura sul chicco. È sorprendente che ci siano così tante macchie in questo chicco. Questo vuol dire che la mutazione è molto instabile: reverte con un tasso molto più alto di quello che ci si potrebbe aspettare per una mutazione ordinaria. In questo caso, McClintock scoprì che la mutazione originale risultava da una inserzione di un elemento trasponibile, chiamato Ds facendo riferimento a dissociazione all interno del gene C (Figura 21.9a e b). Un altro elemento trasponibile, Ac (da attivatore), è in grado di indurre la trasposizione di Ds fuori da C, causando la reversione (Figura 21.9c). In altre parole, Ds può trasporre, ma solo con l aiuto di Ac. Ac al contrario è un trasposone autonomo, potendo trasporre da solo e quindi inattivare altri geni senza l aiuto di altri elementi. Ora, qualche decina di anni dopo che McClintock li ha scoperti, grazie ai numerosi strumenti a disposizione dei biologi molecolari, siamo in grado di isolare e caratterizzare questi elementi genetici. Nina Fedoroff e collaboratori ottennero le strutture di Ac e di tre differenti forme di Ds. Ac ricorda i trasposoni batterici di cui abbiamo appena parlato (Figura 21.10). È lungo circa 4500 bp, contiene un gene per una trasposasi ed è fiancheggiato da brevi (a) Ds C (b) (c) Ds C Ds Ac Ds Mutante C Ac C Figura 21.9 Gli elementi trasponibili causano eventi di mutazione e reversione nel mais. (a) Un chicco di mais del tipo selvatico possiede un locus C attivo e continuo (in blu) che causa la sintesi del pigmento porpora. (b) Un elemento Ds (in rosso) si inserisce in C rendendolo inattivo e impedendo la sintesi del pigmento. Il chicco risulta quindi privo di colorazione. (c) Ac (in verde) e Ds sono entrambi presenti. Questo permette a Ds di trasporre all esterno di C in molte cellule, dando luogo a gruppi di cellule che sono in grado di produrre il pigmento. Questi gruppi di cellule pigmentate sono responsabili delle macchie porpora sul chicco. Ovviamente, la trasposizione di Ds all interno di C ha avuto luogo prima che Ds diventasse difettoso, oppure è stato aiutato da un elemento Ac.

9 Capitolo 21 La trasposizione W9 Ac Trasposasi Delezione Ds-a Delezione Ds-b Sostituzione del DNA mediante ripetizioni terminali invertite Ds-c Figura La struttura di Ac e Ds. Ac contiene il gene trasposasi (in porpora) e due ripetizioni terminali invertite imperfette (in blu), comprendenti le regioni ripetitive subterminali. Ds-a manca di un tratto di 194 bp del gene della trasposasi (linee tratteggiate); per il resto è praticamente identico ad Ac. Ds-b manca di un frammento ancora più grande di Ac. Ds-c non presenta alcuna somiglianza con Ac, fatta eccezione che per le ripetizioni terminali invertite e le regioni ripetitive subterminali. ripetizioni invertite imperfette e da regioni ripetitive sub-terminali che legano la trasposasi. Le diverse forme di Ds sono derivate da Ac per delezione. Ds-a è molto simile ad Ac, fatta eccezione per un tratto del gene per la trasposasi che è stato deleto. Questo spiega perché Ds sia incapace di trasporre da solo. Ds-b è molto più ridotto, contenendo solo un piccolo frammento del gene per la trasposasi, e Ds-c contiene solo le ripetizioni invertite e regioni sub-terminali ripetitive che legano la trasposasi in comune con Ac. Queste ripetizioni invertite sono quelle di cui Ds-c ha bisogno per essere il bersaglio della trasposizione diretta da Ac. È interessante notare che il primo gene di pisello descritto dallo stesso Mendel (R o r), che governa il fenotipo liscio o rugoso dei semi, sembra coinvolgere un elemento trasponibile. Oggi sappiamo che il locus R codifica un enzima (enzima che crea ramificazioni nell amido) che partecipa al metabolismo dell amido. Il fenotipo rugoso risulta dal malfunzionamento di questo gene; questa mutazione è, a sua volta, determinata da una inserzione di un tratto di DNA di 800 bp che sembra essere un membro della famiglia Ac/Ds. SOMMARIO La variegazione nel colore dei chicchi del mais è causata dalle reversioni multiple di una mutazione instabile nel locus C, che è responsabile del rivestimento colorato del chicco. La mutazione e la sua reversione risultano da un elemento Ds (dissociatore), che traspone nel gene C, determinandone la mutazione, e successivamente traspone all esterno nuovamente, causandone la reversione al tipo selvatico. Ds non è in grado di trasporre da solo; deve ricorrere all aiuto di un trasposone autonomo chiamato Ac (attivatore), che fornisce la trasposasi. Ds non è altro che un elemento Ac privato di un tratto più o meno grande della sua parte centrale. Tutto ciò di cui Ds ha bisogno per trasporre è un paio di ripetizioni terminali invertite che la trasposasi Ac è in grado di riconoscere. Gli elementi P Il fenomeno chiamato disgenesi dell ibrido illustra un altro ovvio caso di incremento di una mutazione causato da un trasposone eucariotico. Nella disgenesi dell ibrido, un ceppo di Drosophila coniugato con un altro produce una progenie ibrida per la quale il danno al cromosoma è talmente grande

10 W10 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII che è disgenica, ovvero sterile. La disgenesi dell ibrido richiede il contributo di entrambi i genitori; per esempio, nel sistema P-M il padre deve essere del ceppo P (contributo paterno) e la madre del ceppo M (contributo materno). L incrocio inverso, con un padre M e una madre P, produce una progenie normale, come gli accoppiamenti tra individui dello stesso ceppo (P x P o M x M). Che cosa ci induce a sospettare che un trasposone sia coinvolto in questo fenomeno? Prima di tutto, ogni cromosoma maschile P può determinare la disgenesi in un incrocio con una femmina M. Inoltre, i cromosomi maschili ricombinanti derivanti in parte da maschi P e femmine M, solitamente possono causare disgenesi, dimostrando che il tratto P è presente in siti multipli sui cromosomi. Una possibile spiegazione a questo comportamento è che il tratto P sia governato da un elemento trasponibile, e questo è il motivo per cui lo ritroviamo in un numero così grande di siti diversi. Il trasposone responsabile per il tratto P è chiamato elemento P e si riscontra solo nelle mosche di tipo selvatico, non in ceppi di laboratorio (a meno che un biologo molecolare non lo inserisca). Margaret Kidwell e colleghi studiarono gli elementi P che si inserivano nel locus white delle mosche disgeniche e trovarono che questi elementi erano molto simili in quanto a sequenza in coppie di basi, ma considerevolmente diversi in dimensioni (da 500 a 2900 bp). Inoltre, gli elementi P presentavano delle ripetizioni terminali dirette ed erano fiancheggiati da alcune brevi ripetizioni dirette di DNA dell ospite, entrambi caratteristiche peculiari proprie dei trasposoni. Infine, le mutazioni white revertivano a un tasso elevato in seguito alla perdita dell intero elemento P, di nuovo una proprietà caratteristica di un trasposone. Se gli elementi P si comportano come i trasposoni, perché dovrebbero trasporre e causare la disgenesi solo negli ibridi? La risposta è che l elemento P, inoltre, codifica un repressore della trasposizione, che si accumula nel citoplasma delle cellule germinali in via di sviluppo. Quindi, in un incrocio tra un maschio P o M e una femmina P, il citoplasma della femmina contiene il repressore, che si lega a tutti gli elementi P e ne impedisce la trasposizione. Invece, in un incrocio tra un maschio P e una femmina M, l embrione precoce non contiene repressore e non ne produce in un primo momento, perché l elemento P diviene attivo solo nelle cellule germinali in via di sviluppo. Quando l elemento P viene finalmente attivato, vengono sintetizzati sia la trasposasi sia il repressore, ma solo la trasposasi si sposta nel nucleo, dove liberamente stimola la trasposizione. La disgenesi dell ibrido può avere delle conseguenze importanti per la speciazione la formazione di nuove specie che non possono incrociarsi. Due ceppi della stessa specie (come P ed M) che frequentemente producono una progenie sterile, tenderanno a diventare geneticamente isolate i loro geni non si mescoleranno più così spesso e infine saranno così diverse che non saranno più in grado di incrociarsi affatto. Quando questo accade, le due specie si sono separate. Gli elementi P vengono oggi comunemente utilizzati come mutageni negli esperimenti con Drosophila. Uno dei vantaggi di questo approccio è che le mutazioni sono molto facili da localizzare; è sufficiente cercare l elemento P per capire quale sia il gene interrotto. I biologi molecolari utilizzano l elemento P anche per trasformare le mosche cioè per introdurre, all interno delle mosche, geni manipolati.

11 Capitolo 21 La trasposizione W11 SOMMARIO Il sistema P-M della disgenesi dell ibrido in Drosophila è causato dalla congiunzione di due fattori: (1) un elemento trasponibile (P) fornito dalla femmina, e (2) il citoplasma M fornito dal maschio, che favorisce la trasposizione dell elemento P. La progenie ibrida di maschi P e femmine M, quindi, è caratterizzata da eventi multipli di trasposizione dell elemento P. Questo determina mutazioni cromosomali dannose che rendono l ibrido sterile. Gli elementi P hanno anche un valore pratico come agenti mutageni e trasformanti, in esperimenti genetici con Drosophila Riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline I fenomeni di riarrangiamento dei geni di mammifero nelle cellule B che producono anticorpi, o immunoglobuline, e nelle cellule T che producono i recettori delle cellule T, avvengono tramite un processo che somiglia moltissimo alla trasposizione. Anche le ricombinasi coinvolte nei due processi presentano strutture simili. Come accennato nel Capitolo 3, un anticorpo è composto di quattro polipeptidi: due catene pesanti e due catene leggere (allo stesso modo, i recettori T contengono due catene β pesanti e due catene a leggere). La Figura illustra schematicamente un anticorpo e mostra i siti che si combinano con un antigene invasore. Questi siti, chiamati regioni variabili, variano da un anticorpo all altro e conferiscono a queste proteine la loro specificità; il resto della proteina (la regione invariante), non cambia da un anticorpo a un altro all interno di una stessa classe di anticorpi, mentre alcune variazioni possono essere osservate tra classi diverse di anticorpi. Ogni data cellula immunitaria è in grado di produrre anticorpi con un solo tipo di specificità. Sorprendentemente, gli esseri umani possiedono cellule immunitarie capaci di produrre anticorpi in grado di reagire virtualmente contro ogni sostanza con cui dovessero venire a contatto. Questo significa che possiamo produrre milioni di anticorpi differenti. Questo comporta anche l esistenza di altrettanti milioni di geni per gli anticorpi? Questa è una ipotesi insostenibile; sarebbe un fardello troppo grande per il nostro genoma portare tutti i geni necessari. Quindi, in che modo risolvere il problema della diversità degli anticorpi? Sebbene possa sembrare inverosimile, una cellula B matura, il cui compito è produrre un anticorpo, riarrangia il proprio genoma in modo da avvicinare parti separate dei geni di un suo anticorpo. Il macchinario che mette insieme il gene sceglie queste parti in maniera casuale da gruppi eterogenei di queste componenti, proprio come quando si ordina da un menù cinese ( scegliendo una pietanza dalla colonna A e una da quella B ). Questo riarrangiamento incrementa enormemente la variabilità dei geni. Per esempio, se esistono 41 possibilità nella colonna A e 5 nella colonna B, il numero totale delle combinazioni di A + B è 41 5, ovvero 205. Quindi, da 46 frammenti di un solo gene possiamo assemblare 200 geni. E questo vale solo per uno dei polipeptidi dell anticorpo. Se esiste una situazione simile per gli altri, il numero totale di anticorpi sarà il prodotto dei numeri dei due polipeptidi. Questa descrizione, corretta in linea di principio, in realtà non è altro che una semplificazione della situazione nei geni degli Siti di legame per l'antigene S S SS S S Figura La struttura di un anticorpo. L anticorpo è composto da due catene leggere (in blu) legate tramite ponti disolfuro a due catene pesanti (in rosso), che sono legate l una all altra attraverso un ponte disolfuro. I siti di legame per l anticorpo sono localizzati nella regione amminoterminale delle catene proteiche, dove si trova la regione variabile.

12 W12 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII anticorpi; come vedremo, essi sono caratterizzati da meccanismi più complessi preposti a introdurre la loro diversità, che conducono a un numero ancora più grande di possibili anticorpi prodotti. Studi condotti su anticorpi di mammifero hanno rivelato che esistono due famiglie di catene leggere negli anticorpi, chiamate kappa (κ) e lambda (λ). La Figura illustra l arrangiamento delle parti che compongono il gene che codifica una catena leggera umana della famiglia k. La colonna A di questo menù cinese contiene 41 parti delle regioni variabili (V); la colonna B contiene 5 parti di regioni di connessione (J). In realtà, i frammenti J codificano gli ultimi 12 amminoacidi della regione variabile, ma sono localizzati lontano dal resto della regione V e nelle immediate vicinanze di una sola regione costante. Questa è la situazione che si riscontra nelle cellule germinali, prima che le cellule preposte alla produzione degli anticorpi comincino a differenziare e prima che i processi di riorganizzazione avvicinino le due regioni. Gli eventi di riarrangiamento e di espressione sono rappresentati in Figura In primo luogo un evento di ricombinazione avvicina una delle regioni V a una delle regioni J. In questo caso V 3 e J 2 si fondono, ma lo stesso sarebbe potuto succedere a V 1 e J 4 ; la scelta è casuale. Dopo che le due parti del gene si sono assemblate, avviene la trascrizione, che parte dall inizio di V 3 e continua fino alla fine di C. Successivamente, il macchinario di splicing unisce la regione J 2 del trascritto a C, eliminando le regioni J inutili e la sequenza tra le regioni J e C. È importante ricordare che il passaggio di riarrangiamento si verifica a livello del DNA, ma questo passaggio di splicing avviene a livello dell RNA, attraverso il meccanismo che abbiamo studiato nel Capitolo 12. L RNA messaggero così assemblato si sposta nel citoplasma per essere tradotto (a) Regioni codificanti della catena leggera κ DNA di una linea germinale (b) Riarrangiamento 40 V J 1 J 3 J 5 5 J C V 1 V 2 V 3 V 4 J 2 J 4 C Ricombinazione DNA di cellule B V 2 V 3 RNA trascritto V 3 RNA messaggero J 2 J 3 J 4 J 5 J 2 J 3 J 4 J 5 V 3 C C RNA splicing J 2 C Traduzione Trascrizione Proteina V C Figura Riarrangiamento del gene di una catena leggera di un anticorpo. (a) La catena leggera κ di un anticorpo umano è codificata in 41 segmenti genici variabili (V; in verde chiaro), cinque segmenti di giunzione (J; in rosso) e un segmento costante (C; in blu). (b) Durante la maturazione di una cellula preposta a produrre un anticorpo, un segmento di DNA viene deleto, portando all unione di un segmento V (V 3 in questo caso) con un segmento J (J 2 in questo caso). Il gene, ora, può essere trascritto per produrre un mrna precursore, mostrato qui nella figura, con dei segmenti J aggiuntivi e delle sequenze intermedie. Il materiale compreso tra J 2 e C subisce un processo di splicing, fornendo così un mrna maturo che viene tradotto nella proteina anticorpale mostrata in basso. Il segmento J dell mrna viene tradotto nella parte variabile dell anticorpo.

13 Capitolo 21 La trasposizione W13 nella catena leggera dell anticorpo con una regione variabile (codificata sia da V che da J) e una regione costante (codificata da C). Per quale motivo la trascrizione comincia all inizio di V 3 e non a monte? La risposta sembra essere che esiste un elemento enhancer all interno dell introne, tra le regioni J e C, che attiva il promotore a lui più vicino: il promotore V 3 in questo caso. Questo è anche un modo conveniente per attivare il gene dopo il suo riarrangiamento; solo allora l elemento enhancer è abbastanza vicino al promotore per accenderlo. Il riarrangiamento della catena pesante, invece, è ancora più complesso perché c è un ulteriore serie di porzioni del gene tra le regioni V e J. Questi frammenti del gene sono chiamati D, per diversità, e rappresentano la terza colonna del nostro menù cinese. La Figura mostra che la catena pesante viene assemblata a partire da 48 regioni V, 23 regioni D e 6 regioni J. Solo su queste basi, potremmo ottenere , ovvero 6624 geni diversi per le catene pesanti. Inoltre, 6624 catene pesanti, combinate con 205 catene leggere κ e 170 catene leggere λ, forniscono più di 2,5 milioni di anticorpi differenti o, più precisamente, 2,5 milioni di differenti combinazioni di regioni variabili. Ma esistono molte altre cause di diversità. La prima deriva dal fatto che il meccanismo che unisce i segmenti V, D e J, che noi chiamiamo riunione V(D)J, non è un meccanismo preciso. Può aggiungere o eliminare basi nell altra estremità della giunzione. Questo comporta differenze ulteriori nelle sequenze amminoacidiche degli anticorpi. Un altra fonte di differenza tra gli anticorpi è la ipermutazione somatica, ovvero una rapida mutazione delle cellule somatiche (non sessuali) di un organismo. In questo caso le mutazioni si verificano nei geni degli anticorpi, probabilmente nel momento in cui un clone di cellula preposta alla produzione degli anticorpi prolifera e viene a contatto con un intruso. L analisi genetica e biochimica ha mostrato che l ipermutazione somatica avviene in due passaggi. Primo, una citidina deamminasi indotta durante l attivazione delle cellule B deammina le citosine a uracili durante la replicazione del DNA. Successivamente, gli uracili o innescano il meccanismo di riparo da appaiamento errato, che può introdurre mutazioni, oppure richiamano l uracil-n-glicosilasi, che rimuove gli uracili, lasciando siti abasici. I siti abasici sono poi riparati mediante sintesi trans-lesionale (Capitolo 18), che utilizza le DNA polimerasi ζ, η, θ e, probabilmente ι. Queste polimerasi sono soggette a errori, soprattutto in presenza di siti abasici; pertanto si generano molte mutazioni. Nel complesso, le ricongiunzioni imprecise di segmenti genici e le ipermutazioni somatiche amplificano enormemente il numero di possibili anticorpi. Infatti è stato calcolato che il numero totale di anticorpi che si possono produrre durante la vita supera i 100 miliardi. Questo numero è abbastanza grande per far fronte a ogni tipo di minaccia. Regioni codificanti della catena pesante 65 V 27 D 6 J C Figura Struttura delle regioni codificanti una catena pesante di un anticorpo. La catena pesante umana è codificata in 48 segmenti variabili (V; in verde chiaro), 23 segmenti per la diversità (D; in porpora), 6 segmenti di giunzione (J; in rosso) e 1 segmento costante (C; in blu).

14 W14 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII SOMMARIO Il sistema immunitario dei vertebrati è in grado di produrre miliardi di differenti anticorpi per reagire contro qualunque sostanza esterna. Esso genera una tale quantità di anticorpi diversi attraverso tre meccanismi diversi: (1) l assemblaggio di geni per catene leggere e catene pesanti a partire da due o tre componenti, rispettivamente, ognuna delle quali viene scelta da un insieme eterogeneo di componenti; (2) la giunzione delle parti del gene mediante un meccanismo impreciso che può portare alla delezione o all addizione di basi, cambiando quindi il gene; e (3) la determinazione di un elevato tasso di mutazioni somatiche, probabilmente durante la proliferazione di un clone di cellule immuni, crea così geni leggermente diversi gli uno dagli altri. Segnali di ricombinazione In che modo il macchinario di ricombinazione determina dove devono avvenire il taglio e la giunzione che avvicinano le diverse parti del gene di una immunoglobulina? Susumu Tonegawa ha esaminato le sequenze di molti geni di immunoglobuline di topo (codificanti le catene leggere κ e λ, e di quelle pesanti) e ha notato un modello costante (Figura 21.14a): adiacente a ciascuna regione codificante è localizzato un eptamero palindromico molto conservato, caratterizzato dalla sequenza consensus 5 -CACAGTG-3 Questo eptamero è accompagnato da un nonamero conservato, la cui sequenza consensus è 5 -ACAAAAACC-3. L eptamero e il nonamero sono separati da uno spaziatore non conservato contenente 12 bp (un segnale di 12 bp), o da 23 (±1) bp (un segnale di 23 bp). L organizzazione di queste sequenze-segnale di ricombinazione (RSSs, Figura 21.14b) è tale che la ricombinazione unisce sempre un segnale 12 a un segnale 23. La (a) CACAGTG ACAAAAACC GGTTTTTGT CACTGTG λ-chain V λ J λ κ-chain V κ J κ H-chain V H J H 9 7 D (b) V D J C Figura Segnali per la giunzione V(D)J. (a) Arrangiamento dei segnali intorno alle regioni codificanti dei geni per le catene leggere κ e λ e del gene per la catena pesante delle immunoglobuline. I tratti indicati con 7 e 9 sono, rispettivamente, gli eptameri e i nonameri conservati. Le loro sequenze consensus sono riportate nella parte alta della figura. Sono stati indicati anche gli spaziatori di 12 e 23 coppie di basi. Si noti che l arrangiamento dei segnali 12 e 23 è tale che la giunzione tra un tipo e l altro permette naturalmente l assemblaggio di un gene completo. (b) Illustrazione schematica del riarrangiamento dei segnali 12 e 23 in un gene di una catena pesante dell immunoglobulina. I triangoli gialli rappresentano i segnali 12, quelli arancione rappresentano i segnali 23. Notare nuovamente come la regola 12/23 garantisce l inclusione di una sola delle regioni codificanti (V, D e J) nel gene riarrangiato. (Da: (a) Tonegawa, S., Somatic generation of antibody diversity. Nature 302: 577, Copyright 1983 Macmillan Magazines Limited. Riproduzione autorizzata.)

15 Capitolo 21 La trasposizione W15 regola 12/23 afferma che i segnali 12 non sono mai uniti gli uni agli altri così come i segnali 23, e questo assicura che una e una soltanto di ciascuna regione codificante sia incorporata in un gene maturo di immunoglobulina. A parte l esistenza delle sequenze consensus RSS, quali prove esistono della loro importanza? Martin Gellert e colleghi hanno mutagenizzato in maniera sistematica l eptamero e il nonamero sostituendo alcune basi, e le regioni spaziatrici aggiungendone o sottraendone altre, e hanno osservato gli effetti di queste alterazioni sulla ricombinazione. Essi misurarono l efficienza di ricombinazione come segue: costruirono dapprima un plasmide ricombinante con il costrutto mostrato in Figura Il primo elemento in questo costrutto è un promotore lac. Questo è seguito da un segnale 12, quindi da un terminatore procariotico della trascrizione e da un segnale 23 e, infine, da un gene reporter cat. Successivamente generarono delle mutazioni lungo le sequenze RSS e introdussero il plasmide alterato in una linea cellulare pre-b. Infine, purificarono i plasmidi dalle cellule pre-b e li introdussero all interno di cellule di E. coli resistenti al cloramfenicolo. Successivamente saggiarono le cellule rispetto alla resistenza per il cloramfenicolo stesso. Se non avesse avuto luogo alcuna ricombinazione, allora il terminatore della trascrizione avrebbe impedito l espressione del gene cat e di conseguenza la resistenza al cloramfenicolo sarebbe stata inesistente. Al contrario, qualora la ricombinazione tra il segnale 12 e il 23 fosse avvenuta, il terminatore sarebbe risultato o invertito o deleto e quindi inattivato. In questo caso, l espressione di cat sarebbe avvenuta sotto il controllo del promotore lac e si sarebbe osservata la crescita di numerose colonie resistenti al cloramfenicolo. Questo esperimento ha mostrato che molte alterazioni nella sequenza di coppie di basi sia nell eptamero che nel nonamero causavano una riduzione nell efficienza di ricombinazione fino a un livello di fondo. La stessa cosa si osserva nel caso di delezioni o inserzioni di basi nelle regioni spaziatrici. Così, tutti questi elementi delle sequenze RSS risultano importanti per la ricombinazione V(D)J. SOMMARIO Le sequenze che fungono da segnali di ricombinazione (RSS) nella ricombinazione V(D)J consistono di un eptamero e di un nonamero separate da sequenze spaziatrici di 12 o 23 coppie di basi. La ricombinazione avviene solo tra due sequenze-segnale di tipo 12 o due sequenze-segnale di tipo 23 e questo garantisce che solo una delle due regioni codificanti venga incorporata nel gene riarrangiato. P lac GTCGAC CTGCAG Terminatore trascrizionale GGATCC CTCGGG cat H12 CACAGTG S12 CTACAGACTGGA N12 ACAAAAACC H23 CACAGTG S23 N23 GTAGTACTCCACTGTCTGGCTGT ACAAAAACC Figura Struttura del costrutto reporter utilizzato per misurare gli effetti delle mutazioni nelle sequenze RSS sulla efficienza di ricombinazione. Gellert e collaboratori costruirono un plasmide reporter contenente un promotore lac e un gene cat separati da un inserto contenente un elemento terminatore della trascrizione, fiancheggiato dai segnali 12 e 23. La ricombinazione tra le due sequenze RSS determina l inversione oppure la delezione del terminatore, favorendo l espressione del reporter cat. La trasformazione di cellule batteriche con il plasmide riarrangiato fornisce molte colonie in grado di produrre la proteina CAT, resistenti al cloramfenicolo. Al contrario, la trasformazione di cellule batteriche con il plasmide non riarrangiato non produce alcuna colonia resistente al cloramfenicolo. (Da: Hesse, J., M. R. Lieber, K. Mizuuchi e M. Gellert, V(D)J recombination: a functional definition of the joining signals. Genes and Development 3: , Copyright 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Riproduzione autorizzata.)

16 W16 Replicazione, ricombinazione e trasposizione del DNA Parte VII La ricombinasi David Baltimore e colleghi condussero una ricerca su quale potesse essere il gene (o i geni) che codificasse la ricombinasi V(D)J, utilizzando un plasmide reporter della ricombinazione simile a quello che abbiamo appena descritto, ma progettato per operare in cellule eucariotiche perché in grado di conferire loro la resistenza all acido micofenolico. Questi studiosi introdussero questo plasmide, assieme ad alcuni frammenti di DNA di topo, in cellule NIH 3T3, che mancano dell attività di ricombinazione V(D)J, e le saggiarono per l attività di ricombinazione ricercando tra esse quelle resistenti all acido micofenolico. Questo portò alla identificazione del gene attivatore della ricombinazione (RAG-1) che aveva stimolato l attività V(D)J in vivo. Tuttavia, il grado di stimolazione a opera di un clone genomico contenente RAG-1 era modesto, non più di quanto si otteneva con l intero DNA genomico. Inoltre, cloni di cdna contenenti l intera sequenza di RAG-1 non erano in grado di produrre risultati migliori, perciò qualcosa non era ancora del tutto chiaro. Il gruppo di Baltimore sequenziò l intero frammento genomico contenente RAG-1 e trovò un altro gene, completo, strettamente correlato a RAG-1. I ricercatori si domandarono se questo ulteriore gene potesse avere qualcosa a che fare con l attività V(D)J e quindi saggiarono questo frammento genomico assieme a un cdna di RAG-1 nello stesso esperimento di trasfezione. Quando introdussero nella stessa cellula entrambi i DNA, riscontrarono la presenza di un numero maggiore di cellule resistenti all acido micofenolico. In questo modo scoprirono che due geni sono responsabili della ricombinazione V(D)J e chiamarono il secondo RAG-2. RAG-1 e RAG-2 sono espressi solo in cellule pre-b e pre-t, nelle quali avviene la ricombinazione V(D)J dei segmenti dei geni dell immunoglobulina e del recettore delle cellule T, rispettivamente. I recettori delle cellule T sono proteine legate alla membrana che legano gli antigeni e presentano una architettura simile a quella mostrata dalle immunoglobuline. I geni che codificano i recettori delle cellule T subiscono lo stesso tipo di riarrangiamento riscontrato per i geni delle immunoglobuline, anche per quanto riguarda i segnali di tipo 12 e 23. Quindi, RAG-1 e RAG-2 sono apparentemente coinvolti sia nella ricombinazione delle immunoglobuline che in quella dei recettori delle cellule T. Il meccanismo della ricombinazione V(D)J La giunzione V(D)J è imprecisa e questo contribuisce alla diversità dei prodotti finali che scaturiscono da questo processo. La perdita di basi o la loro addizione ai siti di giunzione sono eventi che si osservano molto frequentemente. Questo è un vantaggio per la produzione delle immunoglobuline e dei recettori delle cellule T, perché si aggiunge alla varietà di proteine che possono essere prodotte a partire da un limitato repertorio di segmenti genici. In che modo possiamo spiegare questa imprecisione? La Figura illustra il meccanismo di taglio in corrispondenza delle regioni delle RSS fiancheggianti un segmento intermedio compreso tra i due segmenti codificanti. I prodotti dei geni RAG-1 e RAG-2, Rag-1 e Rag-2, rispettivamente, inizialmente introducono una incisione sul DNA ai siti di giunzione. Successivamente i nuovi gruppi ossidrilici posti alle estremità 3 attaccano i legami fosfodiesterici sui due filamenti complementari, liberando il segmento intermedio e formando strutture a forcina alle estremità dei segmenti codificanti. Queste strutture a forcina sono la chiave dell imprecisione del meccanismo di giunzione; possono aprirsi dall altra parte dell apice dell ansa e permettere l addizione o la sottrazione di basi in modo da rendere le estremità del DNA piatte per la giunzione. Le proteine Rag-