Simonetta Gallerini Responsabile di Laboratorio
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- Gloria Sasso
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1 Simonetta Gallerini Responsabile di Laboratorio Seminari ALA L Accreditamento: significato per i Laboratori ed applicazione nei controlli degli alimenti ARPAM, Pesaro 20 Novembre 2013
2 La struttura della Biochemie Lab si articola in quattro diversi settori: CHIMICO (environment, food e non food) MICROBIOLOGICO (analisi microbiologiche di base e di ricerca nel settore alimentare, agro zootecnico, ecologico ambientale, cosmetico, food packaging, igiene industriale, ristorazione collettiva) ECOTOSSICOLOGICO BIOLOGIA MOLECOLARE (OGM) Al fine di assicurare la qualità del dato Biochemie Lab partecipa costantemente a circuiti interlaboratorio nazionali e internazionali (UNICHIM, QM UK, FAPAS, FEPAS, LG Standard) e confronti interlaboratorio gestiti da vari Dip.ti ARPA.
3 Biochemie Lab è un impresa giovane e dinamica, che ha sempre prestato attenzione al miglioramento del servizio, a favore della qualità e della tecnologia. In particolare: per quanto riguarda la qualità, questa scelta ha segnato tutto il percorso di sviluppo della Biochemie Lab, che fin dal principio ha ottenuto la certificazione UNI CEI EN 45001, successivamente aggiornata in UNI CEI EN ISO IEC rilasciata prima da SINAL e oggi mantenuta con ACCREDIA con 422 prove accreditate. L ulteriore conseguimento delle certificazioni ISO 9001 (CERTIQUALITY) su tutti gli ambiti di attività e ISO (DNV), completano il percorso; per quanto riguarda la tecnologia, Biochemie Lab ha sempre investito in strumenti di ultima generazione ed in processi innovativi grazie ai quali si sono potute sviluppare sia la qualità sia l attuale potenzialità produttiva.
4 Di recente, Biochemie Lab si è dotata di un Laboratorio Mobile equipaggiato con strumentazione avanzata, che lo rende in grado di operare autonomamente in molti settori. Ciò significa spostarsi velocemente con tutto l occorrente su tutto il territorio nazionale, eseguire le prove on site nel momento in cui servono. Questo tipo di servizio permette di avere risultati analitici immediati e poter quindi decidere immediatamente che tipo di azioni di risanamento effettuare con un notevole risparmio economico e di tempo per i clienti.
5 Certificazioni, autorizzazioni e riconoscimenti ACCREDITAMENTO ACCREDIA, con il numero 0195 come laboratorio operante in conformità alla Norma UNI CEI EN ISO IEC 17025:2005. CERTIFICAZIONE UNI EN ISO 9001/2008 Servizi di analisi chimiche, fisiche, microbiologiche, biomolecolari, ecotossicologiche, di ricerca, di campionamento, di consulenza tecnica e di formazione, certificata da CERTIQUALITY. CERTIFICAZIONE UNI EN ISO 14001/2004 Erogazione di servizi di analisi chimiche, fisiche, microbiologiche, biomolecolari, ecotossicologiche, di ricerca e di assistenza tecnica, di campionamento, di consulenza e di formazione, certificata da DNV. ISCRIZIONE in via definitiva nell elenco della Regione Toscana dei laboratori che effettuano analisi nell ambito delle procedure di autocontrollo delle industrie alimentari (n. di iscrizione 010). Autorizzazione del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali, Dipartimento della Qualità dei Prodotti Agroalimentari e dei Servizi, ad eseguire per l intero territorio nazionale analisi ufficiali nel settore oleico, ai sensi della regolazione nazionale e comunitaria in materia (Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 02/02/2004 Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 09/05/2007 Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 21/01/2011). RICONOSCIMENTO del COI (Consiglio Oleicolo Internazionale). QUALIFICA del Ministero della Salute nell elenco dei laboratori relativo ai programmi di qualificazione per l analisi sull amianto (MOCF, FT IR). ABILITAZIONE della Regione Toscana alle analisi previste dagli allegati al D.Lgs 99/1992 utilizzo dei fanghi di depurazione in agricoltura. ISCRIZIONE del Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali nell elenco nazionale dei laboratori competenti a prestare i servizi necessari a verificare la conformità dei prodotti in materia di fertilizzanti INTERCALIBRAZIONI con ARPA (Lombardia, Liguria, Toscana, Campania, Sardegna, Sicilia).
6 Metodo interno MP 015: Determinazione del contenuto di istamina nel pesce fresco e conservato, nei prodotti di gastronomia a base di pesce, nei prodotti ittici mediante HPLC Riferimenti bibliografici: UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura Documento ACCREDIA RT 08 Prescrizioni per l'accreditamento dei laboratori di prova Documento ACCREDIA DT 0002 Guida per la valutazione e l espressione dell incertezza nelle misurazioni ARPA Emilia Romagna 2002, Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell incertezza di misura Manuali UNICHIM 179/0, 179/1, 179/2, 179/3 Linee guida per la convalida dei metodi analitici Manuale Unichim 177/14 Ed.1995 Linee guida per la taratura della strumentazione analitica cromatografi in fase liquida Reg UE n.1019/2013 della Commissione del 23/10/2013 che modifica l allegato I del Regolamento (CE) n. 2073/2005 relativo all istamina nei prodotti della pesca IZS Regioni Lazio e Toscana, Validation and comparison of analytical methods for the determination of histamine in tuna fish samples, Journal of Chromatography A, 1032 (2004), 79 85
7 Valutazione e scelta del metodo da accreditare La prima operazione che il laboratorio deve compiere per corrispondere alle esigenze del cliente ed individuare un metodo appropriato per la prova da eseguire consiste nel verificare i seguenti passaggi: Aggiornamento Legislativo Richiesta del cliente Scelta del metodo Metodi Normalizzati Metodo interno 1) Metodi ufficiali pubblicati in GU 2) Metodi internazionali NO SI 1) Metodi pubblicati su riviste scientifiche 2) Metodi progettati e sviluppati dal laboratorio Verifica parametri di qualità del metodo, verifica adeguatezza ai limiti di legge, verifica esigenze del cliente Convalida metodo interno Metodo conforme
8 Ulteriori requisiti valutati nello studio di fattibilità di un metodo analitico: Ottimizzazione dei tempi analitici Strumentazione idonea Facilità di utilizzo e semplificazione dei passaggi analitici in modo da ottenere in tempi brevi risultati analitici affidabili Assenza di requisiti ambientali Riduzione dei volumi di rifiuti prodotti Grado di precisione ed accuratezza adeguati Riduzione del rischio legato alla sicurezza degli operatori
9 PIANO DI VALIDAZIONE DEL METODO 1.Controlli di buon funzionamento dello strumento e verifica della linearità della retta di taratura del metodo 2.Determinazione della precisione e dell accuratezza del metodo e verifica del t test 3.Calcolo dell incertezza di misura da associare al dato analitico 4.Studio dell andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione 5.Partecipazione a circuiti interlaboratorio o acquisto di matrici certificate 6.Monitoraggio delle prestazioni del metodo mediante carte di controllo 7.Riesame annuale della validazione del metodo
10 Per la convalida di un metodo interno il laboratorio deve verificare le proprie prestazioni per i seguenti punti: 1.Limite di rilevabilità 2.Limite di quantificazione 3.Linearità 4.Accuratezza 5.Precisione 6.Ripetibilità 7.Specificità Inoltre, valuta la partecipazione a circuiti interlaboratorio (ad es. FAPAS) o l acquisto di matrici certificate da inserire periodicamente a sorpresa nella routine analitica per valutare il mantenimento dei requisiti prestazionali sia del metodo sia dell operatore.
11 1. Limite di rilevabilità e limite di quantificazione del metodo Per il limite di rilevabilità, è stata determinata in modo empirico una concentrazione soglia (cut off) al di sotto della quale la selettività diventa inapplicabile. Sono state replicate per 6 volte una serie di determinazioni a concentrazione su campione pari a 10 mg/kg, fortificando la matrice priva dell analita di interesse ed èstato valutato quante volte si èavuto esito positivo; ci siamo imposti una soglia di accettabilità di positivi/negativi pari a 80%. Il risultato costituisce il valore di soglia da considerarsi come limite di rilevabilità. Come limite di quantificazione, è stato adottato il punto più basso della retta di taratura, calcolando ovviamente la concentrazione che corrisponde nel campione.
12 2. Verifica della linearità della retta di taratura del metodo La linearità di un metodo analitico èla capacità dello stesso di produrre risultati che siano direttamente proporzionali alla concentrazione dell analita in un range determinato. La linearità viene determinata calcolando sia il coefficiente di correlazione (r 2 ) in una regressione lineare dei risultati ottenuti dall analisi di campioni contenenti differenti concentrazioni di analita sia lo scarto tipo dei residui della retta. La linearità è verificata mediante la costruzione del grafico dei residui della regressione riportando in ordinata i residui (y isper y icalc ) e in ascissa i valori teorici corrispondenti. Criteri di accettabilità: C è correlazione lineare se il grafico dei residui mostra una distribuzione casuale dei residui attorno all asse delle ascisse. Il coefficiente di correlazione (r 2 ) 0,990 Scarto tipo dei residui della retta 10%
13 3. Determinazione della precisione e dell accuratezza del metodo Per i criteri di accettabilità abbiamo fatto riferimento alla Tabella 2 della Decisione CE 657/2002 che attua la direttiva 96/23/CE, relativa al rendimento dei metodi analitici e all interpretazione dei risultati. Intervallo di concentrazione (μg/kg) Come criterio di accettabilità del CV% abbiamo fatto riferimento alla Tabella 3 della Decisione CE 657/2002 ed è stato considerato che doveva essere 16%. Intervallo raccomandato recupero < % % > % Intervallo di concentrazione (μg/kg) CV % raccomandato Per la determinazione della precisione e dell accuratezza del metodo è stata valutata la ripetibilità (6 prove) a 3 livelli: il primo livello a una concentrazione bassa del campo di misura del metodo (35 mg/kg) il secondo livello viene effettuato a una concentrazione intermedia del campo di misura (80 mg/kg) il terzo livello viene effettuato a una concentrazione vicino al limite di legge del parametro interessato (200 mg/kg)
14 4. Verifica del t test Per verificare se i risultati analitici devono essere corretti o no per il recupero è stato valutato il t test tramite la seguente formula: per n=6, il t p,ν assume il valore pari a 2.52 Se t sperim t p,ν, allora il risultato finale può non essere corretto per la percentuale di recupero, altrimenti il valore analitico dovrà essere corretto per il recupero. In questo caso i risultati del t test per tutti i livelli valutati sono conformi alla relazione sopra indicata, pertanto il laboratorio non corregge i risultati per il recupero.
15 5. Calcolo dell incertezza di misura da associare al dato analitico Per ogni grandezza di ingresso devono essere calcolate le sue incertezze di ingresso che possono essere divise in due categorie, denominate A e B, in relazione al modo in cui sono stimate: categoria A, se èstimata a partire da dati sperimentali ricavati dalla misurazione diretta di una o più grandezze di ingresso come parte del procedimento per ottenere i valori del misurando categoria B, se il suo valore èricavato da informazioni o dati esterni alla sperimentazione condotta per determinare i valori del misurando I contributi all incertezza estesa sono i seguenti: Incertezza relativa di ripetibilità Incertezza relativa di taratura, viene utilizzato il criterio di accettabilità definito per la verifica intermedia di taratura. In questo caso tale incertezza è intesa come incertezza rettangolare e pertanto va divisa per. Ad es. prima di ogni ciclo di analisi si verificano due punti della retta di taratura (il primo e il terzo): la concentrazione letta dallo strumento deve ricadere nell intervallo ±10% rispetto al valore ottenuto in sede di taratura precedente alla verifica. In questo caso l incertezza di taratura relativa sarà Incertezza relativa di taratura della bilancia Incertezza relativa di vari contributi (MR, matraccio, pipetta)
16 Parametro: Metodo: Matrice/Campione: Istamina Operatore: Andrea Drioli MP 015 Data: 21/09/2011 Pesce mg/kg Recupero (%) Recupero Prova 1 64,6 80,7 0,807 Prova 2 76,3 95,4 0,954 Prova 3 79,4 99,2 0,992 Prova 4 66,7 83,4 0,834 Prova 5 66,9 83,6 0,836 Prova 6 81,2 101,5 1,015 Dati Grafico Calcolo dell'incertezza della ripetibilità: Incertezza ripetibilità relativa 0,041 Valore medio (mg/kg) 72,5 Incertezza relativa recupero 0,041 Varianza 52,802 Incertezza taratura relativa 0,058 Scarto tipo 7,27 Incertezza relativa del MR 0,00E+00 Coeff. di variazione % 10,0 Incertezza tarat. relativa bilancia 1,330E-03 Unità di formato 0,001 Incertezza relativa vetreria 0,000 52,802 Incertezza relativa pipetta 0,000 8,800 Scarto tipo della media 2,967 Limite di ripetibilità (mg/kg) 26,4 Incertezza ripetibilità relativa Scarto tipo relativo 0,041 0,100 Contributi incertezza estesa relativa Scarto tipo relativo metodo normalizzato Incertezza relativa recupero: valore medio recupero (%) 91 varianza recupero 8,250E-03 scarto tipo recupero 0,091 0,037 Incertezza relativa recupero 0,041 Incertezza della taratura: 10 Incertezza taratura relativa 0,058 Incertezza relativa vetreria Incertezza relativa Incertezza tarat. pipetta relativa bilancia Incertezza relativa del MR Incertezza ripetibilità relativa Incertezza del materiale di riferimento: Incertezza del MR in %(come da certificato) Incertezza relativa del MR Incertezza taratura relativa della bilancia: Incertezza tarat. relativa bilancia 1,330E-03 Incertezza relativa della vetreria: incertezza vetreria: 0,007 volume (ml): 10 Incertezza relativa vetreria 4,04E-04 Incertezza relativa della pipetta: Incertezza taratura relativa Incertezza relativa recupero Incertezza ripetibilità relativa Incertezza relativa recupero Incertezza taratura relativa Incertezza relativa del MR Incertezza tarat. relativa bilancia Incertezza relativa vetreria Incertezza relativa pipetta Incertezza relativa pipetta Incertezza estesa: 6,68E-03 Incertezza composta relativa 0,082 Incertezza composta 5,928 Incertezza estesa (mg/kg) 15,2 Incertezza estesa relativa 0,210 repliche effettuate per calcolo ripetibilità (n) 6 repliche effettuate per det campione (m) 1 9,11E-03 Incert. estesa relativa su campione 0,25 Incert. estesa relativa su campione (%) 25 Gradi di libertà 36
17 6. Specificità Può essere definita come la proprietà di un metodo di determinare inequivocabilmente l analita di interesse, con un livello prefissato di accuratezza, in presenza di interferenze. Per l istamina si utilizza come detector il DAD a una λ specifica (214 nm). Sono state lette, quindi, le matrici tali e quali, denominate bianchi, verificandone l assenza di principi attivi e segnando i picchi di matrice di intensità tale da poter essere considerati delle interferenze. Sono stati poi lette le soluzioni dei Materiali di Riferimento edi seguito le matrici con l aggiunta al campione iniziale di quantità scalari note di Materiali di Riferimento. Si èeseguito successivamente il confronto degli spettri tra le risposte dei campioni fortificati, quelle originate dalle soluzioni ed i bianchi.
18 7. Studio dell andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione Occorre valutare l andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione, ovvero scegliere il modello di funzione che correli nel miglior modo la ripetibilità alla concentrazione così da poterlo poi applicare per calcolare la ripetibilità all interno di tutto il campo di applicazione del metodo. Si fa riferimento al Manuale Unichim 179/1 «Linee guida per la validazione di metodi analitici nei Laboratori chimici». Si possono presentare due casi: a) lo scarto tipo di ripetibilità si mantiene statisticamente costante in tutto l intervallo esaminato b) lo scarto tipo di ripetibilità varia in tutto l intervallo considerato Nel caso a) si calcola la media quadratica pesata degli scarti tipo S r ottenuti nelle prove di ripetibilità, che sarà assunta come parametro caratteristico del metodo. Nel caso b) si indaga sulla relazione funzionale che meglio approssima l andamento dello scarto tipo S r con la media. Il criterio applicato dal laboratorio per decidere se vale il caso a) oppure il caso b) si basa sul confronto delle varianze S 2 r. In particolare, dato che il laboratorio conduce per ogni livello lo stesso numero di prove (6), il criterio viene espresso dalla formula: dove S 2 rmax e S2 rmin sono rispettivamente la varianza massima e la varianza minima, F ρ èla variabile di Fisher il cui valore è tabulato nel Prospetto 8 del Manuale Unichim 179/1. Nel nostro caso, essendo sempre n pari a 6, il valore di F è Se la formula precedente è verificata allora le varianze si possono giudicare equivalenti e quindi anche gli scarti tipo, altrimenti occorre determinare la funzione che meglio correla la ripetibilità alla concentrazione.
19 Nel caso in cui la formula precedente non sia soddisfatta, si prendono in esame tre modelli di relazione funzionale: Relazione I, retta passante per l origine Relazione II, retta con intercetta diversa da zero Relazione III, curva logaritmica per c+d<1 La varianza dei residui di una curva di regressione ottenuta con una delle tre relazioni sopra citate è data dalla seguente formula: Si sceglie il modello di relazione funzionale che meglio approssima i punti sperimentali con la minima varianza dei residui. Per impiegare questo criterio basta calcolare il valore numerico di mediante la formula precedente per ciascuna relazione f unzionale considerata e adottare quella a cui corrisponde il minimo.
20 Tuttavia, potrebbe essere risultato tale solo per caso; per controllare questa ipotesi, si procede alla verifica della omogeneità delle varianze secondo Bartlett. La formula da utilizzare è la seguente: La verifica si effettua consultando il caso denominato a due vie riportato nel prospetto 10 del Manuale Unichim n.179/1, tenendo conto che i gradi di libertà sono ν=f 1 essendo f il numero totale delle relazioni considerate e quindi anche il numero delle varianze da confrontare, mentre il livello di probabilità ρ=(1 α/2) α/2 è fissato a Il criterio per giudicare se le varianze sono omogenee può essere così espresso: I valori di χ 2 ν=f 1,ρ=0.025 e χ 2 ν=f 1,ρ=0.975 sono tabulati nel prospetto 10 del Manuale Unichim n.179/1. Se questo criterio risulta essere soddisfatto, si può affermare che le varianze sono fra loro omogenee e nessuna in particolare può essere ritenuta effettivamente minore delle altre e in questo caso si può considerare che tutte le curve approssimano i punti sperimentali in modo equivalente. Quindi viene scelta la relazione I che èla più semplice. Se il risultato della verifica èinvece tale che M cade all esterno dell intervallo definito e cioè allora si può affermare che le varianze non sono fra loro omogenee e che la varianza è realmente inferiore alle altre.
21 Relazione I Sr sperimentali y media Sr stimati con la residui al residui relazione I quadrato N livelli 0, ,648 0, , , , ,383 0, , , , ,067 0, , , b 0,04558 (V(e j)) f=i 0, Relazione II Sr sperimentali y media 1/Sj 2 ymediaj/sj 2 (ymediaj) 2 /Sj 2 Sr stimati con 1/S j y mediaj/s j relazione II 0, , , , , , , , , , , , , , , , , ,067 12, , , , , , T1 633, T2 772, T3 2064, T4 37, T5 75, a1 0, b1 0, Sr stimati con relazione II 1/S j 2 y mediaj/s j 2 (y mediaj) 2 /S j 2 1/S j y mediaj/s j 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , T1 con relaz II 702, T2 con relaz II 1961, T3 con relaz II 11971, T4 con relaz II 45, T5 con relaz II 151, a2 0, b2 0, Sr sperimentali y media Sr stimati con residui al residui relazione II quadrato 0, ,648 0,0558 0,0098 0, , ,383 0,0626-0,0194 0, , ,067 0,0890-0,1946 0, (V(ej))f=II 0,038341
22 Relazione III Sr sperimentali y media log y media (log y media)2 log Sr (log y media)(log Sr) 0, ,648-0, , , , , ,383 0, , , , , ,067 0, , , , T1 1, T2 1, T3-2, T4-0, c -1,25374 d 0,69003 Sr sperimentali y media log y media log Sr stimati con relazione III Sr stimati con relazione III residui residui al quadrato 0, ,648-0, , , , , , ,383 0, , , , , , ,067 0, , , , , (V(e j)) f=iii 0, C 1,37500 V(e j) 0, M 1,779 0,051<M<7,378 vedi prospetto 10 MU 179/1 ed χν = f 1, ρ = M χν = f 1, ρ = Commenti: il criterio è soddisfatto pertanto le tre varianze sono equivalenti e quindi si utilizza la relazione I per descrivere l'andamento degli scarti tipo sperimentali.
STIMA INCERTEZZA AMMONIO
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