UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO PER IL CONTROLLO DEI LIEVITI IN ENOLOGIA

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1 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 1 UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO PER IL CONTROLLO DEI LIEVITI IN ENOLOGIA Vincent GERBAUX e Jérôme THOMAS IFV, Unità Beaune Articolo pubblicato in Revue Française d Œnologie, n.236, juin-juillet 2009, p Introduzione Due lieviti sono particolarmente importanti in enologia. Saccharomyces cerevisiae è la specie inspensabile che realizza la fermentazione alcolica. Brettanomyces è un lievito responsabile frequenti deviazioni organolettiche. Il controllo questi lieviti, tuttavia, si effettua raramente. Gli analizzatori automatici hanno migliorato in modo sostanziale i controlli chimico-fisici in enologia, ma a confronto le analisi microbiologiche hanno visto scarso sviluppo. Tale situazione, paradossale per un prodotto della fermentazione, si spiega con il fatto che il vino ha una composizione che lo protegge dai germi patogeni e quin i controlli microbiologici non sono obbligatori. Ma il controllo microbiologico deve essere riconsiderato, rispetto al doppio obiettivo miglioramento qualitativo e riduzione dei costi produzione. Il costo analitico deve allora essere conteggiato. La citometria flusso non è una tecnica nuova. Tuttavia, i progressi dell ottica e dell elettronica permettono oggi proporre apparecchiature efficaci ed adatte ai laboratori enologici. L IFV ha sviluppato un metodo conteggio dei lieviti viventi che fa uso della citometria flusso. Per valutare le verse possibilità d applicazione pratica sono stati considerati sia i vini commerciali che vini ottenuti in conzioni sperimentali. Materiali e meto Il citometro flusso utilizzato è un modello Cyflow SL (società Partec), equipaggiato con un laser blu e due rilevatori (mensione delle particelle e fluorescenza). L analisi vera e propria consiste nel miscelare 0.4ml vino, 0.4 ml un tampone specifico e 8 µl fluorocromo (Fluorescina -acetato, FDA), attendere 10 minuti, quin iniettare il campione nel citometro flusso. Il conteggio dei lieviti si ottiene in meno 15 minuti. In 1 ora è possibile analizzare 14 campioni. La zona numerazione è da 100 a 1 milione cellule per millilitro senza preparazione del campione : attraverso centrifugazione o luizione è possibile ampliare lo spettro d azione dello strumento. Il metodo non è specifico, e può essere utilizzato per il conteggio sia Saccharomyces sia Brettanomyces. Salvo casi particolari, questi due lieviti si succedono durante la vinificazione: Saccharomyces predomina durante la fermentazione alcolica e Brettanomyces ha la capacità svilupparsi più tar nei vini secchi, durante l affinamento o anche in bottiglia. Il fatto che il metodo conteggio dei lieviti viventi per citometria flusso non sia specifico, lo rende interessante per molte situazioni. Come per tutte le analisi microbiologiche, è molto importante adottare alcune precauzioni in fase prelievo. Per il controllo Brettanomyces nei vini in affinamento, il prelievo deve evitare interessare i lieviti in superficie. Quando si preleva dalla barrique si consiglia l impiego una siringa inserita in un tubo capillare. Il campione non deve subire inquinamenti da parte dei lieviti presenti sulle superfici. Per verse ragioni, tra cui la sementazione, la popolazione Brettanomyces è crescente spostandosi dalla superficie verso il fondo del contenitore: si consiglia quin effettuare il prelievo appena sopra il livello delle fecce. È importante inoltre accertarsi che la fermentazione alcolica sia completamente terminata e che quin i lieviti Saccharomyces cerevisiae presenti siano poco o per nulla attivi. Il metodo riferimento utilizzato per il conteggio dei lieviti è l incubazione in scatola Petri in stufa a 28 C con il 5% CO 2. Per la crescita si è utilizzato il terreno agarizzato YPD (estratto lievito, peptone e destrosio). Per Saccharomyces cerevisae, l incubazione è 2-3 giorni. Per il conteggio dei lieviti totali è necessario attendere 7 giorni. Per valutare la popolazione Brettanomyces, il terreno YPS è adzionato 50 mg/l cicloesimide, che inibisce Saccharomyces cerevisiae, e l incubazione è 7 giorni.

2 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 2 Densité Risultati e Discussione Controllo una fermentazione alcolica. Un mosto Chardonnay è stato ripartito in 3 lotti : testimone, con aggiunta solo fosfato d ammonio (40 g/hl dopo una caduta 25 punti densità), con aggiunta dei fosfato d ammonio come nella tesi precedente e un nutriente complesso (20 g/hl dopo una caduta densità tra 5 e 25 punti). La popolazione blastomicetica presente è stata seguita con citometria flusso. La crescita dopo l inoculo è risultata rapida (Figura 1). La fase stazionaria viene 1,10 1,08 1,06 1,04 1,02 1,00 0,98 Témoin Phosphate d'a. Activateur FA Témoin Phosphate d'a. Activateur FA Chaptalisation Figura 1 : Evoluzione della densità e della popolazione lieviti vivi durante la fermentazione alcolica un mosto chardonnay 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 raggiunta con milioni dei cellule nei tre lotti sperimentali. Tale livello popolazione resta praticamente costante durante la fermentazione alcolica, che avviene aduna temperatura C. La caduta della densità è accelerata in presenza fosfato d ammonio ed ancor più con l aggiunta complementare nutrienti complessi. In queste ultime due tesi, la popolazione dei lieviti vivi decresce rapidamente una volta esauriti gli zuccheri (meno 0.2g/l misurati a 25 giorni). Nel lotto testimone la popolazione lievito resta a livelli elevati più a lungo, e la fine della fermentazione alcolica è più stentata (3.8 g/l zuccheri a 25 giorni). Fase 1 : Acqua + zuccheroi + fosfato d ammonio + lieviti secchi attivi 8 ore (35 C iniziali, quin 20 C) Fase 2 : + vino + acqua + zucchero + fosfato d ammonio 48 ore a 20 C Tirage 1 : 30 % del volume Colmatura con mezzo nuovo 48 ore a 20 C Tirage 2 : 30 % del volume Colmatura con mezzo nuovo 72 ore a 20 C Tirage 3 : 30 % del volume Colmatura con mezzo nuovo 48 ore a 20 C Tirage 4 Durante lo svolgimento della fermentazione alcolica, la citometria flusso permette quin seguire in tempo reale la popolazione Saccharomyces cerevisiae. Una caduta della popolazione vivente, in corrispondenza una fermentazione alcolica stentata, dà il segnale della necessità un ulteriore inoculo e permette d anticipare l intervento. Controllo un pied de cuve. Un vino chardonnay, caratteristico un vino base spumante, è stato aggiunto 24 g/l zucchero dopo essere stato ripartito in flaconi con tappo a vite, per la simulazione una presa spuma. Il protocollo d ottenimento un pied de cuve si ispira alla tecnica sviluppata dal CIVC. Alla fine del periodo consigliato, il pied de cuve è mantenuto per la realizzazione inoculi successivi, per un periodo 1 settimana (schema 1). Le analisi dei tenori in zucchero mostrano che al momento del secondo tirage il pied de cuve è in situazione carenza, versamente da quanto avviene al momento degli altri tiraggi. Schema 1 : Protocollo d ottenimento un pied de cuve per l elaborazione vini spumanti (fonte CIVC) e suo mantenimento per la realizzazione dei tiraggi successivi

3 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 3 7,5 7,0 6,5 6,0 Tirage 1 Tirage 2 vivantes Tirage 3 Tirage 4 mortes Figura 2 : Evoluzione della popolazione lievito in un pied de cuve mantenuto per realizzare tiraggi successivi. La figura 2 mostra che la popolazione lieviti vivi aumenta leggermente durante la fase preparazione del pied de cuve. Nonostante l aggiunta nuovo vino base, la popolazione lievito si riduce nel secondo e terzo tirage, probabilmente a causa dell esaurimento degli zuccheri. Una nuova fase crescita si constata in occasione del quarto tiraggio. In parallelo è stato seguito il numero cellule morte utilizzando una fluoro cromo specifico (ioduro propio). Il numero cellule morte aumenta in corrispondenza del primo e secondo tiraggio per stabilizzarsi in seguito. Il controllo dei lieviti vivi durante la presa spuma mostra una crescita immeata e regolare nel primo tiraggio, con una fase stazionaria leggermente superiore a 1 milione cellule / ml (Figura 3). 6,5 6,0 5,5 5,0 Tirage 1 Tirage 2 Tirage 3 Tirage Figura 3 : Evoluzione della popolazione lieviti vivi durante la presa spuma a seguito tiraggi successivi. Nel caso del secondo tiraggio, si nota un tempo latenza una settimana, che conferma lo stato fisiologico non ottimale delle cellule. Nel terzo e quarto tiraggio la crescita immeata e rapida. Il livello popolazione in fase stazionaria è circa 1,6 milioni cellule, superiore a quello del primo tiraggio. La citometria flusso permette quin seguire la namica della popolazione in un pied de cuve destinato alla presa spuma o alla ripresa fermentazione e aggiustare conseguenza le operazioni. Mutizzazione. Per simulare questa operazione, sono stati mutizzati con verse dosi SO 2 tre mosti chardonnay, prelevati a verse concentrazioni zuccheri ed alcool. La popolazione blastomicetica al momento della mutizzazione è nell orne dei 50 milioni cellule per tutti e tre i mosti (Tabella 1). Nel mosto 1 (all inizio della fermentazione alcolica) una dose 100mg/l SO 2 riduce la popolazione lievito tre log, ed una dose 150 mg/l permette d eliminarla totalmente. Nel mosto 2, 100 mg/l sono sufficienti per uccidere tutti i lieviti. Nel mosto 3 (il più avanti nella fermentazione alcolica) 50 mg/l SO 2 producono un effetto visibile ma limitato e 100mg/l eliminano la popolazione. Le misure effettuate 24 e 48 ore dopo la mitizzazione danno risultati simili.

4 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 4 Lieviti vivi Solfitaggio (mg/l) Tempo (log cellule/ml) Mosto 1 : T0 7,7 Tabella 1 : Evoluzione della popolazione lieviti vivi dopo mutizzazione con SO 2 mosti chardonnay. 5.0 % v/v 24 h. 7,7 7,6 4,4 < g/l zuccheri 48 h. 7,7 7,5 4,3 < 2.0 Mosto 2 : T0 7,8 9.0 % v/v 24 h. 7,7 7,4 < 2.0 < g/l zuccheri 48 h. 7,8 7,2 < 2.0 < 2.0 Mosto 3 : T0 7, % v/v 24 h. 7,6 6,2 < 2.0 < g/l zuccheri 48 h. 7,5 5,3 < 2.0 < 2.0 La citometria flusso permette realizzare dei test preventivi sui mosti destinati ai vini liquorosi, per determinare la dose solforosa necessaria al trattamento. Questa tecnica può essere alternativa ai test combinazione della SO 2. Può inoltre rivelarsi interessante per una mitizzazione a posteriori. Controllo Brettanomyces nei vini rossi durante l affinamento. Il livello contaminazione da Brettanomyces è stato determinato su 144vini rossi campionati specificatamente per questa analisi (ve materiali e meto). Si è trattato vini secchi e generalmente contenuti in barrique. La determinazione per citometria flusso è stata accompagnata da un conteggio su piastra (usando terreno YPD adzionato cicloesimide). Le popolazioni blastomicetiche determinate con citometria flusso si sono rivelate fortemente correlate con le popolazioni determinate in piastra (tabella 2). Per questa applicazione, il limite inferiore determinazione è fissato a 200 cellule/ml per la citometria flusso (tenendo conto della luizione 50:50 con il tampone). In tutti i vini analizzati, il conteggio su capsula Petri ha sempre incato meno 200 Brettanomyces per ml. Classi popolazione in citometria flusso Numero vini Torbità mea (NTU) Popolazione mea (cellule/ml) Citometria flusso Capsula Petri Coefficiente correlazione tra citometria e capsula Petri Superiore a Tra e Tra 200 e Inferiore a Inf. à Tabella 2 : Determinazione della popolazione Brettanomyces in 144 vini rossi durante l affinamento In qualche caso la determinazione su capsula Petri inca popolazioni largamente inferiori a quelle ottenuto per citometria flusso. Sono possibili verse spiegazioni al fenomeno. Il campione può essere inquinato da lieviti superficie o materiale. Può esistere una popolazione attiva Saccharomyces cerevisiae parallelamente alla fine una fermentazione alcolica stentata. Infine,

5 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 5 Brettanomyces può essere in uno stato fisiologico che impesce la sua crescita su piastra, come mostra l esperimento seguente Cytométrie : Témoin Boîte de Pétri : Témoin Cytométrie : 30 mg/l SO2 Boîte Pétri : 30 mg/l SO2 cellules mortes cellules vivantes non cultivables cellules vivantes Figura 4 : Evoluzione della popolazione Brettanomyces in un vino rosso solfitato o non solfitato. Una massa pinot noir contaminata da Brettanomyces viene sudvisa in due lotti: testimone e tesi adzionata 30 mg/l SO 2. Nel lotto testimone, la popolazione resta elevata ed i risultati ottenuti con i due meto sono comparabili (Figura 4). Nel caso del lotto solfitato, i risultati sono versi secondo il metodo utilizzato. La popolazione che cresce in piastra rappresenta i lieviti coltivabili. La citometria flusso, invece, conteggia tutti i lieviti viventi, siano essi coltivabili o no. Questi risultati mettono in evidenza uno stato vivente ma non coltivabile Brettanomyces. Una sperimentazione complementare mostra la relativa buona tolleranza Brettanomyces alla SO 2 (Tabella 3). Un ora circa dopo l aggiunta, solamente una dose 50 mg/l elimina il 95% della popolazione. La dose 30 mg/l elimina il 22% La dose de 30 mg/l élimine 22% della populazione Brettanomyces nel vino 1 e l 81 % nel vino 2. L efficacia della solfitazione pende dalle caratteristiche del vino (in particolare il ph) e dalla popolazione Brettanomyces. SO2 Vin 1 Vin 2 0 mg/l mg/l mg/l mg/l Tabella 3 : Effetto immeato della SO2 sulla popolazione Brettanomyces in due vini rossi contaminati (cellule/ml) Durante lo svolgimento della fermentazione malolattica e l affinamento dei vini rossi, la citometria flusso permette quin seguire la presenza ed il livello della popolazione Brettanomyces. La messa in evidenza una crescita cellulare informa sul grado d urgenza un operazione stabilizzazione microbiologica,che può così essere realizzata prima della comparsa odori fenolati. Parallelamente, la citometria flusso permette realizzare test stabilizzazione dei vini contaminati da Brettanomyces, e verificare l efficacia un operazione stabilizzazione nel tempo. Messa in evidenza uno sviluppo lieviti in un vino in bottiglia Su 43 vini bianchi in bottiglia che presentavano torbità sono stati effettuati dei conteggi dei lieviti vivi presenti. L analisi in citometria flusso è stata realizzata in parallelo con la coltivazione in piastra su terreno non specifico. La popolazione determinata in citometria flusso è ben correlata con quella ottenuta in piastra per livelli popolazione superiori a 200 cellule/ml (tabella 4). Con contaminazioni inferiori, la citometria flusso non è abbastanza precisa e dà valori superiori a quelli del conteggio in piastra. La torbità del vino non è in relazione con la popolazione lieviti vivi presente.

6 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 6 Classi populazione in citometria flusso Numero vini Torbità mea (NTU) Popolazione mea Citometria flusso Capsula Petri Coefficiente correlazione > , ,87 > e < , > 200 e < , < , ,41 Tabella 4 : Determinazione della popolazione lieviti vivi in 43 vini bianchi in bottiglia che presentavano torbità Altre determinazioni Brettanomyces hanno interessato 81 vini rossi in bottiglia. La valutazione della popolazione è stata effettuata per citometria flusso e con conteggio in piastra su terreno YPD aggiunto cicloesimide. I risultati ottenuti con i due meto sono fortemente correlati (tabella 5). I dati sulle popolazioni determinate con citometria flusso tendono tuttavia ad essere più bassi. La popolazione vivente Brettanomyces in una bottiglia è più o meno vecchia e può essere composta da cellule viventi ma non coltivabili, quin che non vengono messe in evidenza dal conteggio su piastra. La torbità rilevata non è legata alla popolazione determinata. Classi popolazione in citometria flusso Numero vini Torbità mea (NTU) Popolazione mea Citometria flusso Capsula Petri Coefficiente correlazione > > e < ,99 > 200 e < < < Tabella 5 : Determinazione della popolazione Brettanomyces in 81 vini rossi in bottiglia La citometria flusso si applica al controllo dei vini in bottiglia, sia per assicurare una buona stabilità microbiologica nel tempo, sia per dare spiegazione a fetti insorti. Tale tecnica analitica può anche dare un informazione interessante per la preparazione dei vini all imbottigliamento. La conoscenza della popolazione blastomicetica vivente, in questa fase, permette d orientare conseguenza le operazioni stabilizzazione. Per quanto riguarda nello specifico Brettanomyces, questo controllo può evitare le contaminazioni incrociate legate alle attrezzature. Conclusioni I lavori presentati mostrano che oggi la citometria flusso si presta a numerose applicazioni in campo enologico. Il metodo proposto è semplice e rapido. Il fatto che non sia specifico per una specie può rappresentare un vantaggio. Quando la citometria flusso inca popolazioni al sotto

7 GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P cellule/ml, il problema della specificità non si pone nemmeno. Se l analisi citometrica evidenzia la presenza una popolazione blastomicetica vivente, è interessante ottenere le informazioni complementari sulla massa analizzata per la corretta interpretazione dei risultati: svolgimento della fermentazione alcolica ed eventualmente malolattica, solfitazione Se persiste un dubbio, è sempre possibile ricorrere alle tecniche più specifiche (conteggio in piastra, PCR quantitativa). E stato sviluppato un citometro flusso adatto alle applicazioni enologiche (Oenolyser, Società Partec), oltre ad un kit dosaggio che permette riprodurre il metodo d analisi messo a punto dall IFV (Kit OenoYeast). Il Cyflow SL, utilizzato per i lavori presentati, e l Oenolyser sono stati messi a confronto nell analisi 30 vini (10 bianchi e 20 rossi). I risultati ottenuti con i due apparecchi sono molto simili dal punto vista microbiologico (tabella 6). Popolazione lieviti Cyflow SL Oenolyser Mea Minimo Massimo Tabella 6 : Confronto tra citometri flusso nella determinazione della popolazione blastomicetica in 30 vini bianchi e rossi La citometria flusso è quin oggi a sposizione dei laboratori enologici. Tale tecnica non necessita conzioni operative particolari. Tuttavia, è in grado dare un informazione microbiologica che richiede un interpretazione specifica per il settore. Le conzioni prelievo del campione sono importanti ed impongono l applicazione una procedura scritta. La citometria flusso offre nuove possibilità sviluppo per l enologia prettiva e preventiva. Bibliografia -Gerbaux V Dénombrement rapide de Brettanomyces dans un vin rouge par cytométrie de flux. Rev. Des Oenol., 123, Gerbaux V., Jeudy S., Monamy C Etude des phénols volatils dans les vins de Pinot noir en Bourgogne. Bull. OIV, N , Laurent M, Valade M La préparation du levain de tirage à partir de levures sèches actives. Le Vigneron Champenois, 128:3, Renouf V., Lonvaud-Funel, A., Walling, E., Coulon, J "Le suivi microbiologique du vin. 1. De la parcelle au contionnement : un outil pour une oenologie raisonnée." Revue des oenologues(118): Renouf, V., Lonvaud-Funel, A., Walling, E., Coulon, J "Le suivi microbiologique du vin. 2 : Conseils pratiques pour la mise en place d'un suivi microbiologique." Revue des oenologues(119): Vincent B Dynamique des populations de Brettanomyces dans les vins de Pinot noir de Bourgogne en cours d élevage : Effet souche et influence des traitements par le SO2. Rev. Fr Oenol., 219, 1-6.