Nuove proposte a livello internazionale per la applicazione di metodi rapidi e innovativi per la ricerca di batteri e virus negli alimenti

FOCUS SU SICUREZZA D USO E NUTRIZIONALE DEGLI ALIMENTI Roma 21-22 novembre 2005 Nuove proposte a livello internazionale per la applicazione di metodi rapidi e innovativi per la ricerca di batteri e virus negli alimenti D. De Medici e M. Paniconi

Metodi classici Metodi per alternativi la determinazione di patogeni Lunghi (4-6 giorni) Costosi Rapidi Meno Non quantitativi costosi MPN Automatizzati Possibilmente quantitativi

Armonizzazione e Standardizzazione di un nuovo metodo microbiologico Identificazione dei metodi riportati in letteratura Progetti di ricerca Armonizzazzione Valutazione delle tecniche di preparazione del campione in relazione alle matrici Comparazione intralaboratorio delle performance dei differenti metodi Attività di laboratorio Validazione del metodo attraverso ring trial interlaboratorio Standardizzazione Definizioni di linee guida. Corsi di training Attività di normazione Metodo standardizzato ISO, CEN, UNI

Metodi Rapidi: attività di ISO 16140:2003 normazione CEN/TC 275/WG 6: Microbial contamination CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs using PCR" CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food"

Progetti Europei 5 th Framework FoodPCR Foodborne virus in Europe 6 th Framework FoodPCR 2 SeaFoodPlus

Food-PCR Validation and Standardization of Diagnostic Polymerase Chain Reaction for Detection of Foodborne Pathogens 5 th Framework Program, Project QLK1-CT-1999-00226 Coordinator: Jeffrey Hoorfar, DFVF Total budget: 2.5 MIO Euro, 1.7 MIO Euro EC funding 12 expert and 24 end-user laboratories from EU and other European countries (Italy ISS and CoopItalia) www.pcr.dk

Patogeni studiati Salmonella spp. Foodborne thermotolerant Campylobacter spp.: (C. jejuni, C. coli, C. lari) Enterohemorragic Eschericia coli (EHEC) Listeria monocytogenes Yersinia enterocolitica

Organizzazione del progetto WP1: Construction of DNA banks WP2: Validation of thermocyclers WP3: Pre-PCR sample treatment WP4: Collaborative trials WP5: Automated detection WP6: Guidelines, standards and workshops

Risultati ottenuti Reference DNA for each pathogen Thermocycler validation study Optimized PCR for each pathogen assay Pre-PCR treatments for carcass swab, carcass rinse, and milk 4 + 1 validated PCR assays > 30 publications.

TEMPERATURE RECORDING UNIT Thermocycler validation study AQUA DEST 50µl FIX THE LOCATION OF THE THERMOSENSOR WITHIN THE PCR TUBE SCHODER et al. 2001 Biochemical Testing: Amplification efficiency 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A a a B b b C c c D d d E a a b c d a F b b G c c H d d PCR conditions: 40 PCR cycles modified thermosensitive target sequence, similar to Penicillin binding factor A from Listeria amplicon of 116 bp Positioning pattern: a, b, c and d reaction equivalents to 15000, 1500, 150 and 15 target copies five replicates Kuhn et al. 2001 Initial Denaturing Time Temp. 1 min 95 C Denaturing 10 s 95 C Annealing 20 s 63 C Elongation 20 s 72 C Terminal Elongation 5 min 72 C

Results of the collaborative trials of the PCR-based methods Sensitivity (%) Specificity (%) Accordance (%) Concordance (%) Campylobacter / Swine carcass 94.2 83.3 96.1 95.6 Campylobacter / Poultry carcass 96.7 100 100 100 EHEC / Cattle carcass 92.6 100 100 100 Salmonella spp. / Swine carcass 100 84.6 100 100 Salmonella spp. / Poultry carcass 100 84.6 100 100 Y. enterocolitica / Swine carcass 30.3 69.7 81.8 54.3

Una reazione di PCR negativa può essere dovuta a vari fattori: assenza del target, malfunzionamento dell apparecchio, presenza di sostanze inibenti, scarsa attività della polimerasi ecc. Necessità di validare attraverso ring trial internazionali solo metodi che includono la presenza di Internal Amplification Control (IAC). Un risultato falsamente negativo è un problema di sanità pubblica Un risultato falsamente positivo è un problema commerciale

FOOD-PCR 2 WP 10 of MedVetNet Network of Excellence, www.medvetnet.org WP leader: DFVF 19 partners: 9 main (funded) and 10 associated (no funding). 12 countries. 18 months: Sept. 1st 2004 March 1st 2006. Budget: 251 000 Euro, incl. 210 000 Euro from EC. 5 tasks and 6 deliverables. www.foodpcr.com

Central Service Laboratory -York Università di Vienna Congen-Berlino Università di Giessen Università di Liegi Iceland Fishering Laboratories National Veterinary and Food Research Institute Danish Meat Research Institute Instituto di Ricerca e Tecnologia Alimentare

WP1 WP2 WP3 WP4 WP5 Microarray standardization General requirements for real-time PCR standardization: Preparation of ring-trials and reference materials for Salmonella PCR testing of animal faeces Standards for virus in produce

Real-Time PCR in Italia 10 Istituti Zooprofilattici Sperimentali Istituto Superiore di Sanità -Roma Consorzio di Bioingegneria e Informatica (Pavia) Università Cattolica del Sacro Cuore - Piacenza Ricerca Finalizzata 2005: Sicurezza Alimentare: studio e applicazione di modelli di controllo e di microbiologia predittiva su base Real-Time PCR per valutare la presenza e il comportamento di patogeni in prodotti tradizionali italiani Responsabile: Dr.ssa N. Losio IZS della Lombardia e dell Emilia Validazione di due metodi per la ricerca e numerazione della Listeria monocytogenes e della Salmonella in prodotti tipici italiani

FBVE Network Rapid detection of transnational foodborne viral infections and elucidation of transmission routes through molecular tracing and development of a common database A research proposal on Quality of Life and Management of Living Resources (1999/C 64/14) RIVM M. Koopmans 11 centri ricerca in 9 Paesi ISS: L. Croci, D. De Medici F.M. Ruggeri

Risultati del FBVE Il progetto prevedeva principalmente lo sviluppo di un data base europeo per l archiviazione delle sequenze dei virus enterici isolati in E.U. (https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/)

Sviluppo e validazione di metodi di Real-Time PCR quantitativi per la determinazione di HAV e norovirus in molluschi

Attività di normazione nel CEN CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting micro-organisms in foodstuffs using PCR" Inizio dei lavori:berlino Dicembre 2000 10 riunioni CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food Inizio Lavori: Saint Denis Marzo 2004 3 riunioni

CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs using PCR" EN ISO 22714 Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens General requirements and definition Lo standard EN-ISO 22174 è stato pubblicato il 15-02-2005 CEN ISO TS 20836 Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens Performance criteria for thermal cycler La specificazione tecnica CEN ISO/TS 20836 è stata adottata e pubblicata ad Agosto 2005

CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs using PCR" pren ISO TS 20837 Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens Requirements of sample preparation for qualitative methods pren ISO TS 20838 Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens Requirements for amplification and detection for qualitative methods. Lo votazione per questi due standard è iniziata a settembre 2005

ISO 22174 General requirements and Procedura analitica Aree di lavoro Controlli da effettuare

ISO 22174 Procedura analitica Pre-arricchimento del campione Estrazione e purificazione del DNA o RNA Amplificazione con primers specifici Determinazione dei prodotti della PCR I campioni positivi possono (dovrebbero) essere confermati utilizzando i metodi colturali* * la positività del campione deve essere confermata quando esiste un metodo culturale ISO

ISO 22174 Strutture Il laboratorio deve disporre di un minimo di quattro aree separate: a) Preparazione della soluzione di acidi nucleici da materiale da saggio b) Preparazione delle mastermix c) Preparazione delle miscele di amplificazione con l aggiunta delle soluzioni di acidi nucleici d) Determinazione e conferma dei prodotti della PCR L amplificazione può essere effettuata sia nell area c) che d) Se il termal-cycler è posta nell area c) i tubi dopo amplificazione non possono essere aperti nell area c) ma nell area d).

ISO 22174 Controlli Controllo negativo di processo Controllo positivo di processo Controllo negativo di estrazione Controllo interno di amplificazione Controllo positivo PCR Controllo negativo PCR Trattamento del campione Estrazione DNA Amplificazione Determinazione Risultato del test Controllo postivo di processo Controllo positivo PCR Controlli negativi (processo, estrazione PCR) IAC Controllo di amplificazion e esterno Interpretazio ne dei risultati + + + - ± + positiva - + + - + + negativa + + + + ± ± Possibile contaminazione - - + - - - Possibile inibizione

ISO 20836 Performance of Termal cycler Performance test Annex A Biochemical performance test Annex B Physical performance test

GRAZIE!!!!