Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010 Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA 11-5-2010
I plasmidi: un mondo da esplorare. Elementi genetici capaci di replicarsi autonomamente dal cromosoma DNA a doppia elica, di solito circolare (in alcuni casi lineari), dimensioni variabili
La conformazione che più spesso assumono nella cellula è quella SUPERAVVOLTA Più compatta Struttura supercoiled Struttura open circular
Portano vantaggio alla cellula ospite Non hanno vita extra cellulare Geni non essenziali alla vita della cellula TRATTI METABOLICI NUOVI ADATTAMENTO
PLASMIDI ARTIFICIALI DIMENSIONE RIDOTTA: facile isolamento e manipolazione ORIGINE DI REPLICAZIONE INDIPENDENTE NUMERO ELEVATO DI COPIE: permette di amplificare il DNA PRESENZA DI MARCATORI SELEZIONABILI: per esempio geni per la resistenza Modificati per evitare il traferimento per coniugazione
ESEMPI DI PLASMIDI INGEGNERIZZATI/1 Scritte colore Blu: siti di taglio per enzimi di restrizione
ESEMPI DI PLASMIDI INGEGNERIZZATI/2 Scritte colore Blu: siti di taglio per enzimi di restrizione
Caratteristiche indispensabili per un vettore di clonaggio: Mantenimento all interno dell ospite (di solito E. coli) Facilmente isolabile in forma superavvolta Possedere la possibilità di inserire discrete quantità di DNA esogeno Possedere geni per la resistenza a particolari antibiotici (per esempio ampicillina e/o tetraciclina) Deve poter essere inserito nell ospite per trasformazione Contenere siti unici di taglio per enzimi di restrizione POLYLINKER o sito multiplo di clonaggio
POLYLINKER
Vettore ricombinante viene introdotto in vivo in una cellula ospite (generalmente un ceppo del batterio E. coli). Un clone del batterio viene fatto crescere fino a produrre una grande quantità di copie del DNA ricombinante
1 1 1: taglio con enzimi di restrizione 2 2: ligazione dei frammenti ottenuti 3 3: trasformazione dei plasmidi ricombinanti in un ospite
Si otterranno dei cloni che portano il gene di interesse (o, nel caso in cui si cloni l intero genoma di organismo, un insieme di cloni diversi ognuno dei quali ha incorporato una frazione del DNA in esame) Libreria genica
F
Frammentazione del genoma/1 Rottura meccanica E possibile frammentare il DNA con metodi fisici, come la sonicazione, o il passaggio attraverso un sottile ago di una siringa. Questi metodi presentano il vantaggio di produrre frammenti casuali (maggiore rappresentatività), ma lo svantaggio di produrre frammenti sia con estremità blunt che con estremità 5 e 3 irregolari, non adatte alla ligazione, che devono essere rese blunt. In molti casi è necessario dover aggiungere dei linkers per il clonaggio nel vettore appropriato.
Frammentazione del genoma/2 Digestione con enzimi di restrizione Se si utilizza un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 6bp (EcoRI), i frammenti generati avrebbero dimensioni in media di 4x10 3 bp, se la composizione in basi del DNA fosse casuale. In realtà i frammenti che si ottengono sono troppo grandi o molto piccoli e questi sarebbero più rappresentati nella library. Una strategia comunemente usata è quella di digerire il genoma con un enzima che taglia siti a 4 basi (Sau3A, AluI, HaeIII), avendo cura di effettuare la digestione in condizioni tali che la digestione sia parziale (tempi di digestione o quantità di enzima sub- ottimali).
Scelta del vettore e della dimensione della libreria I fattori principali da valutare nella costruzione di una libreria genomica riguardano la grandezza del genoma e la dimensione media dei frammenti che costituiranno la libreria, da cui dipendono il numero di cloni indipendenti necessari per avere una ragionevole probabilità di rappresentare tutto il genoma. Per esempio, per il genoma di E.coli di ~4x10 6 bp, utilizzando per la sua frammentazione un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 6bp (EcoRI), che taglia in media ogni 4x10 3 bp, basterebbero 4x10 6 /4 x10 3 =~ 1000 cloni per avere una libreria che rappresenti tutto il genoma Questo però sarebbe possibile solo se tutti i frammenti: -fossero differenti tra loro -fossero non sovrapposti tra loro.
In realtà, le due condizione non sono soddisfatte poiché per definizione: 1) una libreria è una collezione di frammenti casuali 2) in una libreria, i frammenti contenuti nei plasmidi ricombinanti devono essere parzialmente sovrapposti. In una libreria di cloni casuali, maggiore è il numero di cloni, maggiore è la probabilità che alcuni di essi siano completamente o parzialmente sovrapposti. Ciò significa che più grande è la libreria, maggiore sarà il grado di ridondanza. ln (1- P) N= ln (1 a ) b N = numero di cloni richiesti P = probabilità che la libreria contenga il frammento d interesse di solito tra 0.95 e 0.99), a = dimensione inserti; b = dimensione del genoma;
Scelta del vettore e della dimensione della libreria Esistono diversi tipi di vettori: 1. Plasmidi: accettano sino a ~10 kb di DNA estraneo 2. Fagi: frammenti di 5-20 kb (il loro intero genoma è di 50kb) impiegati per costruire librerie genomiche. 3. Cosmidi: 35-45 kb simili ai plasmidi 4. Cromosomi artificiali: -2000 kb (essenziali per clonare frammenti molto grandi)
Come ricostruire sequenza originaria di un genoma sulla base dei singoli frammenti clonati? Diversi approcci sperimentali( due esempi): Hierarchical sequencing (clone by clone) Sequenziamento con shotgun totale
Hierarchical sequencing (clone by clone) I: clonaggio del genoma in unità piccole (40-500 kb) II: creazione di una mappa del genoma, la più dettagliata possibile,che fornisca una guida per i saggi di sequenziamento mostrando la posizione dei geni e marcatori III: sequenziamento shotgun dei cloni ottenuti e assemblaggio a formare contigs IV: assemblaggio dei contigs e ricostruzione della sequenza cromosomica
Sequenziamento con shotgun totale I: clonaggio del genoma in unità piccole (1,5-10 Kb) II: sequenziamento shotgun dei cloni ottenuti III: assemblaggio delle sequenze: Allineamento delle sequenze ottenute a formare contig mediamnte l uso di algoritmi Assemblaggio dei contig e mappatura sul cromosoma
Dopo aver assemblato i contigs rimangono spesso dei buchi. Tra i possibili metodi per colmarli è possibile costruire una nuova libreria utilizzando frammenti generati in modo diverso e vagliarla con i contig già assemblati. Oppure è possibile disegnare primers alle estremità di ogni conting e fare PCR tra le estremità di tutti i possibili primers. 1 2 3 4
IN COSA CONSISTE DUNQUE L ESERCITAZIONE DI OGGI? ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO MEDIANTE LISI ALCALINA
PROTOCOLLO 1. Da una piastra di cellule batteriche, recanti il plasmide d interesse, o da uno stock di batteri in glicerolo, viene effettuato, in condizioni sterili, l inoculo di una singola colonia, in 3ml di brodo LB con opportuno antibiotico, all interno di un tubo batteriologico da 15 ml. Il tubo viene incubato per circa 12-16 ore a 37 C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. LB + antibiotico
PROTOCOLLO 2. La coltura viene quindi centrifugata a 12000 rpm per 1-3 minuti, ottenendo così un pellet di cellule batteriche che viene poi risospeso in 300 l (0,3 ml) di soluzione P1 (50mM Tris-HCl ph 8, 10 mm EDTA ph 8 + RNasiA). Tris HCl Tampone con la funzione di creare un microambiente favorevole al mantenimento del DNA in condizioni ottimali. EDTA Chelante degli ioni bipositivi (soprattutto calcio e magnesio) serve a disattivare gli enzimi litici (Dnasi) che si liberano con la lisi cellulare e che potrebbero degradare il DNA. Destabilizzante delle membrane biologiche. RNasiA Enzima indispensabile alla degradazione dell RNA, che altrimenti potrebbe mascherare il segnale dato dal DNA.
PROTOCOLLO 3. Aggiungere 300 l di soluzione di lisi, o soluzione P2 (200 mm NaOH, 1% SDS), agitare delicatamente per inversione e incubare a temperatura ambiente per max 5. NaOH Eleva il ph determinando uno stress osmotico che destabilizza la parete cellulare. Denatura tutte le strutture ad alto peso molecolare compreso il DNA cromosomico. SDS Scioglie la membrana plasmatica.
PROTOCOLLO 4. Aggiungere 300 l di soluzione neutralizzante o P3 (2,55 M K-acetato ph 4,8), mescolare ancora per inversione e centrifugare a 13000 rpm per 15. K-acetato Riporta il ph a valori lggermente basici (intorno a 8) determinando la rinaturazione rapida e imperfetta delle strutture cellulari (flocculi biancastri) ad eccezione del DNA plasmidico.
PROTOCOLLO 5. Recuperare il sopranatante con una micropipetta e trasferirlo in una nuova eppendorf. Precipitare il DNA con 0,8 volumi di isopropanolo mediante centrifugazione per 15. Le soluzioni alcoliche servono per far precipitare gli acidi nucleici.
PROTOCOLLO 6. Il pellet del DNA viene sottoposto a due lavaggi con etanolo 70%, centrifugando per 2 a 13000 rpm. Dopo averlo essiccato brevemente risospendere in 20 l di TE o dh 2 0.
PROTOCOLLO 7. La concentrazione del DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di etidio (EtBr), insieme ad aliquote di preparazioni a concentrazione nota utilizzate come standard.