SEQUENZIAMENTO DEL DNA
Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico Il metodo automatico La reazione enzimatica Elettroforesi in un sequenziatore automatico
Il metodo di Sanger: la reazione enzimatica Reagenti della reazione enzimatica: DNA da sequenziare a singolo filamento DNA polimerasi Innesco dntp (di cui almeno uno è marcato con 32 P o 33 P o 35 S in posizione α) 2,3 -dideossinucleotidi (a più bassa concentrazione rispetto ai dntp) Si preparano 4 diverse miscele di reazione, ognuna contenente un diverso dideossinucleotide
Il metodo di Sanger: la corsa elettroforetica Le 4 reazioni enzimatiche vengono caricate in 4 diversi pozzetti di un gel ad alta risoluzione di poliacrilammide e urea per poter separare le varie molecole di DNA che differiscono tra loro in lunghezza anche per una singola base. La matrice di poliacrilammide, di solito al 6-8%, garantisce l alto potere risolutivo mentre l urea 8 molare serve per creare la condizione denaturante, necessaria per minimizzare la formazione di strutture secondarie del DNA che interferiscono con la mobilità elettroforetica delle molecole
Il metodo di Sanger: l autoradiografia Lettura e trascrizione manuale della sequenza
polylinker di M13mp7 innesco La reazione di sintesi inizia sempre nello stesso punto indipendentemente dal sito di restrizione utilizzato per il clonaggio E possibile sequenziare anche una qualsiasi molecola di DNA a doppio filamento purchè si abbia a disposizione un primer complementare a uno dei due filamenti che funga da innesco per la reazione di sintesi. In tal caso il DNA va denaturato prima della reazione Se la molecola è clonata in un vettore, si possono utilizzare sequenze del vettore stesso che si trovano a monte e a valle del polylinker (primer universali: T3, T7 SP6). Se il DNA è amplificato per PCR, si può utilizzare come innesco uno dei due primer utilizzati nell amplificazione (primer specifici)
Il sequenziamento automatico del DNA
Ogni dideossinucleotide è marcato con un diverso colorante fluorescente in modo che i frammenti di DNA terminati da differenti ddntp emetteranno fluorescenza ad una diversa lunghezza d onda
Il vantaggio principale del sequenziamento automatico è la rapidità poiché gli attuali sequenziatori: 1. utilizzano dei capillari di vetro sottili che permettono di caricare e analizzare 96 campioni simultaneamente 2. sono sistemi automatizzati. Tutti i sequenziatori automatici posseggono programmi per l analisi dei dati ottenuti: convertono i segnali di fluorescenza in sequenza di DNA Elettroferogramma
Accuratezza della sequenza La lunghezza massima che si può sequenziare con una singola reazione è di circa 1000 nucleotidi, tuttavia dopo le prime 400 basi la frequenza di errori aumenta. L accuratezza media per ogni singola corsa è del 98-99 %. Per migliorare il grado di accuratezza è necessario sequenziare più volte la stassa regione di DNA, preferibilmente da cloni diversi
SEQUENZIAMENTO DI INTERI GENOMI E IL PROGETTO GENOMA UMANO
Obiettivi del Progetto Genoma Umano 1 Ottobre 1990 Determinare la sequenza dell intero genoma umano e di altri organismi comunemente usati negli studi genetici Identificare tutti i geni umani Immagazzinare le informazioni in banche dati pubbliche Sviluppare strumenti per l analisi dei dati Affrontare aspetti di ordine etico, legale e sociale che potrebbero sorgere dalla realizzazione del progetto genoma
..con il progetto genoma umano nasce la GENOMICA Genomica strutturale per mappare e sequenziare interi genomi Genomica funzionale per analizzare la funzione dei geni e delle sequenze non geniche Genomatica comparativa per confrontare i genomi interi di specie diverse
Sequenziamento di interi genomi con il metodo shotgun Per genomi di piccole dimensioni (virali e batterici) Per genomi più complessi (eucarioti superiori) Costruzione di una genoteca con frammenti casuali e parzialmente sovrapponibili Sequenziamento casuale dei cloni Assemblaggio delle sequenze contigue con sofisticati software
Banche dati di sequenze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.ensembl.org/
MUTAGENESI MIRATA
Mutagenizzare vuol dire introdurre mutazioni nella sequenza nucleotidica di un gene o di una sequenza regolativa. Le mutazioni che vengono introdotte più frequentemente in una molecola di DNA quando si lavora in vitro sono sostituzioni, delezioni e inserzioni di singoli o pochi nucleotidi. Perché mutagenizzare? 1) Per effettuare analisi funzionali dei geni e delle sequenze regolative 2) Per modificare le proteine
Mutagenesi a cassetta Mutagenesi per estensione di un primer Mutagenesi per PCR
Mutagenesi a cassetta Vantaggio: efficienza di mutagenesi vicina al 100% Svantaggio: necessità di siti unici di restrizione ai lati della regione da mutagenizzare
Mutagenesi per estensione di un primer Svantaggi Il DNA deve essere a singolo filamento Efficienza di mutagenesi bassa (~10%) per selezione negativa della molecola mutata non metilata da parte del sistema cellulare di riparo del DNA I saggi per il riconoscimento dei fagi mutanti sono laboriosi
Mutagenesi per PCR Vantaggio: efficienza di mutagenesi vicina al 100% Svantaggio: bassa fedeltà replicativa delle Taq polimerasi