Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine

Università degli Studi del Piemonte Orientale A. Avogadro CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE ALIMENTARE Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine Dott.ssa Patrizia Cesaro

Gli Organismi Geneticamente Modificati sono BATTERI, FUNGHI, VIRUS, PIANTE e ANIMALI le cui caratteristiche genetiche sono state modificate in laboratorio. In genere UNO O PIÙ GENI PRESI DA ALTRI ORGANISMI vengono introdotti nel patrimonio ereditario dell organismo (DNA) che si vuole modificare (Definizione giuridica in Direttiva 2001/18/CE). IL GENE/I INSERITO CODIFICA PER UN TRATTO DI PARTICOLARE INTERESSE Le applicazioni degli OGM investono gli ambiti più disparati; la MEDICINA, L'ECOLOGIA, IL SETTORE AGRO-ALIMENTARE e ZOO-TECNICO. Meno conosciuto, ma molto importante dal punto di vista medico, è il loro utilizzo in campo farmaceutico, dove hanno consentito la produzione di vaccini sicuri.

Il DNA è la sede dell informazione genetica È presente nel nucleo di ogni cellula È identico per ogni cellula dello stesso organismo Successione di nucleotidi contenti le basi azotate A, T, C e G Numero di geni variabile a seconda dell organismo Diversi livelli organizzazione

TUTTE LE PIANTE OGGI COLTIVATE SONO GENETICAMENTE MODIFICATE o GENETICAMENTE MIGLIORATE Il principale obiettivo del miglioramento genetico delle piante coltivate è quello di ottenere varietà con caratteristiche PRODUTTIVE, QUALITATIVE e di RESISTENZA AGLI STRESS migliori di quelle varietà già disponibili sul mercato. METODOLOGIE USATE: incrocio SELEZIONE mutagenesi (uso di radiazioni che provocano mutazioni) SELEZIONE trasferimento genico SELEZIONE

COMPONENTI DI UN COSTRUTTO O CASSETTA DI ESPRESSIONE PER OTTENERE PIANTE GM promotore GENE terminatore ELEMENTI REGOLATORI DELLA TRASCRIZIONE E TRADUZIONE: - promotore e terminatore - sito di legame per il ribosoma GENE: - gene di interesse - gene reporter - marcatore di selezione

METODI PER IL RILEVAMENTO DEGLI OGM NEGLI ALIMENTI (DETECTION) 1. RICERCA DELLE PROTEINE 2. ANALISI DEL DNA Qualunque sia la tecnica utilizzata, per garantirerisultati affidabili è necessario ottimizzarne vari aspetti legati alla qualità: PROCEDURE, REAGENTI e STRUMENTAZIONE. Risulta pertanto di cruciale importanza la VALIDAZIONE dei metodi.

TANTO PIU UN PRODOTTO E GREZZO TANTO PIU E FACILE ISOLARE ED ANALIZZARE L ANALITA

Limite consentito <1% (10 volte superiore al limite di rilevabilità 0,1%, che rappresenta la più bassa soglia scientificamente difendibile per la quantificazione di materiale OGM) 3 motivi: STATISTICA (0,1% la variabilità delle ripetizioni è statisticamente accettabile) TECNICA (0,1% per evitare errori tecnici dovuti al limite di sensibilità di un metodo che in realtà è 0,01%) CAMPIONAMENTO (una quantificazione affidabile al 0,1% richiede almeno 10000 fagioli di soia, 2,5kg, se si scende a 0,01% occorrerebbero 25kg di grani)

CAMPIONAMENTO Gli schemi per il campionamento degli OGM si basano sulle procedure utilizzate per l analisi delle micotossine. La direttiva 98/53 (Direttiva 98/53/CE del 16 luglio 1998, GUCE L 201 del 17/7/1998, pag. 93) riguardante il campionamento e l analisi di alcuni contaminanti negli alimenti è stata la prima linea guida di campionamento per gli OGM ed è oggi ancora utilizzata, ma ce ne sono altre più recenti. Il materiale OGM NON ha una distribuzione omogenea, di conseguenza la rappresentatività del campionamento sta alla base di tutta l analisi. Per questo è indispensabile effettuare il prelievo in modo ACCURATO, cercando di CAMPIONARE DIVERSI PUNTI DEL PRODOTTO.

Come si eseguono le analisi? Tre livelli: - RILEVAMENTO (presenza/assenza OGM) - IDENTIFICAZIONE (dell evento di trasformazione) - QUANTIFICAZIONE (determinazione %) campione RILEVAMENTO negativo positivo IDENTIFICAZIONE È autorizzato? < 1% no etichetta > 1% etichetta obbligatoria QUANTIFICAZIONE sì no È ILLEGALE

Metodi basati sulla RICERCA DELLE PROTEINE Il transgene codifica per una PROTEINA Metodi con un basso LIVELLO TECNOLOGICO si tratta di: saggi immunologici BASATI SUL RICONOSCIMENTRO ANTIGENE- ANTICORPO che consentono analisi qualitative e quantitative in cui l analita deve essere conosciuto Western blot ELISA Lateral flow assay Limiti: - localizzazione della proteina - le proteine non devono essere degradate USATI PER IL CONTROLLO DI SEMENTI E MATERIE PRIME

IL LATERAL FLOW ASSAY Basso costo Facilità di esecuzione NON QUANTITATIVO

Lateral Flow Strip Protocol 1 2 3 1. Punch leaf disc 2. Add buffer and grind in tube 3. Insert flow strips for testing

OGM Sì OGM No

Limite detection 1seme/1000 semi

TEST ELISA Analisi quantitativa, alta sensibilità, economico Ideale per analisi di laboratorio Sono processabili + campioni contemporaneamente Possibilità di automatizzare il saggio Disponibili kit commerciali Sono necessarie proteine NON denaturate Provette singole o piastre multipozzetto Enzyme-labelled Antiantibody antibody antibody specific to antigen well Colour Response Concentration Dependent Blocking protein Antigen

TEST ELISA: PRINCIPIO del Sandwich

TEST ELISA: PRINCIPIO

Western Blotting Test QUALITATIVO altamente specifico usato in ricerca

Metodi basati sulla RICERCA DEL DNA Metodi con un MEDIO-ALTO LIVELLO TECNOLOGICO basati su: Polymerase Chain Reaction (PCR end point, PCR quantitativa), ibridazione con sonde (Southern blot, microchip GMO) RILEVAMENTO GENERICO: si utilizzano primers o sonde specifici per sequenze molto usate per la costruzione di OGM (p35s CaMV, tnos3 A. tumefaciens, ecc.). RILEVAMENTO SPECIFICO: si utilizzano primers o sonde per lo specifico evento di trasformazione (transgene).

campione estrazione DNA Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta) negativo RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) positivo È autorizzato? IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) QUALITATIVA no sì ILLEGALE QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa) < 1% no etichetta > 1% etichetta obbligatoria

Per una buona riuscita dell analisi sono importanti: 1. CAMPIONAMENTO 2. PREPARAZIONE dell ANALITA (estrazione e purificazione) 3. ANALISI QUALITATIVA e QUANTITATIVA dell ANALITA L OBIETTIVO PRIMARIO DEI METODI DI ESTRAZIONE È QUELLO DI OTTENERE DNA CON IL PIÙ BASSO LIVELLO DI DEGRADAZIONE POSSIBILE Es.: ESTRAZIONE DNA 2. Preparazione dell analita: metodi di estrazione: CLASSICI (CTAB) COMMERCIALI (resine brevettate) COMBINATI 3. Analisi qualitativa e quantitativa del DNA: lettura allo spettrofotometro (260 e 280 nm) Quantità: 1 unità assorbanza 260nm = 50 µg ds DNA/ml Qualità (purezza): rapporto assorbanza 260nm/280nm (1,7-1,9)

METODI DI RILEVAMENTO GENERICO E SPECIFICO Southern Blot M +ve -ve Frammentazione del DNA dell OGM mediante digestione enzimatica corsa e separazione dei frammenti su gel d agaroso trasferimento del DNA su membrana di nilon incubazione con la sonda molecolare sviluppo mediante autoradiografia M M P 32 labelled probe

PCR end-point

Rendimento teorico di molecole di DNA che si formano a partire da una singola molecola stampo: N molecole finali = N x 2 C N= n di molecole iniziali C= n cicli

PCR FRAGMENT CONFIRMATION FALSI NEGATIVI: amplificazione di un gene di pianta per verificare la presenza del DNA nel campione analizzato FALSI POSITIVI: - digestione enzimatica dell amplificati - ibridazione con sonde specifiche (southern blot) - sequenziamento - PCR con primers interni al frammento amplificato (NESTED PCR)

ESEMPIO: RICERCA SOIA GM Primer per le-1 118bp Primer per transgene 169bp

campione estrazione DNA Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta) negativo RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) positivo È autorizzato? IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) QUALITATIVA no sì ILLEGALE QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa) < 1% no etichetta > 1% etichetta obbligatoria

METODI DI QUANTIFICAZIONE: LA REAL TIME PCR COS È: è una reazione PCR che può essere seguita in tempo reale (mentre avviene); la quantità di DNA che si sintetizza può essere misurata ad ogni ciclo PCR La crescita esponenziale è limitata Segue una crescita lineare Il plateau non è correlato alla quantità iniziale del DNA teoria pratica La REAL TIME PCR misura il DNA ad ogni ciclo PCR misura il DNA end-point (saturazione)

PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Incremento di fluorescenza Plot lineare

Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time LA FLUORESCENZA SI GENERA DURANTE LA PCR PER EFFETTO DI DIVERSE POSSIBILI REAZIONI CHIMICHE Le chimiche principali sono basate: sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano in modo aspecifico nella doppia elica di DNA (SYBR Green); sia sull'ibridazione di sonde specifiche per il frammento di interesse marcate con molecole fluorescenti (Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons, Scorpion, sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer))

Curve di amplificazione Fluorescenza Plot lineare Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di templato iniziale

Plot di amplificazione Normalised reporter fluorescence (R n ) Linea soglia scelta d a l l o p e r a t o r e In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale Indica il valore al di sopra del quale inizia l accumulo di un amplificato PCR cycle number E il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della linea soglia (Threshold)

Analisi tramite software

DNA DI RIFERIMENTO (STANDARD) STANDARD COMMERCIALI OGM 0% OGM È necessario produrre almeno 5 diluizioni dello stesso standard allo scopo di costruire una curva standard I campioni da determinare vengono affiancati agli standard ed ai controlli NEGATIVI (H 2 O) È necessario produrre almeno 3 repliche sia per ogni campione sia per gli standard per aumentare l affidabilità del risultato

STANDARD DI RIFERIMENTO Un CALIBRATORE è una qualsiasi matrice da cui si ottiene un DNA a percentuale nota di transgene con cui vengono costruite le curve di taratura. Viene di norma utilizzato Materiale di Riferimento Certificato (CRM) a percentuale nota di OGM (w/w); si tratta di farine a granulometria finissima e controllata, preparate da Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM, Belgio) e commercializzate dalla ditta Fluka. Sono disponibili in commercio per l analisi quantitativa farine standard a contenuto di OGM pari a 0%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5% per i principali eventi transgenici.

CURVA STANDARD La retta di regressione deve avere un coefficiente correlazione il più possibile vicino a 1 e un valore di pendenza il più possibile vicino a 3,322. La pendenza della retta è indice dell efficienza di reazione

Quantificazione con METODO DELLA CURVA STANDARD La quantità di DNA dei campioni deve essere compresa all interno della curva degli standard per un calcolo affidabile Ct 35 25 15 10 1 10 2 10 unknown sample 3 3500 copies 10 4 10 5 10 6 10 7 1 2 3 4 5 6 7 log 10 quantity

gene endogeno transgene

Kit commerciali basati sulla tecnica PCR

campione estrazione DNA Verifica DNA estratto (PCR end-point con primers universali per geni di pianta) negativo RILEVAMENTO GENERICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) positivo È autorizzato? IDENTIFICAZIONE - rilevamento SPECIFICO (PCR end-point, ibridazione con sonde) QUALITATIVA no sì ILLEGALE QUANTIFICAZIONE (PCR quantitativa) < 1% no etichetta > 1% etichetta obbligatoria

LA TECNOLOGIA E LA RICERCA VANNO AVANTI Sono disponibili NUOVI METODI SEMPRE PIU SOFISTICATI E PRECISI: Biosensori Microarray Chip. MA OCCORRE LA LORO VALIDAZIONE