EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2. Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM) 3. Analisi del DNA in medicina legale (es. Test di paternità) 4. Diagnosi pre-natale di malattie genetiche (es. Anemia falciforme, Distrofia di Duchenne, talassemia) 5. Diagnosi di malattie tumorali (es. Linfoma) 6. Clonaggio e sequenziamento di prodotto PC 1 2 PINCIPALI TIPI DI PC a) T-PC: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mna da esso trascritto PC COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o NA attraverso l amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse. 3 PINCIPALI TIPI DI PC b) NESTED PC: serve ad ottenere una maggiore MULTIPLEX PC: consente di amplificare PC EAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PC 4 PINCIPALI TIPI DI PC a) T-PC: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mna da esso trascritto PC ASIMMETICA: serve ad ottenere DNA a singolo filamento utilizzando uno dei due inneschi in quantità molto ridotta rispetto all altro ADIPOCITA, normale OSTEOCITA, normale Profili di espressione genica Nella cellula di un tessuto sono presenti tutti i geni del genoma, ma solo quelli caratteristici di un tessuto sono attivi. Il profilo di espressione genica o pattern di espressione è l insieme dei geni attivati in un tessuto. In figura è riportato un esempio di due cellule normali appartenenti a tessuti diversi: sebbene contengano mna e proteine comuni (geni costitutivi), ciascuna di esse ha mna e proteine peculiari (rappresentate con colori diversi). 5 6 1
OSTEOCITA normale OSTEOCITA tumorale Profili di espressione genica nei tumori E possibile misurare le differenze tra un tessuto normale ed uno tumorale dello stesso tipo, analizzandone l espressione genica. Mentre cellule normali di uno stesso tessuto presentano un identico profilo di espressione, quando insorge un tumore tale profilo varia. Le alterazioni dell espressione genica possono causare variazioni nella produzione delle proteine o nella loro reciproca interazione. Proteine fondamentali potrebbero non essere più disponibili, altre essere prodotte in eccesso. Le cellule tumorali derivano quindi da una combinazione di più variazioni a livello MISUA DEL LIVELLO DI ESPESSIONE (TASCIZIONE) DI UN GENE: T-PC Per misurare il livello di mna trascritto da un determinato gene e quindi avere indicazioni sul suo livello di espressione (es. tessuto, organo, batteri, cellule in coltura, etc.) è necessario: 1) Estrarre l NA totale dal campione biologico che si vuole esaminare 2) Trasformare il pool di NA (che conterrà anche l mna trascritto dal gene di interesse) in cdna tramite la reazione di trascrizione inversa 3) Evidenziare il cdna di interesse tramite la reazione di PC utilizzando una coppia di primers specifici. genico e proteico. 7 8 TASCIZIONE INVESA (oligo dt) T-PC=EVESE TANSCIPTASE PC Esameri ANDOM La T-PC amplifica un NA convertendolo prima in cdna (o DNA complementare all NA) tramite l enzima trascrittasi inversa, e poi amplificandolo tramite PC con inneschi specifici per la sequenza di interesse. 1. La reazione di TASCIZIONE INVESA consente di produrre una molecola di cdna (DNA complementare) a partire da mna (NA messaggero). 2. L enzima che catalizza questa reazione è la trascrittasi inversa, una DNA polimerasi NAdipendente. 3. uesto enzima è stato inizialmente identificato nei retrovirus (ad esempio il virus HIV). 4. Le due trascrittasi inverse più utilizzate in laboratorio sono la AMV (isolata dall Avian Myeloblastosis Virus) e la MoMLV (isolata dal Moloney Murine Leukemia Virus). 5. Il pool di cdna ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa è utilizzato per misurare 9 il livello di espressione di un gene mediante la tecnica PC La T-PC viene utilizzata, ad esempio, per valutare il livello di espressione di un gene misurando la quantità di mna da esso trascritto. La trascrittasi inversa viene utilizzata dai retrovirus (o virus ad NA, es HIV). 10 ANALISI SU GEL DI AGAOSIO DI PODOTTI DI T-PC β-actina 500 bp AT1 306 bp PINCIPALI TIPI DI PC a) T-PC: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mna da esso trascritto PC COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o NA attraverso l amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse. 11 12 2
PC COMPETITIVA PC COMPETITIVA La sequenza in esame (es. genoma virale) viene amplificata insieme ad una sequenza nucleotidica che funge da controllo interno (standard) e che possiede un elevata omologia con la sequenza del DNA virale. Nella reazione di coamplificazione si avrà competizione tra la sequenza bersaglio ed il controllo interno: utilizzando concentrazioni scalari note del controllo interno sarà possibile risalire alla quantità di acido nucleico (virus) presente nel campione. Controllo interno bersaglio INCOGNITO 13 14 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 15 16 PINCIPALI TIPI DI PC b) NESTED PC NESTED PC: serve ad ottenere una maggiore MULTIPLEX PC: consente di amplificare PC EAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PC 1 a PC 2 a PC Amplificato 1 100 bp Amplificato 2 65 bp Il vantaggio di questa reazione e di aumentare la specificita e la sensibilita dell amplificazione. 17 18 3
PINCIPALI TIPI DI PC b) MULTIPLEX PC NESTED PC: serve ad ottenere una maggiore MULTIPLEX PC: consente di amplificare PC EAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PC 19 20 DNA PINCIPALI TIPI DI PC b) NESTED PC: serve ad ottenere una maggiore MULTIPLEX PC: consente di amplificare PC EAL TIME: consente sia di monitorare in tempo reale l andamento della reazione di PC eal Time PC Tecnica che consente di monitorare in tempo reale l andamento di una reazione di amplificazione Tecnica basata sulla fluorescenza:l emissione di fluorescenza è direttamente correlata alla quantità di DNA amplificato. 21 22 Curva di amplificazione halogen tungsten lamp excitation filters PIASTA CAMPIONI filters intensifier detector 350,000 pixels uantità di DNA Theoretical eal Life 23 www.biorad.com Numero di cicli 24 4
PC: Curve di amplificazione Exponential phase Plateau phase 25 26 Cos è il ciclo soglia Ct? appresenta il ciclo di ciascuna reazione di amplificazione in corrispondenza del quale la fluorescenza del campione supera un valore soglia Cos è il ciclo soglia Ct? Strettamente correlato con la quantità iniziale di DNA stampo 2 1,6 1,2 0,8 Threshold Baseline Sample ual è il primo? ual è l ultimo? 0,4 C T 0 0 10 20 21 30 40 27 28 Come quantizzare un campione di DNA Standard curve 29 30 5
eal Time PC CHIMICA utilizzata Agenti intercalanti EtBr (bromuro di etidio) SYB Green, agente intercalante dotato di una maggiore sensibilità (200 volte più sensibile) 31 32 Agenti intercalanti Agenti intercalanti Primers d. NTPs Intercalation Dyes Thermal Stable DNA Polymerase Estensione Denaturazione Annealing 33 34 Man Probes Donor dye (eporter) Acceptor dye (uencher) halogen tungsten lamp filters intensifier detector 350,000 pixels Sonda (probe) libera in soluzione Energy transfer Probe and primers legano il bersaglio excitation filters Emission PIASTA CAMPIONI 35 www.biorad.com 36 6
Man Probes Donor dye (eporter) Acceptor dye (uencher) Sonda (probe) libera in soluzione Energy transfer Probe and primers legano il bersaglio Emission 37 38 Man TM probe Man TM PIMA DEL TAGLIO Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Probe eaction Tube DOPO IL TAGLIO Denaturation 39 Annealing 40 Man TM Extension Step 1. Strand Displacement 2. Cleavage 3. Polymerization Complete 4. Detection 41 42 7