Analisi quantitativa dell interazione proteina-proteina

Analisi quantitativa dell interazione proteina-proteina

Legame recettore-ligando (proteina-proteina) Il legame per il ligando deve essere: reversibile ad alta affinità saturabile deve portare ad una risposta fisiologica specifica la concentrazione di ligando alla quale il legame è saturabile deve essere compatibile con la concentrazione fisiologica del ligando analoghi del ligando in grado di legare il recettore devono indurre in vivo gli stessi effetti fisiologici Recettore + Ligando k on k off Recettore-Ligando risposta

Recettore + Ligando k on Recettore-Ligando risposta k off k on e k off sono le costanti cinetiche di associazione e di dissociazione. La velocità di associazione è data da V on = k on [Ligando] [Recettore] La velocità di dissociazione del complesso è data da V off = k off [RecettoreLigando]

All equilibrio avremo: V on = V off [L] [R] k on = [RL] k off riarrangiando [L] [RL] [R] = k off k on = K d K d = [R] [L] [RL] ponendo [L] = K d [R] [RL] = 1 [R] = [RL] K d è la concentrazione di ligando alla quale metà dei siti di legame è occupata

[RL] = Essendo [R] = [R tot ] - [RL] [R] [L] K d = ([R tot] - [RL]) [L] K d [RL] K d = [R tot ] [L] - [RL] [L] [RL] K d + [RL] [L] = [R tot ] [L] [RL] (K d + [L]) = [R tot ] [L] [RL] = K d = [R] [L] [RL] [R tot ] [L] K d + [L] Questa equazione consente di determinare la K d misurando [RL] a diverse concentrazioni di ligando [L] quando [L] >> [R tot ], ovvero quando [L] [L tot ]

[LR]μM [L]μM [LR]μM [L]μM semilogaritmico

Un altra trasformazione lineare che viene usata frequentemente è l equazione di Schatchard [ LR] [ L] [ Rt ] [ LR] K K d d che consente una stima grafica della K d

Analisi di Scatchard Partendo dall equazione: [RL] = [ R tot ] [L] K d + [L] [RL] ([L] + K d ) = [L] [R tot ] [RL] [L] + [RL] K d = [L] [R tot ] dividendo tutto per [L] K d avremo: [RL] [L] [RL]K d [ R tot ] [L] + = [L] K d [L] K d [L] K d

quindi: [RL] [L] = [ R tot ] K d - [RL] K d Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL]; con n [R tot ] cioè il numero dei siti recettoriali con F la quantità di ligando libero [L] avremo: B F = _ B + K d Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato e ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B) avremo: n K d

B/F B F = _ B + K d n K d 1.00 0.75 0.50 0.25 n Si ottiene una retta con 0.00 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 B pendenza = - 1 K d L intercetta sull asse delle ascisse (B/F = 0) permette di ricavare n che rappresenta la densità recettoriale.

Effetti della concentrazione di L e di R Per ottenere risultati attendibili è importante misurare [RL] quando [L] è vicina alla K d I valori sono accurati quando [R tot ] << [L tot ] e << K d, quindi [L tot ] è quasi uguale a [L] Il saggio di legame dovrebbe essere sufficientemente sensibile da permettere di usare concentrazioni di L e/o R tra 0.1 e 10 K d.

Effetti della concentrazione di L e di R Se invece il saggio di legame viene eseguito in condizioni in cui [R] = [L] è necessario sostituire nell equazione [L] = [L tot ] [RL] quindi riarrangiando [RL] = [R tot ] [L] K d + [L] [RL] = [R tot ] ([L tot ] [RL]) K d + ([L tot ] [RL]) K d [RL] + [L tot ] [RL] [RL] 2 = [R tot ] [L tot ] [R tot ] [RL]

Effetti della concentrazione di L e di R [RL] 2 (K d + [R tot ] + [L tot ]) [RL] + [R tot ] [L tot ] = 0 Questa è un equazione di secondo grado ax 2 + bx + c = 0 che si risolve con la formula x = - b ± (b 2 4ac) 2a [RL] = (K d + [R tot ] + [L tot ]) - (K d + [R tot ] + [L tot ]) 2 4[R tot ] [L tot ] 2

TECNICHE PER LO STUDIO DEL LEGAME RECETTORE-LIGANDO La capacità di analizzare quantitativamente un equilibrio di legame dipende dalla possibilità di distinguere tra recettore libero e legato (o ligando libero e legato) e quindi poter misurare almeno uno tra L, R e RL

Metodi senza separazione fisica del ligando legato da quello libero L attacco del ligando al recettore deve cambiare una proprietà misurabile di L e/o di R Spettroscopia di assorbimento (alterazione coefficiente di estinzione, spostamento picchi di assorbimento) Spettroscopia di fluorescenza (alterazione dell intensità o della lunghezza d onda di emissione) fluorescenza intrinseca (triptofano) marcatura con sonde fluorescenti (fluorofori)

Variazioni spettrali osservate in seguito all aggiunta di concentrazioni crescenti di L ad una concentrazione fissa di R. Pannello A. Lo spettro di assorbimento mostrato in grassetto è quello di R in assenza di ligando. Gli spettri successivi sono stati acquisiti in seguito all aggiunta di concentrazioni crescenti di L. All aumento della concentrazione di L si osserva la diminuzione della banda di assorbimento della proteina, che per la presenza del cofattore ha un massimo a 350 nm. A questa diminuzione corrisponde un aumento di una banda con un massimo di assorbimento a 440 nm, dovuta alla formazione del complesso RL. Pannello B. Il grafico mostra l andamento dell assorbanza a 350 nm (simboli circolari aperti) e a 440 nm (simboli circolari chiusi) misurata in funzione della concentrazione di L.

A volte però, queste tecniche non possono essere applicate e quindi non è possibile una misurazione diretta del legame. In questi casi, vengono usate tecniche in cui, dopo il raggiungimento dell equilibrio, si può misurare separatamente almeno uno tra L, R ed LR. In genere si usano ligandi marcati radioattivamente ad alta attività specifica 125 I 2200 Ci/mmole 3 H 2-20 Ci/mmole 14 C 0.05-0.5 Ci/mmole

Metodi di separazione del ligando libero dal ligando legato al recettore Centrifugazione Dialisi all equilibrio Gel-filtrazione Ultrafiltrazione Adsorbimento Precipitazione Immunoprecipitazione Cromatografia di affinità

Dialisi all equilibrio RL + L L

Metodo Quantità misurata Vantaggi Svantaggi Filtrazione e ultrafiltrazione RL, L libero Rapido, molte repliche Non può essere usato se il t 1/2 del complesso è meno di 15 sec Dialisi all equilibrio RL + L libero, L libero Metodo all equilibrio Lento Gel-filtrazione RL Adatto per recettori solubili Lento Precipitazione con PEG RL, L libero Adatto per recettori solubili, la separazione può essere effettuata per filtrazione o centrifugazione Non utilizzabile se R e L sono proteine e entrambe precipitano con PEG Tutti questi metodi di separazione sono efficaci se c è una elevata differenza di peso molecolare tra il recettore e il ligando

Studi di binding Analisi di saturazione: Studio del grado di saturazione del recettore all equilibrio a diverse concentrazioni di ligando Analisi cinetica: Studio della cinetica di associazione e di dissociazione del ligando e del recettore come funzione della concentrazione Cinetica di associazione Cinetica di dissociazione

Approccio sperimentale all analisi di saturazione Si determina il Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti concentrazioni di ligando (radiomarcato). Binding Totale Si ottiene aggiungendo quantità crescenti di radioligando ad una determinata concentrazione di recettore Binding Non-Specifico Si ottiene aggiungendo ligando non marcato ad una concentrazione alla quale tutto il ligando radioattivo viene spiazzato dai siti specifici di legame

Bound (pmol/mg protein) Bound (pmol/mg protein) 0.15 0.10 Binding totale Binding non specifico Binding specifico 0.05 0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 [ * L], (nm) 0.100 Visualizzando solo la curva del binding specifico possiamo individuare la K d e la Rtot 0.075 0.050 0.025 K d Rtot 0.000 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 [ L], (nm)

Se è presente un solo tipo di recettore il grafico di Scatchard sarà lineare. Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale concentrazione ma con differenze in K d per il ligando avremo: Scatchard plot Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro, in nero la curva somma del binding totale.

Analisi di competizione Il binding di competizione viene effettuato per determinare la capacità di un ligando L2 di competere con un ligando L1 per un dato recettore. Viene utilizzata una concentrazione fissa di ligando marcato L1 e di recettore. Il sistema viene portato all equilibrio e viene misurata la concentrazione di complesso L1R in presenza di concentrazioni differenti di ligando L2 non marcato.

% spiazzamento 8-OH-DPAT IC 50 = 3.02 nm Composto 1 IC 50 = 20.6 nm 0 50 100 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 Log dose Il valore di IC 50 indica la concentrazione di ligando L2 in grado di spiazzare il 50% di radioligando L1 dal recettore all equilibrio

Analisi cinetica Cinetica di associazione L esperimento cinetico di associazione viene effettuato per determinare la costante di velocità di associazione k on. La quantità di complesso RL aumenta nel tempo fino ad un valore massimo che è pari alla quantità di binding specifico (Y max ) all equilibrio per quella concentrazione di ligando.

cpm 7500 Ymax 5000 2500 0 0 10 20 30 tempo (ore) Costante di velocità di associazione k on (min -1 M -1 ).

Binding specifico Cinetica di dissociazione Binding non specifico tempo Si porta il sistema recettore-radioligando all equilibrio e poi si aggiunge il ligando freddo ad una concentrazione elevata, misurando la concentrazione di complesso a diversi intervalli di tempo. Costante di velocità di dissociazione k off (min -1 ).