TNF-alpha high sensitivity ELISA

Istruzioni per l Uso TNF-alpha high sensitivity ELISA Dosaggio immunoenzimatico (strisce di micropiastra) per la determinazione quantitativa di TNF-alpha nel siero, plasma e supernatanti di colture cellulari umani. BE58351 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. PRINCIPIO DI REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE 5 5. REAGENTI FORNITI 5 6. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 6 7. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 6 8. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 6 9. PRECAUZIONI PER L USO 7 10. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 8 11. PROCEDURA DEL TEST 11 12. CALCOLO DEI RISULTATI 14 13. LIMITI DELLA PROCEDURA 16 14. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 17 15. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 18 16. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 19 17. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 21 05.06.2013 (26) 1/22

1. Uso Previsto Il TNFα umano ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato a enzimi per il rilevamento quantitativo del TNFα umano. Il TNFα humano ELISA è esclusivamente a uso della ricerca. Non si usa per procedure diagnostiche o terapeutiche. 2. Sommario Il TNF-α è una citochina multifunzionale coinvolta in molti pathway differenti, nell omeostasi e nella patofisiologia dei mammiferi. Può presentare effetti biologici contrapposti, il che suggerisce meccanismi regolatori complessi. Il TNF-α, conosciuto anche come cachectina, fu rilevato per la prima volta come fattore citotossico che induce la lisi di alcune cellule tumorali. Il gene TNF-α è un membro di tipo 2 della superfamiglia TNF (consistente di almeno 20 membri distinti). Il rilascio di TNF-α è principalmente innescato da infezioni virali, endotossine, lipopolisaccaridi o altre componenti batteriche, lesioni ai tessuti, danni al DNA e da IL-1, PDFG e dallo stesso TNF-α. Si esprime principalmente nei macrofagi, ma anche nei monociti, nei neutrofili, nelle cellule NK, nei mastociti, nelle cellule endoteliali e nei linfociti attivati. L espressione del TNF-α nelle cellule endoteliali può essere indotta dall IL-17. L espressione di altre citochine, chemochine, intermedi reattivi dell ossigeno, ossido nitrico e prostaglandine è stimolato dal TNF-α. Il TNF-α inizialmente legato ad una membrana è clivato enzimaticamente dal TACE (= ADAM17). I monomeri solubili si aggregano agli omotrimeri e vengono segreti nel sangue e in altri fluidi biologici. La forma legata alla membrana e quella solubile sono biologicamente attive e si legano ai recettori del TNF TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) e TNFR2 ( = TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80). Legandosi al ligando i recettori formano dei trimeri che portano a cambiamenti nella conformazione, dissociazione delle proteine (SODD = domini silenziatori di morte, BAG4, atanogene 4 associato a Bcl-2) ed associazione delle proteine (TRADD = proteina dei domini di morte associata al TNF-R1) e che inducono le seguenti attività biologiche: - trascrizione di fattori anti-apoptotici e proteine coinvolte nella proliferazione delle cellule ed infiammazione tramite il legame tra TRAF2 (fattore 2 associato a TNF-R) e RIPK1 (serin-treonin chinasi 1 interagenti con TNF-R) ed attivazione del fattore di trascrizione NF-ĸB. - proliferazione, differenziazione ma anche apoptosi delle cellule tramite legame con TRAF2, attivazione delle chinasi, attivazione di c-jun ed ATF2 (la via delle JNK-MAPK). - apoptosi tramite il legame di FADD (proteina con dominio di morte che si associa a FAS) a TRADD ed attivazione di caspasi (inclusa caspasi 8 = FLICE). - necrosi, una morte cellulare indipendente dalla caspasi, mediata da ossidasi NADPH, che formano un complesso con TRADD e RIPK1 che porta alla generazione di specie dell ossigeno. Il TNF-R2 non contiene DD (dominio di morte), ma svolge la sua funzione tramite legame diretto con TRAF. Quindi, le molteplici funzioni biologiche di TNF-α comprendono la proliferazione e la differenziazione cellulare, la tumorigenesi, la morte apoptotica o necrotica delle cellule (includendo alcune linee di cellule tumorali), attività immunoregolanti, metabolismo dei lipidi, coagulazione e funzione endoteliale. Promuove un infiammazione locale o sistemica (il TNF-α è un potente pirogeno) e stimola il responso nella fase acuta. Espressioni molto alte di TNF-α post-infezione possono portare allo shock settico (il TNF-α è altamente citotossico), mentre livelli bassi sostenuti inducono cachessia ed infiammazione. Un alterazione del TNF-α è collegata a varie patologie: Cancro: Sono stati descritti diversi ruoli del TNF-α nel cancro, a seconda del tipo di tumore, del microambiente tumorale e dei livelli generali di espressione del TNF-α e della cinetica di espressione. E stato proposto un modello in base al quale livelli singoli molto alti di TNF-α portano alla regressione del tumore e che livelli cronici di basso dosaggio sono associati al progredire del tumore. Lupus eritematoso sistemico (SLE): Modelli murini di SLE presentano effetti contraddittori del TNF-α: effetto anti-immune a bassi livelli di TNF-α (la somministrazione di TNF-α porta ad un attenuazione dei sintomi e il blocco del TNF-α alla generazione di sintomi della SLE), effetti pro-infiammatori con livelli alti di TNF-α (il blocco del TNF-α smorzava la patologia). Infiammazione cronica intestinale (malattia di Crohn (CD), Malattia Infiammatoria Cronica Intestinale (IBD), Colite Ulcerosa (UC)): E stato dimostrato che c è un effetto essenziale dell attività del TNF-α / TNF-R1 sull induzione delle infiammazioni intestinali croniche. Nell IBD è stata descritta l aumentata espressione di TNF-α nei monociti/macrofagi del tessuto del tratto digerente e intestinale. 05.06.2013 (26) 2/22

Psoriasi: Nei pazienti psoriasici si è dimostrato che il TNF-α è aumentato sistemicamente e nel tessuto cutaneo. L espressione del TNF-α nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) era molto elevata in pazienti nella fase attiva della patologia ed elevata nella psoriasi cronica. In un modello animale si è dimostrato che per lo sviluppo della Psoriasi era essenziale un attivazione delle cellule T residenti dipendente dal TNF-α. Malattie polmonari (Fibrosi Cistica(CF), Asma): Nella fibrosi cistica sono stati rilevati livelli alti di TNF-α. Nell asma grave persistente si rileva un aumentata espressione del TNF-α. Nell asma allergica, con bassa esposizione agli antigeni, il TNF-α contribuisce ad un rilascio elevato di istamina. In un modello murino per l asma l infiammazione delle vie respiratorie è stata causata dall attivazione di fosfolipasi A2 mediata dal TNF-α. Artrite reumatoide (RE), Spondilite anchilosante (AS): Il TNF-α ha effetti stimolanti sulle proteasi degradanti la matrice (metalloproteinasi della matrice, MMPs), sul rimodellamento del tessuto e sugli osteoclasti, causando riassorbimento osseo con conseguente erosione delle articolazioni. In un modello murino per RA, si sono riscontrati livelli elevati di TNF-α nel midollo osseo. Si è dimostrato che le citochine, sintetizzate da cellule sinoviali attivate dal TNF-α, inducono RA. In pazienti AS si è dimostrato che la concentrazione di TNF-α era elevata nell articolazione sacro-iliaca. Il trapianto (malattia del trapianto contro l ospite, rigetto di allotrapianto): Nella ricerca sui trapianti la misurazione dei livelli di TNF-α è risultata utile. Nel rigetto di allotrapianto renale si è rilevato che il livello di TNF-α era molto elevato. Nei trapianti di midollo osseo (BMT) è stato provato che si verifica un aumento dei livelli di TNF-α. I pazienti di BMT con complicazioni correlate ai trapianti, come polmonite interstiziale e grave malattia del trapianto contro l ospite, hanno presentato un notevole aumento dei livelli di TNF-α. Aterosclerosi, calcificazione dei vasi arteriosi: A livelli di TNF-α circolante sono stati correlati: un maggior rischio d infarto del miocardio ricorrente, ispessimento aterosclerotico dell'intima media carotidea, disordini dell omeostasi dei trigliceridi e del glucosio ed aterosclerosi correlata all età. In animali con diabetes mellitus di tipo 2 i meccanismi indotti dal TNF-α portano ad un aumento dell accumulo di calcio nell aorta. Resistenza all insulina (IR) ed Obesità: Un aumentata espressione di TNF-α si è rilevata nel tessuto adiposo di modelli roditori per l obesità e negli individui adiposi. Nel tessuto adiposo e nell IRSi è rilevata un infiammazione cronica di basso grado. Livelli aumentati di TNF-α condizionano la regolazione del pathway dell insulina. Patologie neurodegenerative (Sclerosi Multipla (MS), Malattia di Alzheimer, Malattia da Prioni, Parkinson): Il TNF-α è prodotto da cellule microgliali attivate e causa degenerazione neuronale, apoptosi del tessuto neuronale e un aumento delle infiammazioni. La somministrazione di TNF-α ha causato la morte cellulare di oligodendrociti un sintomo della MS in co-colture con astrociti e cellule microgliali. 05.06.2013 (26) 3/22

3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-tnf-α umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Il TNF-α umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo TNF-α umano coniugato di biotina, che si lega con la TNF-α umano catturato dal primo anticorpo. Anticorpo di Rivestimento Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione, gli anticorpi TNF-α umano coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo TNF-α umano coniugato alla biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione, la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione reagente di amplificazione I (Tiramina- Biotina). Figura 4 Streptavidina-HRP - Terza Incubazione Biotinyl-Tyramide 05.06.2013 (26) 4/22

Dopo l incubazione il reagente di amplificazione I non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio e si aggiunge il reagente di amplificazione II (Streptavidina-HRP). Figura 5 Quarta Incubazione Streptavidin-HRP Dopo l incubazione, il reagente di amplificazione II, non legato, viene rimosso durante una fase di lavaggio e si aggiunge la soluzione del substrato reattiva all HRP. Figura 4 Quinta Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di TNF-α umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di TNF-α umano e si determina la concentrazione del campione di TNF-α umano. Figura 5 Substrato Reattivo 05.06.2013 (26) 5/22

4. Principio di Reazione di Amplificazione La reazione di amplificazione si basa sulla tecnologia Perkin Elmer Life Sciences TSA (Tyramide Signal Amplification/Segnale di Amplificazione della Tiramina). Il reagente di amplificazione I contiene Tiramina-Biotina. Il HRP converte molecole multiple di Tiramina- Biotina in derivati altamente reattivi (radicali liberi). Questi radicali liberi creano un legame covalente con qualsiasi proteina nel pozzetto. Quindi la quantità di Tiramina-Biotina è proporzionale alla quantità di HRP nel pozzetto. La Tiramina-Biotina non legata dopo l incubazione viene rimossa durante una fase di lavaggio. Il reagente di amplificazione II contiene Streptavidina-HRP, che si lega ai siti della biotina creatisi durante la reazione Tiramina-Biotina, moltiplicando così le molecole di HRP disponibili in superficie per la reazione del substrato. 5. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonale anti-tnf-α umano 1 flaconcino (100 µl) con Coniugato di Biotina (anticorpo policlonale anti-tnf-α umano) 1 flaconcino (150 µl) con Streptavidina-HRP 2 flaconcini con Standard anti-tnf-α umano liofilizzato, 1 ng/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino (12 ml) Diluente dei Campioni 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA) 1 flaconcino (7 ml) di Diluente di Amplificazione Concentrato (2x) 1 flaconcini (75 µl) di Reagente di Amplificazione I* 1 flaconcini (90 µl) di Reagente di Amplificazione II 2 flaconcini (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 8 Copripiastra adesivi * il reagente contiene alcool etilico 05.06.2013 (26) 6/22

6. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C ecetto gli controlli. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C, gli controlli a -20 C rispettativamente. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 7. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina). Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di TNF-α umano bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 14.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 8. Materiali necessair ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 10 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 05.06.2013 (26) 7/22

9. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a 121.5 C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido. 05.06.2013 (26) 8/22

10. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 10.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrado (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 25 475 1-12 50 950 10.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrado (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0 10.3. Preparazione di Coniugato di Biotina Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.03 2.97 1-12 0.06 5.94 05.06.2013 (26) 9/22

10.4. Streptavidina-HRP La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:400 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.015 5.985 1-12 0.030 11.970 10.5. Standard TNF-α Umano Ricostituire lo standard TNF-α umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 1000 pg/ml). Far ricostituire lo standard per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. Lo standard TNF-α umano concentrato dev essere diluito 1:25 con Diluente dei Campioni, subito prima di essere usato, in un tubo di plastica per test pulito, secondo il seguente schema di diluizione: 40 µl di standard TNF-α umano concentrato + 960 µl di Diluente dei Campioni. Agitare dolcemente per miscelare. (concentrazione dello standard = 40 pg/ml). La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 11) oppure nei tubi (vedi 10.5.1). 10.5.1. Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Diluente dei Campioni a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 40 pg/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 20 pg/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 8). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 8 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard 1:25 diluito TNF-α Umano Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl 05.06.2013 (26) 10/22

10.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 800 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Pre-diluire il controllo solubilizzato nel Diluente dei Campioni in rapporto 1:20: 50 µl di controllo + 950 µl di Diluente dei Campioni. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare il controllo ricostituito aliquotato a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. 10.7. Diluente di Amplificazione (1x) La preparazione del Diluente per Amplificazione (1x) è da farsi immediatamente prima dell uso. Fare una diluizione 1:2 del Diluente per Amplificazione (2x) concentrato, secondo le esigenze e secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Diluente di Amplificazione (2x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 3 3 1-12 6 6 10.8. Soluzione per Amplificazione I La preparazione della Soluzione per Amplificazione I dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. Fare una diluizione 1:300 del Reagente I per Amplificazione nel Diluente per Amplificazione (1x), come necessario, secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Reagente di Amplificazione I (ml) Diluente di Amplificazione (1x) (ml) 1-6 0.02 5.98 1-12 0.04 11.96 Eliminare immediatamente tutte le Soluzioni per Amplificazione I pre-diluite dopo l uso. 10.9. Soluzione per Amplificazione II La preparazione della Soluzione per Amplificazione II dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. Preparare una diluizione 1:200 del Reagente per Amplificazione II nel Tampone di Dosaggio (1x) come necessario, secondo lo schema seguente: Numero di Strisce Reagente di Amplificazione II (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.03 5.97 1-12 0.06 11.94 05.06.2013 (26) 11/22

11. Procedura del Test Poiché questo test ELISA è un sistema estremamente sensibile, per ottenere risultati ottimali del test è assolutamente necessario attenersi con la massima precisione alle istruzioni del manuale (procedura di lavaggio; cronologia delle / e preparazione delle soluzioni; tempi d incubazione)! Per ottenere dal test prestazioni ottimali si raccomanda un lungo ammollo tra una fase e l altra di lavaggio. Nota bene: Le Soluzioni per Amplificazione devono essere preparate immediatamente prima dell applicazione sulla piastra! Per ottenere dal test prestazioni ottimali è estremamente importante lavare i pozzetti in modo adeguato! a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando esattamente 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio. Non lasciar asciugare i pozzetti. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 10.5.1) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi 10.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 40 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 20 pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 9). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da 20.00 a 0.31 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2). 05.06.2013 (26) 12/22

Figura 9 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard 1:25 diluito TNF-α Umano Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 10.5.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G 1 2 3 4 Standard 1 (20.00 pg/ml) Standard 2 (10.00 pg/ml) Standard 3 (5.00 pg/ml) Standard 4 (2.50 pg/ml) Standard 5 (1.25 pg/ml) Standard 6 (0.63 pg/ml) Standard 7 (0.31 pg/ml) Standard 1 (20.00 pg/ml) Standard 2 (10.00 pg/ml) Standard 3 (5.00 pg/ml) Standard 4 (2.50 pg/ml) Standard 5 (1.25 pg/ml) Standard 6 (0.63 pg/ml) Standard 7 (0.31 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 05.06.2013 (26) 13/22

c. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. d. Dispensare 50 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni. e. Dispensare 50 µl di ogni muestra in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere 10.3 la preparazione del Coniugato di Biotina) g. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. h. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) i. Preparare la Streptavidina-HRP (vedere 10.4 la Preparazione di Streptavidina-HRP). j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco. l. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) m Preparare la Soluzione per Amplificazione I diluita nel Diluente per Amplificazione (1x) (vedi 10.8 Preparazione della Soluzione per Amplificazione I) immediatamente prima dell uso. n. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. o. Aggiungere 100 µl di Soluzione I per Amplificazione a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. p. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per essattamente 15 minuti utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) q. Preparare la Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio (vedi 10.9 Preparazione della Soluzione per Amplificazione II) immediatamente prima dell uso. r. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. s. Aggiungere 100 µl di Soluzione per Amplificazione II a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. t. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per essattamente 30 minuti utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) u. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. v. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. w. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per 10-20 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di 0.9-0.95. 05.06.2013 (26) 14/22

x. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. y. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso d incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi. 12. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di TNF-α umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di TNF-α umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di TNF-α umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono stati diluiti 1:2 (50 µl campione + 50 µl Diluente dei Campioni) ed i controlli 1:40 (50 µl di controllo prediluito 1:20 + 50 µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x per gli campioni, 40x per gli controlli). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di TNF-α umano. Questi campioni richiedono un ulteriore prediluizione esterna secondo i valori stimati dell TNF-α umano, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di TNF-α umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di TNF-α umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 10 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 05.06.2013 (26) 15/22

Figura 10 Curva standard rappresentativa per il TNF-α umano ELISA. Il TNF-α umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell TNF-α umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione TNF-α umano (pg/ml) D.O. (450 nm) 1 20.00 2.267 2.466 2 10.00 0.963 1.121 3 5.00 0.558 0.587 4 2.50 0.329 0.335 5 1.25 0.192 0.194 6 0.63 0.145 0.153 7 0.31 0.118 0.121 Bianco 0.00 0.083 0.079 D.O. Media (450 nm) C.V. (%) 2.367 4.2 1.042 7.6 0.572 2.5 0.332 0.9 0.193 0.6 0.149 2.9 0.120 1.2 0.081 2.8 I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 05.06.2013 (26) 16/22

13. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione. 05.06.2013 (26) 17/22

14. Caratteristiche di Prestazione 14.1. Sensibilità Il limite di rilevamento dell TNF-α umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.13 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti). 14.2. Riproducibilità 14.2.1. Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TNF-α umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. Il coefficiente complessivo di variazione intradosaggio calcolato è 8.5 %. 14.2.2. Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TNF-α umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. Il coefficiente complessivo di variazione intradosaggio calcolato è 9.8 %. 14.3. Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo livelli di TNF-α umano al siero. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 8 campioni di siero. l recupero rientrava in un range dal 84 % al 97 % con un recupero medio complessivo del 91 %. 14.4. Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di TNF-α umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 81 % al 101 % con un recupero medio complessivo del 95 % 14.5. Stabilità dei Campioni 14.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero e supernatanti di colture cellulari (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di TNF-α umano. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della TNF-α umano con altri congelamento e lo scongelamento. 14.5.2. Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero e di supernatanti di colture cellulari (aggiunti o non aggiunti) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di TNF-α umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello TNF-α umano. Si è rilevata una perdita leve di immunoreattività della TNF-α umano durante la conservazione a TA et a 37 C dopo 24 ore. 14.6. Comparazione di Siero e Plasma Di vari individui sono stati valutati il siero e l EDTA, il citrato ed il plasma eparinato ottenuti nello stesso momento temporale. Le concentrazioni di TNF-α umano non erano significativamente diverse; quindi tutti questi fluidi corporei sono idonei al dosaggio. Tuttavia, è altamente raccomandato di garantire l uniformità delle preparazioni del sangue. 05.06.2013 (26) 18/22

14.7. Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero TNF-α umano positivo. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività, in particolare non con TNF-β. 14.8. Valori Attesi Per lo TNF-α umano è stato testato Un pannello di 8 sieri di donatori apparentemente sani (di sesso maschile e femminile). Il range di valori dei livelli di TNF-α umano rilevati era tra non rilevabile e 3.22 pg/ml con un livello medio di 1.59 pg/ml. I livelli normali misurati possono variare con il lotto di campioni usato. 14.9. Calibrazione Questo dosaggio immune è calibrato con TNF-α umano ricombinante altamente purificato, valutato in base allo standard di riferimento internazionale NIBSC 87/650 ha dimostrato di essere il suo equivalente. Il NIBSC 87/650 è quantificato in unità internazionali (IU); 1IU corrisponde a 25 pg di TNF-α umano. 15. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: e-mail: IBL@IBL-International.com www.ibl-international.com 05.06.2013 (26) 19/22

16. Sommario: Preparazione dei Reagenti 16.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) 1-6 25 475 1-12 50 950 16.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0 Acqua Distillata (ml) 16.3. Coniugato di Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Coniugato de Biotina (ml) 1-6 0.03 2.97 1-12 0.06 5.94 16.4. Streptavidina-HRP Fare una diluizione 1:400 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP (ml) 1-6 0.015 5.985 1-12 0.030 11.970 Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 16.5. Standard TNF-α Umano Reconstituire il standard liofilizzato di TNF-α umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Lo standard TNF-α umano concentrato dev essere diluito in proporzione 1:25 con Diluente dei Campioni. 16.6. Diluente per Amplificazione (1x) La preparazione del Diluente per Amplificazione (1x) è da farsi immediatamente prima dell uso. Numero di Strisce Diluente per Amplificazione (2x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 3 3 1-12 6 6 05.06.2013 (26) 20/22

16.7. Soluzione per Amplificazione I La preparazione della Soluzione per Amplificazione I dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. Numero di Strisce Reagente per Amplificazione I (ml) Diluente per Amplificazione (1x) (ml) 1-6 0.02 5.98 1-12 0.04 11.96 16.8. Soluzione per Amplificazione II Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. La preparazione della Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Numero di Strisce Reagente per Amplificazione II (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.03 5.97 1-12 0.06 11.94 16.9. Controlli Aggiungere 800 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati. Prediluire il controllo ricostituito 1:20 con Diluente dei Campioni. 05.06.2013 (26) 21/22

17. Sommario di Procedura del Test Nota bene: Le Soluzioni per Amplificazione devono essere preparate immediatamente prima dell applicazione sulla piastra! Per ottenere dal test prestazioni ottimali è estremamente importante lavare i pozzetti in modo adeguato! 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 10.5.1.): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti di campione. 6. Aggiungere 50 µl di campione in duplicato ai pozzetti di campione. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 µl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce e incubare 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 14. Preparare la Soluzione per Amplificazione I diluita nel Diluente per Amplificazione (1x) immediatemente prima dell applicazione sulla piastra. 15. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 16. Aggiungere 100 µl di Soluzione per Amplificazione I a tutti i pozzetti. 17. Coprire le strisce e incubare per esattamente 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 18. Preparare Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio (1x) immediatemente prima dell applicazione sulla piastra. 19. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 20. Aggiungere 100 µl di Soluzione per Amplificazione II a tutti i pozzetti. 21. Coprire le strisce e incubare per esattamente 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 22. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 23. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 24. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10-20 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 25. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 26. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1:2 (50 µl campione + 50 µl Diluente dei Campioni) e i controlli 1:40 (50 µl di controllo prediluito 1:20 + 50 µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x per gli campioni, 40x per gli controlli). 05.06.2013 (26) 22/22

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20