TPHA

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1 TPHA KIT PER LA RILEVAZIONE QUALITATIVA E SEMIQUANTITATIVA DI ANTICORPI ANTI-TREPONEMA PALLIDUM IN SIERO O PLASMA UMANO MEDIANTE EMOAGGLUTINAZIONE PASSIVA /12

2 INDICE 1. USO PREVISTO RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST PRINCIPI DELLA PROCEDURA REAGENTI AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI CAMPIONI PROCEDURA LIMITAZIONE DEL TEST CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI [IT] 2

3 1. USO PREVISTO I kit TPHA sono destinati all'uso per la rilevazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi anti-treponema pallidum in siero e plasma umano. Il prodotto può essere utilizzato per lo screening di donatori di sangue e per agevolare la diagnosi di pazienti con sospetta infezione da sifilide. 2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST La sifilide è un'infezione cronica che progredisce attraverso stadi distinti di infezione: primario, secondario, terziario e quaternario. Questi stadi producono sintomi clinici di vario tipo, tipicamente causando delle ulcere iniziali (cancrena) e quindi eruzione sifilitica seguita da lunghi periodi di latenza. L'infezione non trattata può infine causare problemi cardiovascolari e neurosifilide. L'infezione è sostenuta dalla spirocheta Treponema pallidum e si acquisisce generalmente con il rapporto sessuale, ma la malattia può trasmettersi anche con la trasfusione di sangue infetto. Si verificano anche infezioni intrauterine. L'organismo si è dimostrato praticamente impossibile da coltivare su supporti artificiali, e la diagnosi di infezione dipende in genere dalla conferma della presenza di anticorpi nel sangue, che compaiono poco dopo l'infezione iniziale e possono persistere per molti anni. I test della sifilide rientrano in quattro categorie: esame microscopico diretto, test degli anticorpi anti-treponema, test non basati sugli anticorpi anti-treponema e test diretti dell'antigene. A causa dei lunghi periodi di latenza e della natura aspecifica dei test non basati sugli anticorpi anti-treponema, sono sempre più usati per lo screening i metodi che rilevano anticorpi anti-treponema specifici nei campioni di sangue. TPHA è uno di questi. 3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA I kit TPHA utilizzano eritrociti aviari conservati e rivestiti con antigeni di T. pallidum (ceppo di Nichols), che si legano a un anticorpo specifico presente nel siero o nel plasma del paziente. Le cellule sono sospese in un supporto che contiene componenti in grado di eliminare reazioni non specifiche. Le reazioni positive sono evidenziate dall agglutinazione delle cellule, mentre le reazioni negative sono contraddistinte dall assestamento delle cellule che danno forma ad un bottone o ad un piccolo anello. Sebbene questi test abbiano come destinazione d uso primaria l analisi qualitativa, i livelli di anticorpi possono essere titolati mediante diluizione al raddoppio. I pattern di agglutinazione possono essere interpretati a occhio nudo o mediante un lettore di piastre in grado di leggere i pattern di agglutinazione. Per gli adattamenti e le procedure speciali contattare l azienda competente. [IT] 3

4 4. REAGENTI 4.1. Descrizione R2 Identificazione sull'etichetta Test Cells Control Cells Diluent Descrizione Cellule di test Sospensione di eritrociti aviari rivestiti con antigeni di T. pallidum, contenente siero di albumina bovina (BSA) Cellule di controllo Sospensione di eritrociti aviari, con BSA Diluente Soluzione salina contenente siero di coniglio Presentazione test 500 test 2 fiale 7,8 ml 2 fiale 7,8 ml 2 fiale 20 ml 2 fiale 20 ml 1 fiala 20 ml 1 fiala 125 ml R4 R5 Positive Control Negative Control Controllo positivo Siero umano contenente anticorpi anti- T. pallidum,, negativo per antigene HBs, anticorpi anti-hiv1/2 e anti-hcv, diluito in tampone fosfato. Controllo negativo Siero di coniglio in tampone fosfato 1 fiala 1 ml 1 fiala 1 ml 1 fiala 1 ml 1 fiala 1 ml 4.2. Requisiti di conservazione e trattamento Questo kit deve essere conservato a +2-8 C. Conservare le bottiglie in posizione verticale. Non congelare. Ogni articolo del kit conservato a +2-8 C può essere utilizzato fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti, R2,, R4 e R5 conservati a +2-8 C possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. 5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale Precauzioni per la salute e la sicurezza: Questo kit di test deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti e protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio. I materiali di controllo forniti sono derivati da siero umano. Sono stati testati a livello di donatore e sono risultati negativi per antigene HBs, [IT] 4

5 anticorpi anti-hiv1/2 e anti-hcv. Nessun metodo di test conosciuto è in grado di garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi. Tutti gli emoderivati umani, i reagenti e i campioni umani, pertanto, devono essere manipolati con la consapevolezza che si tratta di sostanze in grado di trasmettere malattie infettive ed è necessario seguire le precauzioni generali per gli agenti patogeni ematici raccomandate nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. Versamenti biologici: I versamenti di materiale di origine umana devono essere trattati come sostanze potenzialmente infettive. I versamenti non contenenti sostanze acide devono essere immediatamente decontaminati e asciugati. A questo scopo, disinfettare l'area in cui è avvenuto il versamento, i materiali ed eventuali superfici o apparecchiature contaminate utilizzando un disinfettante chimico appropriato efficace per i materiali a potenziale rischio biologico relativi ai campioni coinvolti (generalmente, una diluizione 1:10 di candeggina per uso domestico, 70-80% di etanolo o isopropanolo, uno iodoforo allo 0,5% quale Wescodyne Plus, ecc.) e asciugare con un panno. I versamenti contenenti sostanze acide devono essere adeguatamente assorbiti (asciugati con un panno) o neutralizzati, l'area deve essere lavata con acqua e asciugata; il materiale utilizzato per assorbire il versamento può richiedere lo smaltimento come rifiuto a rischio biologico. L'area deve essere quindi decontaminata con un disinfettante chimico. Nota: Non collocare le soluzioni contenenti candeggina in autoclave. Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo Precauzioni relative alla procedura Preparazione L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle seguenti pratiche di laboratorio corrette. Non mescolare, né unire reagenti appartenenti a numeri di lotto differenti all'interno di un unico ciclo. Non utilizzare reagenti scaduti. Prima dell'uso attendere 30 minuti che i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente (18-30 C) Elaborazione Non modificare la procedura di dosaggio. Utilizzare una nuova distribuzione per ciascun campione. [IT] 5

6 6. CAMPIONI I campioni di siero o plasma (EDTA, citrato di sodio, eparina e ACD) devono essere privi di cellule ematiche e di contaminazione microbica evidente. Prima del test, possono essere conservati per un massimo di 7 giorni ad una temperatura di 2-8 C. I campioni che devono essere conservati per periodi di tempo più lunghi devono essere congelati a una temperatura non superiore a -20 C. I campioni congelati devono essere scongelati e miscelati accuratamente prima del test. Non ripetere più di 5 cicli di congelamento/scongelamento. I campioni riscaldati a 56 C per 3 ore non compromettono i risultati. I campioni contenenti fino a 100 g/l di bilirubina, fino a 36 g/l di trigliceridi e fino a 10 g/l di emoglobina non compromettono i risultati. Si sconsiglia tuttavia di utilizzare campioni di siero o plasma iperlipemici o iperemolizzati. Per essere spediti, i campioni devono essere confezionati in conformità con le disposizioni vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici e trasportati preferibilmente congelati. 7. PROCEDURA NOTA: I controlli positivo e negativo (R4 e R5) devono essere utilizzati a ogni esecuzione del test Materiali necessari ma non forniti Acqua distillata Ipocloruro di sodio (candeggina per uso domestico) e bicarbonato di sodio. Carta assorbente Guanti monouso Occhiali di sicurezza Provette monouso Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare 10 µl, 25 µl, 75 µl e 190 µl. Agitatore per micropiastre Piastre a U con pozzetti (Micropiastre a 96 pozzetti) Codice (5 piastre) Contenitore per rifiuti biologici potenzialmente pericolosi 7.2. Procedura di dosaggio (tecnica manuale) Dosaggio qualitativo Per ogni campione sono necessari tre pozzetti della micropiastra a U. Il Kit TPHA 500 (codice prodotto 72504) è destinato all uso per lo screening di numeri elevati di campioni e contiene solo un volume ridotto di cellule di controllo. Il test prevede che i campioni vengano testati utilizzando solamente cellule di test durante la prima esecuzione, mentre le cellule di controllo devono essere utilizzate per la ripetizione dei test sui campioni che hanno dato un risultato positivo alla prima esecuzione del test. [IT] 6

7 a. Diluizione del campione e dei controlli (1:20) Aggiungere 190 µl di diluente () in un pozzetto. Aggiungere 10 µl di campione o di controllo positivo (R4) o di controllo negativo (R5) nello stesso pozzetto. Miscelare accuratamente. b. Test Trasferire controllo diluito o di campione diluito durante la fase di diluizione nel pozzetto di test. Trasferire controllo diluito o di campione diluito durante la fase di diluizione nel pozzetto di controllo. Risospendere le cellule di test () e le cellule di controllo (R2) agitando l analizzatore di fiale fino ad ottenere una sospensione completa. Aggiungere 75 µl di cellule di test () nel pozzetto di test e 75 µl di cellule di controllo (R2) nel pozzetto di controllo. La diluizione finale del campione è di 1: 80. Miscelare accuratamente i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente (15-30 C) su una superficie priva di vibrazioni per almeno 45 minuti. Leggere i pattern di assestamento. I pattern di agglutinazione sono stabili per almeno tre ore se non disturbati Dosaggio semiquantitativo Per ogni campione sono necessari 9 pozzetti della micropiastra a U: Un pozzetto per la diluizione del campione o del controllo e 8 pozzetti per la titolazione. Nota: I controlli positivo (R4) e negativo (R5) devono essere utilizzati con ogni lotto di test, applicando la procedura descritta di seguito. a. Diluizione del campione e dei controlli (1:20) Aggiungere 190 µl di diluente () in un pozzetto. Aggiungere 10 µl di campione o di controllo negativo (R5) o di controllo positivo (R4) nello stesso pozzetto. Miscelare accuratamente. b. Titolazione Lasciando il primo pozzetto vuoto, aggiungere diluente () in ciascuno dei restanti 7 pozzetti. 190 µl () + 10 µl di campione o (R4) o (R5) Diluizione del campione o del controllo pozzetti per titolazione Trasferire controllo diluito o di campione diluito nel 1 pozzetto e nel 2 pozzetto, quindi miscelare. [IT] 7

8 Procedere con la diluizione seriale lungo la sequenza dei pozzetti, scartando i 25 µl in eccesso dall ultimo pozzetto. 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl µl () + 10 µl di campione o (R4) o (R5) Diluizione del campione o del controllo controllo diluito + 25 µl di controllo diluito 25 µl di 25 µl di 8 pozzetti per titolazione 25 µl di 25 µl di Smaltire i 25 µl in eccesso c. Test Miscelare delicatamente le cellule di test () per garantire una corretta risospensione. Aggiungere 75 µl di cellule di test () in ogni pozzetto. La gamma di diluizione finale del campione dopo l aggiunta delle cellule è compresa tra 1: 80 e 1: Miscelare accuratamente µl () + 10 µl di campione o (R4) o (R5) Diluizione del campione o del controllo controllo diluito + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di diluizione + 75 µl di 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1: pozzetti per titolazione Incubare a temperatura ambiente (15-30 C) su una superficie priva di vibrazioni per almeno 45 minuti. Leggere i pattern di assestamento. I pattern di agglutinazione sono stabili per almeno tre ore se non disturbati. Il titolo del campione è il reciproco della massima diluizione che ha prodotto l agglutinazione Controllo qualità I controlli del kit devono dare il risultato corretto, ossia negativo per il controllo negativo (R5) e positivo per il controllo positivo (R4). [IT] 8

9 Quando il controllo positivo (R4) del kit è titolato, l end point previsto è 1:640 1: Interpretazione dei risultati e criteri per la validazione del test Positivo Equivoco Negativo Cellule di test Cellule di controllo Positivo: Forte Pattern di cellule completo che Bottone negativo ricopre il fondo del pozzetto. Positivo debole Il pattern di cellule ricopre circa 1/3 Bottone negativo del fondo del pozzetto Equivoco Il pattern di cellule mostra un centro Bottone negativo chiaramente aperto. Negativo Le cellule sono aggregate in un Bottone negativo bottone compatto, tipicamente con un piccolo centro trasparente. Reazione non Reazione positiva. Reazione positiva specifica Un campione in cui il pozzetto delle cellule di test non sia reattivo deve essere considerato negativo al T. pallidum. Una reattività inferiore al livello equivoco si considera negativa. Un campione che dia un risultato equivoco o positivo deve essere considerato positivo e in tal caso la procedura di test va ripetuta come descritto sopra, in duplicato, aggiungendo le cellule di controllo (R2) fornite in dotazione a un set di cellule e le cellule di test () all altro set. Se almeno in uno dei pozzetti con cellule di test () il risultato è equivoco o positivo, il campione deve essere considerato positivo al T. pallidum. Per la reazione non specifica, se l agglutinazione è maggiore nelle cellule di test () che nelle cellule di controllo (R2), il campione deve essere considerato positivo e il test va ripetuto come descritto sopra. Quando un campione presenta un agglutinazione maggiore o uguale nelle cellule di controllo (R2), il campione deve essere assorbito mediante la seguente procedura Assorbimento in caso di reazioni non specifiche (Procedura da utilizzare in presenza di agglutinazione sia nelle cellule di test sia nelle cellule di controllo). 1. Aggiungere 10 µl di campione a 190 µl di cellule di controllo risospese, miscelare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. [IT] 9

10 2. Centrifugare per depositare le cellule per almeno 3 minuti a 1500 giri. 3. Aggiungere supernatante dalla fase 2 in ognuno dei 2 pozzetti. 4. Miscelare delicatamente le cellule di test e le cellule di controllo per garantire una corretta risospensione. Aggiungere 75 µl di cellule di test nel 1 pozzetto. Aggiungere 75 µl di cellule di controllo nel 2 pozzetto. 5. Miscelare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per almeno 45 minuti. 6. Leggere e interpretare i pattern di assestamento come indicato in precedenza. 8. LIMITAZIONE DEL TEST Non è disponibile un singolo test o uno standard di riferimento definitivo per ogni stadio della malattia. La diagnosi di sifilide si basa dunque prevalentemente sui test sierologici e richiede i risultati di metodi troponema-specifici e non. Nessun test diagnostico offre l'assoluta certezza che un campione non contenga bassi livelli di anticorpi anti-t.pallidum, come quelli presenti nella primissima fase dell'infezione. Un risultato negativo ottenuto in qualsiasi momento non esclude quindi la possibilità di esposizione all'infezione da sifilide. Tutti i risultati dei test treponema-specifici tendono a rimanere reattivi in seguito all'infezione da treponema, e non devono quindi essere usati per valutare la risposta alla terapia. A causa della reattività persistente, generalmente per l'intera vita del paziente, i test treponema-specifici non hanno nessun valore al fine di determinare la recidiva o la re-infezione in un paziente che ha avuto un risultato reattivo. In tal caso, si raccomanda di usare altri dosaggi: Sifilide Ab totali, Sifilide IgM EIA e RPR. 9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI 9.1. Studio di precisione Lo studio della precisione è stato realizzato testando 3 campioni (1 negativo, 1 basso positivo e 1 positivo) in 10 repliche nello stesso ciclo (ripetibilità) e in 2 repliche nel corso di 5 giorni su 2 lotti diversi, affidando la lettura a 2 operatori (precisione intermedia). [IT] 10

11 Ripetibilità: Su 10 ripetizioni, i 3 campioni hanno dato risultati identici. Precisione intermedia/interlotto: Quando sono stati testati in condizioni diverse (40 volte), i 3 campioni hanno dato risultati identici Prestazioni cliniche Le prestazioni del dosaggio TPHA sono state determinate testando i campioni di donatori di sangue casuali, pazienti ricoverati, pazienti affetti da sifilide e campioni positivi per marcatori non associati all infezione da T. pallidum. Gli studi si sono svolti presso 2 sedi di donatori di sangue e una struttura Bio- Rad Specificità In totale sono stati studiati 5032 campioni di donatori di sangue raccolti prospetticamente in 2 strutture diverse. I campioni erano costituiti da siero (3626), EDTA K2 (539) o plasma con litioeparina (867), sono stati testati in un lasso di tempo inferiore a 7 giorni dopo il campionamento e sono stati confrontati con il dosaggio di screening utilizzato in laboratorio. Tabella 1: Popolazione di donatori di sangue Struttura Numero Campioni reattivi iniziali (RI) Campioni reattivi ripetuti (RR) Struttura N Specificità (%) 99,72% (2512 / 2519) Intervallo di confidenza 95% 99,43% 99,89% Struttura N * Totale (8 positivi, 30 equivoci) 7 14 (3 positivi, 11 equivoci) *: un campione (vero positivo) è stato eliminato dal calcolo. 99,72% (2505 / 2512) 99,72% (5017 / 5031) 99,43% 99,89% 99,53% 99,85% La specificità totale sulla popolazione della banca del sangue è pari al 99,72% (5017/5031), con un intervallo di confidenza al 95% di [99,53% - 99,85%]. Tra i 14 campioni falsi positivi, 11 sono risultati ripetutamente equivoci. È stato condotto anche uno studio retrospettivo su 201 campioni congelati, ottenuti da pazienti di un centro per le malattie a trasmissione sessuale o da fornitori, che sono risultati negativi alla sifilide. La specificità su questi campioni è stata del 99,5% (200/201) con un intervallo di confidenza al 95% di [97,3%- 100,0%]. [IT] 11

12 Sensibilità Lo studio retrospettivo della sensibilità è stato condotto su 435 campioni di siero congelati ottenuti dal laboratorio del centro per le malattie a trasmissione sessuale, o su campioni congelati ottenuti da fornitori. I campioni sono stati riscontrati positivi mediante immunodosaggi, dosaggio FTA, dosaggio RPR/VDRL o dosaggi TPHA, a seconda della loro provenienza. Tutti i campioni sono stati testati inizialmente con il dosaggio TPHA a marchio CE e successivamente con il dosaggio Bio-Rad TPHA 500 (72504). La sensibilità su questa popolazione è stata del 100% (435/435) con un intervallo di confidenza al 95% di [99,2% - 100,0%] Sensibilità analitica La sensibilità analitica è stata testata secondo lo Standard Internazionale dell OMS NIBSC codice 05/132 per la sifilide. Applicando il protocollo semiquantitativo, la sensibilità è stata di 0,05 IU/ml Specificità analitica / studio di reattività crociata 210 campioni potenzialmente interferenti contenenti anticorpi contro patogeni che potrebbero provocare patologie infettive (Citomegalovirus, virus di Epstein Barr, VZV, virus della rosolia, virus dell'epatite C, virus dell'epatite B, HIV 1/2, HTLV 1/2, Toxoplasma gondii, Dengue, malaria, leptospirosi), campioni di donne in gravidanza o multipare o campioni di pazienti con disturbi del sistema immunitario (autoanticorpi (LES), fattori reumatoidi) sono stati testati con il dosaggio TPHA. Quattro (4) campioni veri positivi sono stati esclusi dal calcolo. Un campione è risultato positivo ripetibile con il test TPHA. La specificità osservata in questa popolazione target pari al 99,5 % (205/206) è risultata simile alla specificità dei campioni clinici Effetto prozona È stata studiata l'esistenza di un possibile effetto prozona testando 3 campioni con titoli alti (>= 1:20480) a varie diluizioni. L'equivalenza di risultati osservati tra i campioni diluiti e non diluiti mostra l'assenza dell'effetto prozona. 10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI. 1. Daguet G.L. - Diagnostic Biologique de la Syphilis. Technique et Biologie, 1995 ; 120 : Houng H. - Syphilis: new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992; 3 : Larsen S.A., Hambie E.A., et coll., Specificity, sensitivity and reproducibility among the fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J. Clin. Microbiol., 1981 ; 14 : [IT] 12

13 4. North MLet Guntz Ph. Serodiagnostic de la syphilis. La Revue Française des Laboratoires, 1997 ; 294 : Paris Hamelin, A., Dreux P. et coll. Treponematoses : aspects cliniques et biologiques. Feuill. Biol. 1991a ; 23 : Rathlev T. - Haemagglutination tests utilizing antigens from pathogenic and apathogenic Treponema pallidum WHO/VDT/RES 1965 ; 77 : Rathlev T. - Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the serodiagnosis of syphilis. Br J Vener Dis 1967 ; 43 : Sequeira P,J,L. Eldridge A,E. - Treponemal Haemagglutination test. Br J Vener Dis 1973 ; 49 : Sluis J.J. Van Der. - Laboratory Techniques in the diagnosis of syphilis: a review. Genitourin Med ; 68 : Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med : Tomizawa T, Kasamatsu S. - Haemagglutination tests for diagnosis of syphilis. A preliminary report. Japan. J. Med. Sci. Biol. 19, , Tomizawa T. Kasamatsu S. Yamaya S. - Usefulness of the haemagglutination test using Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. Jap J Med Sci Biol 1969 ; 22 : [IT] 13

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