Gli Enzimi. catalizzatori biologici rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche

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1 catalizzatori biologici rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche Gli Enzimi Sono le proteine più importanti e più specializzate Presentano un elevato grado di specificità per il substrato Operano in soluzioni acquose con temperature e ph blandi

2 Struttura generale degli enzimi Sono proteine globulari complesse : Addotto enzima-substrato Parte proteica Parte non-proteica Cofattore (ione metallico) Coenzima (natura organica: vitamina o altro) Gruppo Prostetico

3 SITO ATTIVO: specifica porzione dell enzima, deputata al legame con il substrato che porta alla formazione dell addotto ES Addotto ES

4 Proprietà dei Catalizzatori I catalizzatori sono sostanze capaci di abbassare l energia di attivazione rendendo piú facile la formazione dell addotto ES: la reazione diviene quindi piú veloce.

5 A(S) B(P) I catalizzatori abbassano l energia di attivazione delle reazioni favoriscono lo stato di transizione formando l addotto ES G prodotti -G substrati ( G ) < 0 Reazione esoergonica

6 Molti catalizzatori non facilitano la formazione dello stato di transizione, ma sostituiscono la reazione difficile con 2 o più reazioni entrambe con uno stato di transizione facile da formare E+S ES EP E+P Risultato: accelerazione della reazione globale. ΔG =energia di attivazione

7 ADDOTTO Enzima-Substrato L energia usata per aumentare la velocità enzimatica deriva dalle interazioni deboli (legami idrogeno, interazioni ioniche e idrofobiche) che si formano tra enzima e substrato ENERGIA di LEGAME

8 CATALISI ENZIMATICA Adattamento indotto

9 CINETICA ENZIMATICA velocità di una reazione (V): numero di molecole di substrato che si trasformano in prodotto nell unità di tempo. (V) si esprime come mmol/l di prodotto formatosi in un minuto (mm/min). Velocità iniziale V 0 Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si utilizzano soltanto le velocità di reazione iniziali (v 0 ), quelle che si misurano non appena si mescolano l enzima ed il substrato. In tal modo la variazione di [S] può essere considerata trascurabile.

10 FATTORI CHE MODIFICANO LA VELOCITA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE: 1) ph (curva a campana) 2) temperatura (curva bifasica a causa della denaturazione) 3) [S] (iperbole rettangolare a causa della saturazione) 4) inibitori CINETICA ENZIMATICA

11 CINETICA ENZIMATICA: ph Ciascun enzima ha un ph ottimale al quale la reazione è catalizzata con la massima efficienza. Esso in genere rispecchia il ph dell ambiente in cui l enzima svolge normalmente le sue funzioni. La concentrazione degli H + (ph) influenza l attività enzimatica modificando la geometria del sito attivo e la distribuzione delle cariche elettriche dei gruppi coinvolti nel legame del substrato o nel processo catalitico stesso. Valori di ph estremi possono anche provocare la denaturazione dell enzima.

12 CINETICA ENZIMATICA: ph

13 CINETICA ENZIMATICA: temperatura La velocità di reazione aumenta con l aumentare della temperatura fino a raggiungere un picco. Un ulteriore innalzamento della temperatura provoca una diminuzione della velocità di reazione a causa della denaturazione dell enzima.

14 CINETICA ENZIMATICA: temperatura

15 CINETICA ENZIMATICA: concentrazione del substrato La velocità di una reazione catalizzata da un enzima aumenta all aumentare della concentrazione del substrato fino a raggiungere una velocità massima (V max ). In questa condizione i siti attivi dell enzima sono saturi del substrato Quando tutto l enzima è saturato con il substrato: [ES] = [E tot ] V 0 = Vmax

16 L equazione di Michaelis-Menten descrive la variazione della velocità di reazione al variare della concentrazione del substrato. v 0 = velocità iniziale della reazione V max = velocità massima K m = costante di Michaelis-Menten [S] = concentrazione del substrato

17 La curva che esprime la relazione tra V 0 e S ha un andamento iperbolico ed è espressa algebricamente dalla equazione di Michaelis-Menten Costante di Michaelis e Menten La Km è quella concentrazione di substrato a cui la V 0 è pari a metà della Vmax

18 Caratteristiche della K m La K m è pari alla concentrazione di substrato alla quale la velocità della reazione (V 0 ) è 1/2 della V max. La K m riflette l affinità dell enzima per il substrato: K m piccola = alta affinità dell enzima per il substrato K m grande = bassa affinità dell enzima per il substrato. Ogni enzima ha una K m caratteristica per un dato substrato. La K m non varia al variare della [E].

19 I PARAMETRI CINETICI POSSONO ESSERE USATI PER CONFRONTARE LE ATTIVITA DEGLI ENZIMI

20 Inibizione Enzimatica Inibitori ostacolano o impediscono il funzionamento degli enzimi Inibitore reversibile: Ha un azione temporanea, è possibile allontanare l inibitore dall enzima, consentendo il regolare esplicarsi dell attività catalitica. inibitore irreversibile: la ripresa dell attività enzimatica non è possibile, in quanto non è possibile in nessun modo allontanare l inibitore dall enzima

21 Enzimi regolatori Aumentano o diminuiscono la loro attività catalitica in risposta a determinati segnali tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis Menten e sono responsabili della modulazione della velocità con cui decorre interi processi metabolici struttura quaternaria (due o più subunità proteiche) in essi esistono più siti chimicamente attivi ENZIMI ALLOSTERICI Legano Effettori o MODULATORI: molecola che interagendo con l enzima in siti lontani dal sito attivo, esercita un effetto positivo o negativo sulla sua attività Modificazioni covalenti reversibili

22 Enzimi regolatori Enzimi allosterici: Agiscono mediante legame non covalente e reversibile di Modulatori allosterici Modificazione allosterica OMOTROPICI Il substrato è esso stesso un modulatore ETEROTROPICI Il modulatore è una molecola diversa dal substrato

23 Enzimi regolatori

24 Enzimi regolatori Inibizione retroattiva Gli enzimi allosterici possono essere inibiti dai prodotti terminali di una via metabolica un enzima regolatore controlla le quantità di sostanze che devono essere trasformate in una via metabolica (catalizza la reazione più lenta, in genere la prima di una serie)

25 Enzimi regolatori modificazione covalente reversibile

26 Enzimi regolatori Scissione proteolitica di un precursore (zimogeno inattivo) modificazione covalente irreversibile

27 Coenzimi e Cofattori Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la presenza di ioni metallici o di altre molecole, talvolta legate con legami covalenti: Coenzimi o cofattori Cofattore: ione o molecola NON PROTEICA la cui presenza è indispensabile perché l enzima possa svolgere la sua attività catalitica. Interagiscono con l apoezima solo durante il ciclo catalitico. Tra i cofattori hanno rilevante importanza gli ioni di alcuni elementi metallici, Ca, Mg, Mn, Zn, Cu (tutti gli enzimi che utilizzano ATP richiedono la presenza di ioni Mg 2+ ).

28 Coenzimi e Cofattori Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la presenza di ioni metallici o di altre molecole, talvolta legate con legami covalenti: Coenzimi o cofattori Coenzimi: sono molecole organiche (alcuni di essi derivano da vitamine idrosolubili) prendono parte direttamente all azione catalitica dell enzima spesso si ritrovano modificati chimicamente al termine della reazione (es. NAD + / NADH).

29 Coenzimi I coenzimi da soli sono cataliticamente inattivi ma, unendosi all apoenzima, formano l enzima cataliticamente attivo. Uno stesso coenzima può essere unito a diverse proteine per cui si deduce che la specificità dell azione enzimatica è proprietà dell apoenzima e non del coenzima. La maggior parte dei coenzimi è strettamente legata alle vitamine. Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione (uno dei casi più comuni) a trasformazioni più complesse. La trasformazione della vitamina in coenzima avviene all interno delle cellule ed è di natura enzimatica. I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi, in base al tipo di reazione catalizzata.

30 Coenzimi Coenzimi derivati dalle vitamine idrosolubili Le vitamine sono necessarie per la sintesi di coenzimi e devono essere ottenute con la dieta Piante e microorganismi sono produttori di vitamine La maggior parte delle vitamine deve essere ulteriormente trasformata per generare coenzimi

31 Cofattori Niacina (Vit. B 3 o PP) NAD + e NADP + La niacina (acido nicotinico) è un precursore di NAD + e NADP + NAD = Nicotinamide Adenina Dinucleotide NADP = Nicotinamide Adenina Dinucleotide Fosfato NAD + e NADP + fungono da coenzimi in molte reazioni di ossidoriduzione

32 Cofattori NAD + NADH

33 Cofattori Il NAD + funziona da deidrogenante: porta via 2 atomi di H dal substrato. Uno viene perso sotto forma di ione H +, l altro viene perso come idruro H - che si lega immediatamente all anello piridinico cationico

34 PROTEINE RESPIRATORIE EMOGLOBINA & MIOGLOBINA

35 Nel corso dell evoluzione, con il passaggio dalla vita anaerobia alla vita aerobia si sono progressivamente differenziati due meccanismi che sono in grado di garantire alle cellule dei tessuti un flusso di O 2 sufficiente e costante: un sistema circolatorio; molecole trasportatrici di O 2, che permettono di superare la limitazione imposta dalla bassa solubilità dell ossigeno in acqua.

36 Nei vertebrati le molecole coinvolte nel rifornimento dell ossigeno sono: Emoglobina (Hb) Mioglobina (Mb) Legano reversibilmente l O 2 (LIGANDO) ne rendono possibile il trasporto dai polmoni ai tessuti e l immagazzinamento nel muscolo.

37 Proteina monomerica (153 AA) Immagazzinamento dell O 2 nella cellula 80% degli AA sono disposti ad α-elica Mioglobina (Mb) La Mb si trova nei muscoli e funziona soprattutto come deposito di O 2 ; Facilita la diffusione dell ossigeno nel muscolo che sta respirando rapidamente

38 Emoglobina (Hb) Eterotetramero costituita da 4 diverse subunità: 2 subunità α 2 subunità β Trasporto dell O 2 dai polmoni alla cellula

39 L Emoglobina trasporta l O 2 dai polmoni ai tessuti La Mioglobina lega l ossigeno rilasciato dall Emoglobina nel circolo Sanguigno e ne facilita la diffusione nel muscolo che sta respirando rapidamente

40 EME Emoglobina Mioglobina

41 EME 4 anelli pirrolici Fe 2+ al centro EME: PROTOPORFIRINA IX Fe 2+

42 EME

43 EME

44 EME

45 EME

46 EME Il Fe 2+ dell eme può legare: O 2 CO H 2 O (metaemoglobina) Fe 2+ Fe 3+

47 EME Il Fe 2+ dell eme può legare: O 2 (ossiemoglobina)

48 EME Il Fe 2+ dell eme può legare: CO (carbossiemoglobina)

49 I derivati carbossi-mioglobina e carbossi-emoglobina presentano CO (non CO 2!!!) legato al gruppo eme. Il legame con il CO è circa 300 volte più stabile di quello con l O 2 ed è irreversibile! Quando nell aria è presente 0.2% di CO in 1 ora si ha perdita di coscienza e in circa 4 ore si ha morte per asfissia (circa 2/3 di Hb sono legati a CO).

50 Protezione dell eme da parte della globina Le globine che circondano l'eme in Mb ed in Hb hanno funzioni di estrema importanza: - impediscono al ferro dell eme di ossidarsi da Fe 2+ ferroso a Fe 3+ ferrico; - creano un sito attivo idrofobico, in cui si lega O 2 che è lipofilo * ; - proteggono l eme da ligandi indesiderati (esempio CO). * la solubilità di O 2 nel plasma è molto bassa; grazie all'emoglobina nel sangue c'è una concentrazione di O volte superiore a quella del plasma.

51 Mioglobina (Mb) Costituita da 153 residui aa 8 α-eliche Gruppo eme Tasca idrofobica eliche E ed F His E7: istidina distale; His F8: istidina prossimale

52 Saturazione frazionale Legame all ossigeno della Mb (MbO 2 ) Deposito di O 2 a livello muscolare Muscolo a riposo: Mb lega O 2 Muscolo attivo: consumo di O 2 Quando diminuisce la pressione a livello dei tessuti, Mb rilascia l O 2 Pressione tessuti Pressione polmoni Numero di molecole che hanno legato l O 2 rispetto al totale Y Curva iperbolica P 50 Pressione parziale di O 2 alla quale è saturato il 50% delle molecole SEMISATURAZIONE Misura dell affinità per l O 2 Più piccola è la P 50 maggiore è l affinità

53 1. contenuta negli eritrociti Emoglobina (Hb) 2. trasporto di O 2 dai polmoni ai tessuti (legame reversibile) 3. trasporto reversibile di CO 2. struttura quaternaria tetramerica 4 catene polipetiditiche 4 gruppi eme HbA (α 2 β 2 ): emoglobina adulta umana 2 catene α, 2 catene β HbF (α 2 2 ): emoglobina fetale 2 catene α, 2 catene La sostituzione delle catene β (Hb adulta) con le catene (Hb fetale) comporta differente funzionalità.

54 Emoglobina (Hb) La struttura terziaria è simile tra subunità α e subunità β, entrambe inoltre sono simili alla Mb, anche se le tre catene polipeptidiche hanno solo il 18% dei residui aa in comune

55 Emoglobina (Hb) Interazioni tra subunità di tipo diverso: Interazioni idrofobiche Legami idrogeno Legami ionici

56 Emoglobina (Hb)

57 L emoglobina esiste in due forme: ossigenata =R; deossigenata =T Il legame di Hb con O 2 determina una grande modificazione della struttura quaternaria. La proteina passa da una forma tesa T, mantenuta da interazioni ioniche (ponti salini) fra catene laterali di aminoacidi (es. Asp-His) presenti nelle subunità, a una forma rilassata R (ponti salini spezzati). Il fenomeno avviene in direzione opposta quando l emoglobina rilascia l ossigeno.

58 Modificazione conformazionale: Transizione T R deossigenata =T ossigenata =R Le modificazioni della struttura quaternaria avvengono alle interfacce α 1 β 2 e α 2 β 1 Il dimero α 1 β 1 ruota di circa 15 rispetto al dimero α 2 β 2

59 Modificazione conformazionale: Transizione T R deossigenata =T ossigenata =R passando da T ad R, il Fe 2+ si sposta nel centro del piano dell EME. Questo movimento trascina anche l His F8 che a sua volta trascina con se tutta l elica F.

60 Modificazione conformazionale: Transizione T R deossigenata =T ossigenata =R

61 L emoglobina è una proteina allosterica la cui struttura quaternaria viene modificata dal legame di O 2 alle 4 subunità: i 4 siti attivi cooperano positivamente, legando O 2 con affinità crescente e questo causa cambiamento progressivo di struttura quaternaria. Allosterismo (modificazione della struttura quaternaria) proteine con struttura quaternaria possono andare incontro a modificazioni nella disposizione spaziale delle subunità costituenti.

62 Curva di dissociazione dell O 2 per l Emoglobina Hb Hb + 4O 2 = Hb(O 2 ) 4 sigmoidale La quantità di ossigeno legato si modifica significativamente anche con piccole variazioni di po 2. Hb lega l O 2 quando la pressione parziale del gas (po 2 ) è elevata (polmoni) e lo rilascia quando la pressione è bassa (tessuti).

63 La mioglobina è un ottimo sistema per immagazzinare O 2 : -si lega all O 2 anche a basse po 2 e lo lega strettamente. L emoglobina è un ottimo sistema per trasportare l O 2 : -si carica di O 2 quando po 2 è alta e cede O 2 quando po 2 è bassa.

64 La curva di dissociazione sigmoide indica la presenza di interazioni cooperative: il legame di una molecola influenza il legame delle altre Hb lega O 2 con affinità crescente Hb + 4 O 2 =Hb(O 2 ) 4

65 Modello simmetrico Modello sequenziale

66 Fattori che influenzano l affinità dell Hb per O 2 piccole molecole e ioni, presenti negli eritrociti possono regolare il legame di O 2 ad Hb EFFETTORI O MODULATORI ETEROTROPICI: [H + ], CO 2, acido 2,3 bisfosfoglicerico (2,3-BPG) si legano con interazioni deboli in siti diversi da quello di legame dell O 2 diminuiscono l affinità dell emoglobina per l ossigeno. MODULATORI ETEROTOPICI NEGATIVI. L aumento di concentrazione di questi modulatori causa una diminuzione dell affinità di Hb per O 2 e stabilizzano la forma T.

67 EFFETTO BOHR Il legame di Hb con O 2 è fortemente influenzato dal ph e dalla pco 2. Polmoni: ph alto; pco 2 bassa: l'affinità di Hb per O 2 aumenta, O 2 viene legato e H + e CO 2 vengono rilasciato. Aumentando il ph si rimuove il protone (H +) legato all Hb, stimolandone l ossigenazione

68 EFFETTO BOHR Il legame di Hb con O 2 è fortemente influenzato dal ph e dalla pco 2. Tessuti: ph basso; pco 2 alta: l'affinità di Hb per O 2 diminuisce, O 2 viene liberato e H + e CO 2 si legano ad Hb. Nei tessuti Hb(O 2 ) 4 perde affinità per O 2, lo rilascia a causa delle basse po 2 e, essendo la forma deossigenata più affine per H +, si comporta come un ottimo tampone intracellulare (azione di alcuni residui di istidina). L'azione tampone si accompagna al trasporto dell'anidride carbonica.

69 EFFETTO BOHR In aggiunta al trasporto di O 2 dai polmoni ai tessuti, Hb trasporta anche due prodotti della respirazione, H + e CO 2, dai tessuti ai polmoni ed ai reni, organi deputati alla loro escrezione. Trasporto della CO 2 CO 2 liberamente disciolta nel plasma CO 2 trasportata come bicarbonato (HCO 3- ) CO 2 trasportata come carbammati(15-20%) formatosi dalla reazione con i gruppi α aminici terminali non ionizzati dell Hb

70 EFFETTO BOHR Dai tessuti verso i capillari, la CO 2 diffonde disciolta in acqua. Mentre negli eritrociti, l enzima anidrasi carbonica, catalizza la reazione seguente: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 - Si lega all Hb che viene indotta a rilasciare l O 2 H + HCO 3 - passano dal globulo rosso al plasma attraverso una proteina di membrana Quindi la maggior parte di CO 2 nel sangue viene trasportata sotto forma di bicarbonato.

71 EFFETTO BOHR Gli ioni H + si legano a 3 coppie di siti sull Hb: la più nota è l His 146 delle catene β Nei tessuti ad elevato metabolismo, come nei muscoli in attività in cui c è una notevole produzione di composti acidi e di CO 2, l Hb cede più facilmente l O 2 e lega gli H + e la CO 2. Nei polmoni avviene esattamente il contrario.

72 EFFETTO BOHR ph & pco 2 venoso arterioso Il legame di ioni H + induce l Hb a rilasciare l ossigeno nei tessuti e a legare la CO 2 prodotta dalla respirazione muscolare.

73 EFFETTO BOHR ph & pco 2

74 pco 2 pco 2 Influenza della pco 2

75 Influenza del ph tessuti polmoni

76 Influenza del 2,3- BPG 2,3-bisfosfoglicerato

77 Influenza del 2,3- BPG Il 2,3 BPG è una piccola molecola dotata di cariche negative che consentono il legame a una serie di cariche positive delle catene laterali di AA situati sulle due catene β, formando ponti salini e stabilizzando la forma T (deossigenata) Il sito per il 2,3 BPG è presente solo nella forma tesa T.

78 Influenza del 2,3- BPG Nell Hb deossigenata (T) è presente una cavità centrale che si restringe consistentemente in Hb in forma R (ossigenata): tale cavità nella forma T ospita il 2,3 BPG, modulatore allosterico negativo.

79 Influenza del 2,3- BPG Nell Hb deossigenata (T) è presente una cavità centrale che si restringe consistentemente in Hb in forma R (ossigenata): tale cavità nella forma T ospita il 2,3 BPG, modulatore allosterico negativo.

80 EMOGLOBINA FETALE (HbF) Il significato del 2,3 BPG appare chiaro se si confronta la curva di saturazione dell HbA materna e dell Hb e fetale. Gli eritrociti fetali contengono un Hb con struttura quaternaria α2 2. Fra le catene il 2,3-BPG si lega più debolmente rispetto a quello che avviene nell HbA. La curva di saturazione dell Hb fetale è a sinistra rispetto a quella della HbA materna, indicando maggiore affinità per O 2. L'O 2 rilasciato nella circolazione placentare dall Hb materna a certe pressioni parziali, viene assunto dall Hb fetale, più affine, e ciò soddisfa l'esigenza fisiologica di rifornimento di O 2 al feto da parte della madre.

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82 emoglobinopatie Anemia falciforme

83 emoglobinopatie

84 Le talassemie

85 P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006