Proteine H 3 N + CH 2 CO 2 - = H 2 NCH 2 COOH

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1 Proteine Le proteine sono diffusamente presenti all'interno dei musei e nelle gallerie d'arte, poiché essenzialmente tutti i materiali grezzi di origine animale le possiedono. Le proteine sono per il mondo animale ciò che la cellulosa è per il mondo vegetale e di conseguenza materiali apparentemente diversi come la dentina, la spugna, ossa e avorio; seta, lana e capelli; prodotti della pelle, come cuoio, pergamene sono fatti o contengono proteine. Altri materiali proteici come uova, colla animale e di pesce, latte o caseina sono contenuti nei dipinti e in altri oggetti come leganti e adesivi. Sebbene le proteine assumano una grande varietà di forme, diverse caratteristiche fisiche e funzioni biologiche, esse sono composte da un numero abbastanza limitato di unità chimiche base conosciute come amminoacidi. Questi sono acidi che contengono azoto e possono essere liberati da una proteina per idrolisi. 20 comuni amminoacidi sono coinvolti, insieme con una manciata di altri trovati in proteine specializzate, in molecole chimicamente degradate e in materiali fossili. Queste comuni unità monomeriche sono composti alifatici, catene alifatiche ramificate, composti contenenti azoto, eterocicli e composti aromatici come indicato in figura 7.1. Si può dire che tutti gli amminoacidi, tranne la glicina, possiedono almeno un atomo di carbonio asimmetrico, di fatto quello che porta il gruppo amminico e l acido carbossilico. È tradizione usare la nomenclatura D ed L, come con gli zuccheri (6.1), per descrivere la configurazione assoluta a questo centro. In natura soltanto le forme L sono utilizzate nella sintesi delle proteine, quindi solo queste si incontrano dei materiali provenienti da origini viventi. La relazione della L alanina con la L gliceraldeide è la seguente: Gli amminoacidi sono conosciuti come specie anfotere, per esempio esse possiedono sia un gruppo acido che uno basico sulla stessa molecola. Di conseguenza essi esistono come zwitterioni o sali interni, per esempio la glicina: H 3 N + CH 2 CO 2 - = H 2 NCH 2 COOH La formazione di questo sale ha conseguenze per le loro proprietà fisiche: essi generalmente fondono ad una temperatura piuttosto alta (con decomposizione) ed essi sono corrispondentemente non volatili. 1

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3 Attraverso una forma di condensazione che coinvolge un gruppo amminico e un gruppo acido carbossilico, realizzato enzimaticamente in vivo, queste unità di amminoacidi sono legate insieme da gruppi -NHCO-, conosciuti come legami peptidici. I polimeri che contengono tra due e 50 unità sono generalmente denominati peptidi o polipeptidi. Molecole più grandi sono generalmente conosciute come proteine. L'identificazione delle proteine o direttamente nei polipeptidi è una questione di qualche difficoltà, specialmente quando sono vecchie e denaturate, per esempio quando la loro composizione originale è stata modificata. È una pratica rara proposta nel caso dei materiali da musei. Esse sono state piuttosto analizzate in termini dei loro amminoacidi costituenti, dopo la loro liberazione per idrolisi acida. Inoltre, per quanto riguarda le proteine degli oggetti dei musei, non si può considerare che esista un unico ammino acido per determinate proteine, la cui presenza è sufficiente ad identificarle, ma l identificazione è spesso possibile attraverso un analisi quantitativa dei vari amminoacidi che la compongono. Un elenco delle generali composizioni amminoacidiche per una serie di proteine impiegata come adesivi e leganti è mostrata nella tabella 7.1. Può avvenire una epimerizzazione degli amminoacidi delle proteine nel centro asimmetrico quando essi sono liberati per idrolisi basica. La perdita di ammino acidi durante l'idrolisi avviene anche attraverso la formazione di acido ulmico. Queste sono sostanze marrone scuro formate per condensazione dei gruppi amminici (NH 2 ) ed il nucleo indolico del triptofano con le aldeidi formate in situ. 3

4 Tipi di proteine Collagene e cheratina Questi sono esempi di proteine fibrose, nelle quali le catena lineari polipeptidiche si allineano più o meno parallelamente l'una con l'altra. Il collagene è una proteina strutturale del tessuto connettivo negli animali e dei pesci, che include varie parti come pelle, tessuto muscolare, ossa e pelle. Come altre proteine fibrose il collagene è insolubile in acqua, ma quando bollito per lungo periodo, o trattato in una pentola a pressione con acqua surriscaldata, esso gradualmente viene lisciviato nel solvente in ebollizione come gelatina, e la proteina viene parzialmente degradata. Questa è liberamente solubile in acqua debolmente acida ed ha un peso molecolare di circa un terzo di quello del collagene. Gli studi strutturali del collagene mostrano che esso contiene molte sequenze di glicina, prolina, idrossiprolina che si ripetono. Si possono osservare tre separati filamenti di proteine ciascuna avvolta intorno all'altra in una conformazione ad alfa elica. Esse sono tenute insieme rigidamente in un generale complesso dovuto ad una forte interazione di legame idrogeno tra gli ossidrili del idrossiprolina e gli idrogeni amminici delle adiacenti unità di glicina. La gelatina risulta dunque dalla separazione dei tre filamenti, come conseguenza della rottura dei legami a idrogeno tra di loro, e la loro sostituzione con un legame a idrogeno invece con il solvente acqua. La soluzione del materiale lisciviato (per concentrazioni maggiori del 2%) si stabilizza per raffreddamento in un gel denso che ha potenti proprietà di adesivo nel seccarsi. Tale materiale, colla animale, ha, da tempo immemorabile, trovato una grande applicazione come adesivo forte per legno e tessuti, come legante per i pigmenti nelle pitture, e come adesivo della preparazione di imprimiture per dipinti su tela. Invece un trattamento moderato del collagene, per esempio una bollitura meno prolungata, produce materiali lievemente colorati conosciuti come gelatine, le colle tendono ad essere più scure, più spesse e più torbide come risultato della parziale solubilizzazione delle impurezze e della maggiore formazione di acido umico scuro. Le colle di pesce sono descritte avere una minore stabilità strutturale di quelle provenienti da sorgenti animali. Questa possibilità è legata alla minore proporzione di immino acidi (residui dell'idrossi prolina e della prolina) presenti nella molecola. La cheratina è una proteina strutturale trovata nei capelli, nel legno, nelle piume, nel corpo, nelle unghie negli zoccoli. È qualche volta più dura del collagene ed è molto insolubile come risulta dall'alto grado di ditio-legami incrociati -S-S- tra le catene. È quindi generalmente associata ad un alto contenuto di zolfo contenente ammino acidi come la cistina, tipicamente nella percentuale del 12% nel caso della lana o dei capelli. La tabella 7.2 dà una composizione degli amminoacidi per i diversi tipi di proteine. 4

5 Il processo di concia della proteina (generalmente pelle) per dare cuoio è un processo a due stadi nei quali tutta la cheratina presente nella pelle (capelli o strati di pelle epiteliale) è disciolta mediante scissione dei ditio-legami incrociati tra i residui di cistina attraverso l applicazione di un agente riducente. Il secondo stadio, la concia vera e propria, comporta la formazione di legami incrociati delle catene peptidiche del collagene per dare una stabilità strutturale extra delle fibre. Questo generalmente prende forma della condensazione con materiali fenolici polifunzionali conosciuti come tannini (10.2.8). Questa è stato proposto come la principale ragione per l eccellente conservazione dei corpi trovati immersi nelle paludi di torba, è cioè l'effetto dei tannini presenti in quell'ambiente. Le albumine Il nome albumina è spesso utilizzato per intendere il bianco dell'uovo, mentre il termine generale albumina si riferisce alla classe di proteine che si trova nelle uova e in alcuni altri materiali. Uova, sia intere, sia solo il rosso o il bianco, sono state ampiamente utilizzate come legante nella pittura, ed il rosso è conosciuto come il legante nella tempera a uovo. Le albumine sono facilmente solubili in acqua e appartengono alla classe conosciuta come proteine globulari. Esistono in una conformazione a sfera compatta per effetto dei legami idrogeno tra gruppi amminoacidi adiacenti in modo tale che i più polari, i gruppi 5

6 idrofilici si orientano verso l'esterno della superficie della sfera ed i gruppi idrofobici sono trattenuti all'interno. Inoltre, questa albumine rapidamente e denaturano, per effetto del calore e di alcuni reagenti, per azione dei quali si ritiene che esse diventano insolubili come, per esempio, quando un uovo viene bollito. Ciò che avviene è che i legami idrogeno interni si rompono e la struttura molecolare si apre e adottando una struttura a catena aperta, la generale idrofilicità viene persa. I due componenti dell'uovo, il bianco e il rosso, quantitativamente non mostrano differenze in termini di presenza di amminoacidi. Non di meno ci sono alcune sottili differenze quantitative ed è possibile distinguere tra i due mediante analisi, in alcuni casi favorevoli. Le proteine dell uovo contengono moderate quantità di asparagina, glutammina e leucina. I primi due residui sono convertiti nel corrispondente acido aspartico e acido glutammico per i idrolisi. Un analisi di questi amminoacidi in particolare permette la distinzione dei leganti pittorici della tempera ad uovo dalla colla o dalla caseina. La reale composizione delle uova in termini di proteine singole è abbastanza complessa ma è necessario qui solamente fare un breve accenno. Il bianco dell'uovo contiene una glicoproteina (per esempio una proteina legata ad un carboidrato), ovalbumina, come principale proteina, circa il 50% delle proteine del bianco dell'uovo nelle uova di gallina. Essa può essere ulteriormente separata in due componenti (a e b) mediante elettroforesi. Essa ha un peso molecolare complessivo di circa Tranne la caseina (vedi sotto), il bianco dell'uovo contiene solo una non-glicoproteina chiamata a lisozima. Questa ha un peso molecolare di circa ed è presente per circa il 3% nelle proteine del bianco dell'uovo. Un ulteriore 15% del bianco dell'uovo è composto da una seconda glicoproteina, la con albumina (peso molecolare 85000). La composizione degli ammino acidi per queste proteine sono descritti nella tabella

7 Il rosso dell'uovo è ricco di proteine che sono associate con lipidi contenenti fosforo e questi includono: fosfovitina (peso molecolare 21 mila), una proteina composta; e lipovitellina, lipoproteine contenenti fosfolipidi; e livetine. Caseina e latte Questi hanno trovato applicazione principalmente nella colla, colla forte, e occasionalmente come legante a tempera di latte. Il latte vaccino, uno dei più comuni, contiene circa il 5, 5% di grassi (tabella 3.2), il 4,9% di zuccheri o lattosio, e tra il 3 e il 5% di proteine. La principale proteina nel latte è la caseina, una fosfoproteina complessa, che può essere precipitata per acidificazione del latte scremato. Questo è quello che accade quando il latte viene trattato per fare il formaggio. Soprattutto, la caseina contiene circa l'1% di fosforo, principalmente nella forma di acido fosforico, che esterifica i gruppi ossidrilici della serina e in parte dell'acido glutammico. Le caseine sono insolubili in acqua e le principali frazioni sono: caseina, è essa stessa a comporre il 75%. Peso molecolare caseina peso molecolare caseina (3%). caseina. Peso molecolare e 26000, responsabile della stabilizzazione delle micelle di caseina. Queste caseine sono le principali componenti proteiche dei solidi provenienti dalla latte conosciuti come caglio. Quando lavato (con acido nel caso del materiale moderno commerciale) e asciugato, il prodotto è conosciuto come caseina.. Questo forma un impasto con acqua, ma in soluzioni alcaline, risulta una sospensione colloidale. Mentre le tradizionali ricette impiegano calce spenta per realizzare la soluzione, attualmente viene generalmente impiegata una soluzione di ammoniaca. Quanto il componente della caseina viene rimosso, rimane il siero, le cui proteine comprendono lattoalbumina (peso molecolare 16000) e lattoglobulina (peso molecolare 37000). In totale queste formano solo una piccola proporzione delle proteine del latte. Esse possono essere precipitate con una soluzione di solfato di ammonio. La composizione di amminoacidi per le maggiori proteine utilizzate nell'arte è mostrata in tabella

8 Proteine vegetali I semi delle piante leguminose ed i cereali contengono una quantità varia di proteine. Gli estratti acquosi hanno trovato applicazioni come paste ed adesivi. I semi o i fagioli del primo tipo di piante possono contenere il fino 50% di proteine in peso sul materiale secco e sgrassato. Generalmente i chicchi dei cereali contengono una media del 10% in peso di proteine. Per la maggior parte, soltanto lo 0, 5% del contenuto proteico totale dei semi è nella forma di albumina, la maggior parte del materiale proteinaceo ha le proprietà delle globuline, cioè, esse vengono precipitate dall'azione di soluzione al 50% di solfato di ammonio saturo rispetto all'albumina. Queste globuline possono essere ulteriormente suddivise in prolammine, che sono solubili in etanolo acquoso e gluteline che non si sciolgono né in alcol né in soluzioni saline, ma possono essere estratte mediante con acidi o alcali diluiti. Le globuline solubili includono quelle isolate dai semi di canapa (edestina), l excesina (noce del brasile), amandina (mandorle), legumina (lenticchie), gliadina (grano), zeina (cereali) e ordeina (orzo). Esse sono chiamate prolammine poiché esse sembrano avere un alto contenuto di acido immino. Inoltre alcune sembra che contengano grandi quantità di residui di acido glutammico (dalla glutammina). Di fatto la gliadina è conosciuta come contenere circa 40% di acido glutammico. (composizioni date nella tabella 7.5). 8

9 Tra le gluteline possiamo notare la glutenina, una sostanza appiccicosa, le cui proprietà risultano dai ditio gruppi tra subunità proteiche. Tabelle delle composizioni di ammino acidi per un grande intervallo di componenti delle proteine si possono trovare letteratura. Proprietà e durabilità Le proteine sono piuttosto stabili all'ossidazione e sono sottoposte a piccoli cambiamenti chimici in normali condizioni di temperatura e umidità. L'umidità è la loro nemica, non solamente perché questa può essa stessa a causare una lenta idrolisi dei legami peptidici e ridurre così il peso molecolare medio, ma anche perché essa permette il fiorire di funghi e batteri. Questi enzimi protolitici secreti rompono le proteine in maniera tale che gli amminoacidi possano essere digeriti dagli organismi. I cambiamenti che le proteine subiscono con l'invecchiamento portano per esempio alla diminuzione della solubilità della colla di gelatina, sono stati studiati da diversi autori. Birstein ha notato i cambiamenti all infrarosso che avvengono nella gelatina invecchiata artificialmente ed ha correlato ad essi i possibili cambiamenti nella struttura. Karpowicz ha fornito una generale resoconto dei cambiamenti delle proteine compresa una breve trattazione delle reazioni delle proteine con i lipidi ossidanti e con i carboidrati. 9

10 La fotochimica delle proteine e degli amminoacidi è stata messa in relazione con l ingiallimento della lana. Si è concluso che sia i legami peptidici che quelli cistinici vengono rotti dalla luce, in particolar modo quella ultravioletta. Analisi delle proteine L'analisi delle proteine è maggiormente di interesse in relazione con il loro utilizzo come leganti nella pittura e come adesivo, sebbene i residui nelle giare o nelle pentole sono state qualche volta identificate come particolari proteine. Sebbene per la maggior parte dei materiali come cuoio o fibre animali, raramente sono richieste analisi per indicare con esattezza la loro natura, non di meno sono state effettuate analisi degli amminoacidi di antiche fibre proteiche. Un sottile strato di materiale in una scatola del primo secolo dopo Cristo è stato identificato come corno. Quando è disponibile una quantità di campione sufficiente, l'idrolisi della proteina è di gran lunga l approccio preferito nell'analisi della composizione amminoacidica. La cromatografia su carta è stata applicata al problema già 40 anni fa ed ha portato a convincenti identificazioni. Recentemente anche metodi modificati sono stati raccomandati, in particolar modo la cromatografia su carta circolare che permette che differenti reagenti siano applicati a differenti sezioni del cromatogramma. La cromatografia su strato sottile è stata facilmente utilizzata per la sua grande convenienza. Tutto questo lavoro è stato fatto con amminoacidi liberi usando reazioni colorimetriche con ninidrina come metodo per la visualizzazione delle macchie. Sfortunatamente questo ha come svantaggio che questo reagente reagisce solo piuttosto debolmente con l idrossiprolina, l amminoacido particolarmente importante per l'identificazione della gelatina. Una procedura migliorata che usa derivati di amminoacidi è stata raccomandata. Questa utilizza il dansilderivato (il 5 dimetilamminonaftalensulfonile) che facilmente sintetizzabile e che può essere rilevato su strato sottile per la sua fluorescenza alla luce ultravioletta a livelli di meno di E richiesta abilità a distinguere tra gelatina, caseina, rosso e bianco dell'uovo. Gli stessi derivati sono stati anche usati per separazioni su piatti di micropoliammide, dove uovo e colla proteica possano essere facilmente distinti. I due metodi descritti sopra non permettono facilmente una stima quantitativa degli amminoacidi che, come abbiamo precedentemente indicato, è necessaria per una sicura identificazione. E stata molto utilizzata per molti anni negli studi biochimici un analizzatore di amminoacidi cioè una macchina che impiega la cromatografia a scambio ionico e la quantificazione automatica usando la ninidrina come reazione colorimetrica per una stima quantitativa, ma è stata poco usata per i materiali di musei, in parte a causa delle relativamente grandi quantità di campione (0, 3 milligrammi) necessarie, sebbene tale studio abbia assicurato buoni risultati. Lo stesso metodo è stato utilizzato per 10

11 l'identificazione della vernice trovata su certe zone pigmentate della tomba di Nefertari nei dipinti con bianco d'uovo. La gas cromatografia ha, come sempre, grandi vantaggi per quanto riguarda campioni di piccola dimensione e una facile quantificazione, ma lo svantaggio che sia gli ammino gruppi che gli acidi carbossilici degli amminoacidi devono essere derivatizzati per ottenere l adeguata volatilità. Un semplice approccio a questo è di sililare entrambi i gruppi in una volta sola. Un altro è di preparare esteri di metile degli acidi e convertire gli ammino gruppi nel loro trifluoroacetati. Un applicazione sperimentale della cromatografia liquida ad alta pressione è di esaminare le proteine idrolizzate (dopo la conversione degli amminoacidi nei loro derivati 3 fenil-2-tioidantoina) è stato eseguita, senza mostrare però alcun particolare vantaggio rispetto alla gascromatografia. Più recentemente un sistema commerciale integrato di idrolisi/derivatizzazione/hplc è stato usato per esaminare standard e reali campioni di pittura, e anche per determinare l'effetto sui risultati dei pigmenti presenti con il campione durante l'idrolisi. I campioni sono stati idrolizzati con vapore da acido cloridrico 6N a 110 C per ventiquattr'ore in atmosfera inerte. I campioni idrolizzati sono stati quindi convertiti nei loro derivati di isotiocianato ed iniettato in un adatta soluzione tampone in una colonna HPLC. Sono stati ottenute eccellenti separazioni dei 17 amminoacidi, la rilevazione è stata effettuata mediante assorbanza ultravioletta a 254 nm. La quantificazione dei componenti è stata fatta utilizzando un programma di elaborazione dati on line con riferimento ad una tavola di calibrazione e a standard interni. La proteina dell'uovo e del collagene sono state facilmente distinte, ma con i reali campioni dai dipinti di Cosimo Tura i risultati non sono stati così facili da interpretare in termini di tecnica pittorica e in alcuni è risultato che contenessero entrambi i materiali. È stato trovato che quando i campioni sono stati idrolizzati in presenza del pigmento malachite contenente rame, gli amminoacidi sono stati ridotti a livelli inferiori. La presenza di legami ammidici nelle proteine forniscono certe bande di assorbimento caratteristiche nello spettro infrarosso di questi materiali e la spettrometria infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) viene considerata come una promessa per la rilevazione in piccoli campioni di pittura. L'FTIR ha mostrato del materiale di vernice scolorita su un dipinto di Van Gogh era bianco d'uovo, apparentemente applicato come una misura temporanea e mai rimosso. Un approccio per identificare le proteine come tali, piuttosto come idrolizzato, è mediante metodi immunologici. Questo è basato sulla reazione di una proteina all'antisiero a quella proteina., prodotto nei conigli con cui è stata inoculata. Il metodo è stato investigato più di 20 anni fa con un certo successo ed è stato recentemente applicato per ulteriori studi. In questo ultimo lavoro, sebbene la fluorescenza fosse debole, i risultati erano riproducibili e una risposta positiva per i bianco dell uovo era stato ottenuto con un certo numero di campioni di una antica pittura. Qualche volta i campioni sono troppo piccoli e si può sperare semplicemente mettere in evidenza la proteina, senza identificarla specificatamente. Un certo numero di test per campioni 11

12 sono applicabili con questa finalità, basati principalmente sulla liberazione di vapori alcalini di ammoniaca o ammine quando la proteina è riscaldata da sola o in presenza di basi, vapori che possono essere rilevati con indicatori di carta. Un test per la colla o la gelatina, basato sulla presenza di piccole quantità di idrossiprolina libera è una reazione colorimetrica molto sensibile conosciuta come test modificato di Ehrlich. Risposte a agenti coloranti sono state piuttosto largamente usate per rilevare o identificare leganti proteici in sezioni stratigrafiche. Questo sarà riportato in una discussione generale di questo approccio nel capitolo 12. Datazione amminoacidica di materiali proteici È stato notato che gli amminoacidi meno termodinamicamente stabili sono carenti o totalmente assenti nelle proteine fossilizzate. Nel laboratorio questo fenomeno può essere simulato mediante riscaldamento controllato sia delle proteine che degli amminoacidi. In alcuni casi ci sono rotture del materiale che portano a differenti amminoacidi, mentre avvengono anche fenomeni di epimerizzazione ai carboni asimmetrici. Esempi del primo caso includono l arginina convertita in ornitina e citrullina e l'acido aspartico convertito in -alanina: Le illustrazioni delle epimerizzazione includono la formazione di alloisoleucina dalla isoleucina e quella dell acido D aspartico dalla forma naturale L. 12

13 Le cinetica di queste reazioni sono state misurate a differenti temperature elevate (per dare quantità misurabili di prodotti in brevi periodi) le velocità potevano essere previste attraverso l'estrapolazione di Arrhenius, per temperature più vicine a quelle medie per i fossili e materiali archeologici. Una volta che questi parametri sono stati stabiliti, un analisi quantitativa del rapporto di degli amminoacidi epimeri, o dei prodotti di decomposizione e precursori, permette di stimare l'età (per esempio il tempo di reazione). In generale l epimerizzazione dell'acido aspartico sembra permettere la datazione più attendibile dei campioni da circa mille anni prima di Cristo a 100 mila anni prima di Cristo. Questo per la maggiore precisione analitica con cui questi polimeri possano essere determinati. Ciò nonostante, studi su ossa fossili e denti di oltre anni a.c hanno mostrato apparenti anomalie. L epimerizzazione dell'isoleucina ad alloisoleucina, significativa su una scala di tempo più lunga, sembra qui offrire una soluzione. Le tecniche di datazione con amminoacidi sembrano possano essere applicate a materiali antichi almeno come il miocene (26 milioni prima di Cristo). Dubbi sono stati avanzati sul metodo nel suo complesso, almeno per le ossa e per i denti del tardo periodo (110 mila prima di Cristo). Le datazioni dal rapporto di racemizzazione non si accordano con quelle ottenute da altri metodi presumibilmente più assoluti, che coinvolgono rapporti isotopici ( 230 Th/ 234 U). Gli amminoacidi possono anche essere coinvolti in altri modi nelle procedure di datazione, vale a dire nella datazione al carbonio 14 delle ossa. Per evitare successive contaminazioni gli amminoacidi puri devono essere isolati dal collagene delle ossa e essere sottoposti al procedimento di datazione al carbonio 14 direttamente, invece di usare l'intera proteina. 13