Contributo alla valorizzazione del vino Valpolicella D.O.C. mediante l isolamento, la caratterizzazione. impiego di lieviti specifici RIASSUNTO

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1 Direzione scientifica: Mario FREGONI (Viticoltura) Aureliano AMATI (Enologia) Referente tecnico: Matteo MARENGHI Comitato referees: Luigi BAVARESCO (Piacenza - Italia) Maurizio BOSELLI (Firenze - Italia) Giorgio CALABRESE (Piacenza - Italia) Antonio CALÓ (Conegliano Veneto - Italia) Mario CASTINO (Asti - Italia) Giuseppe CERUTTI (Milano - Italia) Piero CRAVEDI (Piacenza - Italia) Giovanni FARRIS (Sassari - Italia) Claude FLANZY (Francia) Sergio GALASSI (Bologna - Italia) Rivista Italiana di Enologia Viticoltura e Mercati R I C E R C A Contributo alla valorizzazione del vino Valpolicella D.O.C. mediante l isolamento, la caratterizzazione ed il successivo impiego di lieviti specifici di Fabio Zilio* - Emanuele Tosi** - Angiolella Lombardi* - Claudio Delfini*** Alberto GARCIA DE LUJAN (Spagna) Anna Maria GATTUSO (Palermo - Italia) Cesare INTRIERI (Bologna - Italia) Biagio MINCIONE (Reggio Calabria - Italia) Gianfranco MONTEDORO (Perugia - Italia) Michel MOUTONNET (Francia) François MURISIER (Svizzera) Stefano PONI ( Piacenza - Italia) David SAAYMAN (Sudafrica) Attilio SCIENZA (Milano - Italia) Richard SMART (Australia) Vincente SOTES (Spagna) Mario UBIGLI (Asti - Italia) Giuseppe VERSINI (Trento - Italia) Carlo ZAMBONELLI (Bologna - Italia) Roberto ZIRONI (Udine - Italia) RIASSUNTO Nel presente lavoro sono riportati i risultati di uno studio sulla caratterizzazione e la selezione di lieviti Saccharomyces specifici per il vino Valpolicella DOC, un vino rosso che si ottiene da un uvaggio composto dalle tre varietà Corvina, Rondinella e Molinara. Da uve e da mosti in fermentazione raccolti nella zona di produzione del vino Valpolicella sono stati isolati 908 ceppi di Saccharomyces. La successiva valutazione in mezzo sintetico del vigore fermentativo e di altri parametri di interesse tecnologico ha portato alla selezione di 314 ceppi che sono stati sottoposti ad una seconda fase di caratterizzazione basata sull allestimento di microvinificazioni in laboratorio. Ciò ha consentito di individuare 15 ceppi dotati di proprietà sensoriali ed attitudini enologiche interessanti. Le vinificazioni sperimentali effettuate utilizzando questi 15 ceppi hanno portato alla selezione di due ceppi di Saccharomyces cerevisiae particolarmente caratterizzanti per il vino Valpolicella. SUMMARY In the present work we report the results of a study on the characterization and selection of Saccharomyces strains specific for Valpolicella DOC wine, a red wine obtained with the three grape varieties Corvina, Rondinella and Molinara. A total of 908 Saccharomyces strains were isolated from grapes and fermenting musts collected in the producing area of Valpolicella wine. Evaluation of their fermentative activity and other oenological relevant characteristics in a synthetic medium allowed the selection of 314 strains that were then further characterized using an approach based on the preparation of lab-scale vinifications. This allowed us to evidence a group of 15 strains showing interesting sensorial and oenological characteristics. When tested in wine-making trials in cellar, two Saccharomyces cerevisiae strains were selected as specific for Valpolicella wine. INTRODUZIONE Numerosi studi (Delfini et al., 1995;Delfini et al., 2001; Zambonelli, 1988; Cocito et al., 1998) hanno da tempo sottolineato l esistenza di un contributo differenziato tra i ceppi selezionati di Saccharomyces cerevisiae o di altre specie vinarie nella determinazione dei caratteri olfattivi e gustativi dei vini bianchi e rossi. Salvo pochi casi (quali il Sauvignon Blanc, il Traminer eil Cabernet Sauvignon), la maggioranza dei vitigni non aromatici finora studiati ha rivelato all analisi gascromatografica l esistenza di composti odorosi già noti, sebbene in differenti rapporti quantitativi da vitigno a vitigno e da lievito a lievito. Per alcuni vitigni a bacca bianca, quali il Blanc de Morgex-La Salle e il Moscato di Chambave, si è potuto inoltre dimostrare che tale differente rapporto quantitativo di composti volatili già noti, si correlava significativamente con la preferenza olfattiva espressa da esperti assaggiatori (Cocito e Delfini, 2000). Quanta parte di tale correlazione fosse dovuta a composti volatili formati ex novo o a quelli liberati dal lievito da precursori del vitigno, resta ancora da verificare. Studi recenti di Delfini et al. (2001) sulla formazione della particolare nota aromatica del vino rosso Ruché di Castagnole Monferrato (vino ottenuto dall omonimo vitigno Ruché, il cui mosto è privo di aromi liberi) hanno comunque potuto definitivamente dimostrare che il lievito contribuisce in modo determinante nell espressione delle caratteristiche aromatiche che originano dal vitigno. Tale contribuito si esprime durante la moltiplicazione cellulare del lievito, si completa nel corso della * Veneto Agricoltura - Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari, Thiene (Vi) ** Centro per la Sperimentazione in Vitivinicoltura - Provincia di Verona, S. Floriano (Vr) *** Istituto Sperimentale per l Enologia, Sezione di Microbiologia, Asti 1

2 fermentazione alcolica e si somma a quello dovuto ai composti volatili aromatici provenienti dal metabolismo fermentativo. È stato inoltre messo in evidenza che i precursori aromatici varietali sono differentemente contenuti nelle bucce, nei semi e nella polpa dai quali il lievito produce differenti note olfattive (Delfini et al., 2001). Il presente studio descrive le metodologie adottate e i risultati ottenuti in un lavoro mirato alla selezione di lieviti specifici miglioratori del Valpolicella D.O.C., un vino rosso che si ottiene da un uvaggio composto principalmente dalle tre varietà Corvina, Rondinella e Molinara. Si è voluto verificare, in particolare, la metodologia di selezione più idonea per l individuazione di un ceppo di lievito impiegabile per l ottenimento di un vino vinificato in presenza delle bucce e che si avvale oltretutto del concorso di tre differenti vitigni. Studi preliminari (Cocito et al., 1998) avevano, infatti, indicato che se per ciascun vitigno può essere individuato un ceppo specifico, un uvaggio composto da più vitigni può essere considerato alla stregua di un solo vitigno durante la selezione del lievito specifico. MATERIALI E METODI Origine dei campioni I campioni di uve e mosti da cui sono stati effettuati gli isolamenti sono stati prelevati nel corso della vendemmia 1998 da 10 aziende di tipologia tradizionale che non ricorrevano all uso di lieviti selezionati. Per i mosti, si sono effettuati due prelievi direttamente dalle vasche, il primo a circa metà fermentazione ed il secondo a fine fermentazione. Nel caso delle uve sono stati invece prelevati in punti diversi e rappresentativi dei vigneti, grappoli delle tre varietà Corvina, Rondinella e Molinara. Le tre varietà sono state ammostate in laboratorio mantenendo le proporzioni di un uvaggio considerato rappresentativo del vino Valpolicella (60% Corvina, 30% Rondinella e 10% Molinara). Anche in questo caso sono stati eseguiti prelievi a metà e a fine fermentazione. I campioni così ottenuti sono stati, dopo opportune diluizioni, seminati su piastre di agar WL (Oxoid). Dopo tre giorni di incubazione a 20 C, sono state prelevate, secondo la tecnica dei numeri randomizzati, 30 colonie che evidenziavano l aspetto tipico di Saccharomyces cerevisiae. Le colonie sono state successivamente purificate con un secondo passaggio in agar WL e conservate sia in slant di agar mosto non tamponato per il mantenimento a 4 C, sia in glicerolo per il mantenimento a 80 C. Caratterizzazione enologica degli isolati 2 Vigore fermentativo, adesività, produzione di schiuma Il vigore fermentativo è stato testato in 100 ml di terreno MNS (Delfini, 1995) al 22% di glucosio, sterilizzato mediante filtrazione amicrobica su membrane in acetato di cellulosa. Per la preparazione dell inoculo si è proceduto come descritto da Zilio et al. (2000). L incubazione è avvenuta a 20 C e giornalmente è stato registrato, tramite pesata, il calo peso dovuto a perdita della CO 2 svolta in fermentazione. Per la valutazione del parametro, si sono presi in considerazione i valori rilevati dopo 2 e 7 giorni di incubazione e a fine fermentazione. Durante l incubazione si è inoltre proceduto alla valutazione visiva dell adesività e della produzione di schiuma. Infine, a fine fermentazione è stata effettuata una valutazione olfattiva dei fermentati. Produzione di idrogeno solforato La capacità di produzione di idrogeno solforato è stata determinata, come indicato da Zambonelli (1988), nel terreno BiGGY (Difco). Sulla base della colorazione della colonia sono state distinte 4 categorie di ceppi: B (colonia di colore bianco), BG (colonia di colore beige), MC (colonia di colore marrone chiaro) e MS (colonia di colore marrone scuro). Vigore fermentativo a bassa temperatura Il vigore fermentativo a bassa temperatura è stato determinato in MNS con la stessa metodologia e la stessa formulazione impiegata per il vigore fermentativo, incubando però a 13 C e registrando il calo peso per 5 settimane. Fig. 1 - Profili di restrizione del DNA mitocondriale dei ceppi della selezione finale e di alcuni ceppi di riferimento. Profili: 1- OM18; 2-LM18; 3-CF16; 4-GM4, 5-MF16, 6-IF22; 7-PM11; 8-OF13; 9-LF5; 10-HF17; 11-GF2; 12- NM2; 13-ZF27; 14-S. cerevisiae DBVPG 6173; 15-OM23; 16-OF17; 17-S. cerevisiae NCYC 187; 18- S. cerevisiae NCYC 167. Potere alcoligeno assoluto Il potere alcoligeno assoluto, che rappresenta la misura del volume massimo di alcol etilico che può essere prodotto in presenza di un eccesso di zuccheri, è stato determinato in modo analogo al vigore fermentativo, ma con MNS arricchito di glucosio al 30% (Delfini, 1995). Resistenza all anidride solforosa La resistenza all anidride solforosa, intesa come attitudine a superare l inibizione di una dose enologica di SO 2 molecolare, è stata determinata in modo analogo al vigore fermentativo in MNS contente saccarosio anziché glucosio ed addizionato di 50 mg/l di SO 2 come potassio metabisolfito (Delfini, 1995). Sono stati valutati sia il numero di giorni impiegati per superare l inibizione ed avviare la fermentazione sia il calo in peso dopo 7 giorni e a fine fermentazione. Microvinificazioni in laboratorio Nella seconda fase di selezione è stato scelto un approccio che evidenziasse maggiormente gli aspetti organolettici, intesi come sensoriali, piuttosto che quelli strettamente compositivi dei vini ottenuti. A tale scopo, è stato necessario mettere a punto un metodo di microvinificazione in laboratorio che tenesse conto delle varie problematiche tecnologiche, come le proporzioni di uvaggio tipiche del vino Valpolicella e il giusto equilibrio tra parti solide e mosto. Nel corso della vendemmia, sono stati prelevati e mantenuti separati grappoli sani e ben maturi dei tre vitigni Corvina, Rondinella e Molinara. In laboratorio sono state, quindi, ottenute tre masse di acini (una per vitigno) recidendone il pedicello e scartando gli acini non sani o lesionati. Ciascuna delle tre masse è stata in seguito mescolata con cura a mano, in modo da aumentarne la distribuzione casuale. In singoli sacchetti di plastica, sono stati, infine, pesati 120 g di acini di Corvina, 60

3 RICERCA TABELLA 1 Caratteristiche enologiche dei lieviti della selezione finale Tutti i parametri sono espressi come g CO2/100 ml; ff = fine fermentazione; gg x if = giorni necessari per iniziare la fermentazione. Vigore fermentativo Potere alcoligeno Ass. Resistenza alla SO2 Vigore fermentativo a 13 C Ceppo 2 gg 7 gg ff 2 gg 7 gg ff gg x if 2 gg 7 gg ff 2 gg 7 gg 14 gg 21 gg 28 gg 35 gg CF16 1,90 6,39 9,70 1,74 6,17 12,94 2 1,17 5,99 10,92 0,30 3,32 5,94 7,77 8,68 9,11 GM4 1,97 6,06 9,82 2,36 6,37 10,76 2 1,33 5,91 10,80 0,43 3,23 5,40 7,03 8,05 8,72 GF2 1,75 5,59 9,10 2,18 6,32 10,91 2 1,10 5,65 10,27 0,34 2,93 4,97 6,31 7,10 7,85 HF17 1,86 6,04 9,90 1,92 5,93 12,12 2 0,83 5,73 10,68 0,28 3,03 5,08 6,44 7,37 8,26 IF22 1,91 6,41 9,70 2,06 6,37 12, ,19 2,43 4,76 6,64 7,71 9,71 LF5 1,98 6,20 9,15 1,46 5,30 12, ,13 11,30 0,22 2,71 4,61 6,06 6,94 7,80 MF16 2,00 6,13 9,68 2,14 6,51 12, ,25 3,01 4,93 6,20 6,97 7,75 NM2 1,70 5,29 9,36 2,27 5,82 9,85 2 0,73 5,73 10,67 0,15 1,89 3,89 5,62 6,70 7,66 OM23 1,89 6,29 9,85 1,88 6,46 12,76 2 0,67 6,00 11,10 0,17 2,88 5,16 6,80 7,91 8,71 OF13 1,88 5,81 9,74 2,19 6,50 13,43 2 1,15 5,67 11,40 0,13 2,63 4,76 6,31 7,27 8,50 OF17 2,04 6,82 9,81 2,16 6,65 11,57 2 0,48 5,55 10,80 0,10 2,60 5,06 6,71 7,60 8,40 PM11 1,84 6,38 9,82 2,07 6,66 13,15 2 0,80 5,80 11,64 0,12 2,47 4,72 6,12 6,92 7,64 ZF27 1,96 6,59 9,78 2,35 6,81 11,60 1 1,90 6,57 11,23 0,16 2,92 5,34 7,05 8,09 8,86 g di Rondinella e 20 g di Molinara, ottenendo delle monodosi di 200 g di uvaggio Valpolicella. Si è quindi provveduto a pigiarne manualmente il contenuto e a conservarlo per congelamento a 20 C. Una volta scongelato, il contenuto è stato travasato in beute di fermentazione sifonate da 250 ml e inoculato con il ceppo da esaminare ad una concentrazione finale di circa 3,5 x 10 6 UFC/ml. Ad ogni rilevamento del calo di peso, con agitazioni ed inclinazioni del contenuto, si è prestata molta attenzione nel cercare di reimmergere le vinacce affiorate e di risospendere il deposito dal fondo della beuta. Dopo 8 giorni si è proceduto alla svinatura recuperando un volume totale di circa 130 ml. Al raggiungimento del calo di peso costante la fermentazione è stata considerata conclusa e si è effettuato un primo travaso per eliminare le fecce più grossolane; il vino raccolto in beute più piccole è stato lasciato a 4 C per almeno 4 giorni per la decantazione. Una volta limpido, il vino è stato travasato in bottigliette da 100 ml successivamente chiuse con tappo a corona e mantenute a 10 C fino al momento della verifica sensoriale effettuata da un gruppo ristretto di esperti del vino Valpolicella. Caratterizzazione metabolica dei ceppi della selezione finale I ceppi della selezione finale sono stati inoculati in MNS ed ulteriormente caratterizzati per alcuni parametri di interesse enologico. A fine fermentazione, i fermentati sono stati sterilizzati per filtrazione amicrobica su filtro in acetato di cellulosa e sottoposti alle seguenti determinazioni analitiche: contenuto in acido acetico, aldeide acetica e glicerolo mediante reazione enzimatica (Boehringer-Mannheim). contenuto in anidride solforosa mediante titolazione iodometrica. contenuto in etanolo mediante metodo per distillazione. contenuto in acido piruvico ed acido succinico mediante HPLC. degradazione/produzione di acido malico mediante reazione enzimatica (Boehringer-Mannheim). In questo caso la valutazione è stata effettuata in MNS addizionato di 3 g/l di acido L-malico. Caratterizzazione genetica ed identificazione dei ceppi Per l identificazione dei ceppi a livello di specie è stato utilizzato il metodo RAPD- PCR descritto da Andrighetto et al. (2000), mentre per discriminare la presenza di ceppi diversi è stata impiegata l analisi dei profili di restrizione del DNA mitocondriale. Quest ultima è stata effettuata seguendo la metodica riportata da Querol et al. (1992) con alcune modifiche (Zilio et al., 1998) e utilizzando come enzima di restrizione Rsa I (Boehringer- Mannheim). L elettroforesi è stata effettuata in gel d agarosio 0,7%, in tampone TBE, a 100 V per circa 2 ore. Le foto dei profili di restrizione sono state trasferite su computer mediante scanner (Epson GT-8000), memorizzate in formato TIFF ed elaborate utilizzando il programma Gel Compar versione 4.0 (Applied Maths, Kortryiik, Belgio). Vinificazioni sperimentali in cantina I lieviti dotati delle caratteristiche enologiche e sensoriali più interessanti sono stati utilizzati in vinificazioni sperimentali. Le vinificazioni, effettuate presso la Cantina Sperimentale del Centro per la Sperimentazione in Vitivinicoltura della Provincia di Verona, hanno utilizzato l uvaggio classico previsto per il vino Valpolicella. Per rendere omogenee le partite da vinificare si è proceduto alla raccolta dell uva in cassette in modo randomizzato. La pigiatura è stata effettuata nello stesso giorno della raccolta; dal pigiato per ogni prova si è prelevato un campione di mosto per la valutazione degli zuccheri, dell acidità totale e del ph. Alle masse sono stati addizionati sali di ammonio, tannino, solforosa (40 mg/l) e sono stati quindi inoculati i lieviti, precedentemente propagati in mosto, nella misura del 10%. La capacità di colonizzazione da parte dei lieviti inoculati è stata verificata mediante l analisi dei profili di restrizione del DNA mitocondriale di 20 colonie prelevate a metà ed a fine fermentazione. La svinatura è avvenuta quando il vino risultava privo di zuccheri fermentescibili; successivamente, si è proceduto ai travasi e all integrazione di SO 2. Infine i vini sono stati filtrati e imbottigliati. RISULTATI Selezione dei ceppi. Fase I: verifica delle attitudini tecnologiche in mezzo sintetico Dalle uve e dai mosti prelevati nelle 10 cantine di produzione del vino Valpolicella sono stati isolati 908 ceppi di presunti Saccharomyces, di cui 480 derivanti da mosti e 428 da uve ammostate in laboratorio. Come descritto in Materiali e Metodi, una prima fase di selezione si è basata sulla valutazione del vigore fermentativo in MNS e sulla valutazione olfattiva dei fermentati. Come parametri accessori sono stati rilevati, inoltre, il tipo di sviluppo (flocculento o polverulento), l adesività, l entità della formazione di schiuma e la produzione di H 2 S. Sono stati considerati per una successiva caratterizzazione i ceppi che presentavano elevato vigore fermentativo, bassa produzione di schiuma, assenza di adesività e sensazione olfattiva neutra o aromatica. Dai 908 ceppi sottoposti a questo tipo di selezione, sono stati così individuati 314 ceppi da sottoporre alla seconda fase di caratterizzazione. Selezione dei ceppi. Fase II: caratterizzazione in mosto d uva I 314 lieviti derivati dalla selezione effettuata in MNS sono stati testati in laboratorio secondo la procedura di microvinificazione descritta nei Materiali e Metodi. Nel corso della valutazione sensoriale si è cercato di individuare i ceppi in grado di 3

4 Parametri TABELLA 2 Parametri chimici dei fermentati in MNS ottenuti dai ceppi della selezione finale Ceppi CF16 GM4 GF2 HF17 IF22 LF5 MF16 NM2 OM23 OF13 OF17 PM11 ZF27 Glucosio residuo (g/l) 0,07 0,11 0,30 0,07 0,04 0,04 0,11 3,23 0,04 0,07 0,07 0,03 0,18 Etanolo prodotto (% v/v) 12,08 12,16 11,48 12,30 12,00 11,24 12,08 12,00 12,16 12,08 12,16 12,16 12,08 Glicerolo prodotto (g/l) 3,7 3,9 3,9 3,7 3,9 4,0 3,6 3,7 3,5 4,1 4,1 3,7 5,0 Ac. acetico prodotto (g/l) 0,45 0,40 0,28 0,43 0,48 0,30 0,32 0,39 0,40 0,47 0,44 0,53 0,51 Acetaldeide prodotta (mg/l) Ac. piruvico prodotto (mg/l) Ac. succinico prodotto (mg/l) Ac. L-malico degradato (%) 20,7 20,7 17,2 17,2 27,5 24,0 10,3 13,8 20,6 10,3 17,2 17,2 20,6 TABELLA 3 Analisi chimiche dei vini della vendemmia 2000 relative ai cinque ceppi selezionati OF13 OM23 MF16 LF5 PM11 Potassio mg/l Polifenoli tot. A 760 mm (in ac. gallico) mg/l Antociani totali (in malvina glucoside) mg/l Acido lattico totale g/l 0,30 0,20 0,30 0,35 0,25 Acido tartarico g/l 4,55 4,35 5,40 4,65 4,15 Acido malico g/l 0,90 1,00 1,55 0,90 1,15 Acido totale in acido tartarico g/l 6,40 6,60 7,20 6,30 7,00 Acido D-lattico g/l < 0,20 < 0,20 < 0,20 < 0,20 < 0,20 ph 3,04 2,92 2,89 3,01 2,92 Titolo alcolom. volum. effettivo ml/100ml 11,68 11,17 11,19 11,34 11,29 Densità relativa a 20 C 0,993 0,994 0,994 0,993 0,994 Estratto secco totale g/l 21,4 22,1 22,7 21,4 22,2 Zuccheri riduttori espressi in zucch. inv. g/l 1,2 1,2 1,1 1,2 1,1 Estratto ridotto g/l 21,2 21,9 22,6 21,2 22,1 Acidità volatile in ac. acetico-so2 g/l 0,33 0,26 0,30 0,31 0,34 Glicerina g/l 7,80 7,40 8,30 7,50 8,00 esaltare la formazione di aromi tipici, in particolare di aromi fruttati (ciliegia amarena), che caratterizzano il vino Valpolicella, eliminando contemporaneamente quelli con odori anomali o con residui zuccherini elevati, indice di fermentazione incompleta. Sono stati così evidenziati 15 ceppi dotati di proprietà sensoriali ed attitudini enologiche interessanti. Selezione dei ceppi. Fase III: ulteriore verifica delle attitudini tecnologiche e metaboliche in MNS, caratterizzazione genetica e vinificazioni sperimentali in cantina I risultati delle prove di caratterizzazione a cui sono stati sottoposti i 15 ceppi derivati dalla seconda fase di selezione sono riportati nella tabella 1. Sono stati esclusi dalla tabella i dati relativi ai ceppi LM18 e OM18 in quanto questi ultimi, pur presentando delle caratteristiche interessanti in mosto d uva, hanno evidenziato notevoli difficoltà di sviluppo nel Mezzo Nutritivo Sintetico. Per quanto riguarda il vigore fermentativo, i dati ottenuti a fine fermentazione non evidenziano sostanziali differenze tra i ceppi (valori sempre > 9 g di CO 2 /100 ml), in quanto i ceppi considerati erano comunque stati scelti nella prima fase di selezione proprio in relazione alla loro capacità di portare a termine la fermentazione. Una maggiore variabilità può essere invece rilevata nei dati di vigore fermentativo a 2 e 7 giorni (tabella 1). Nel caso del vigore fermentativo a 2 giorni si può rilevare che la maggioranza dei ceppi considerati presenta un vigore fermentativo superiore a 1,8 g di CO 2 /100 ml, caratteristica importante in quanto correlata alla rapida capacità di colonizzazione del lievito durante la fase iniziale della fermentazione. Per il carattere potere alcoligeno assoluto si nota una certa variabilità tra i ceppi nei dati rilevati a 2 e 7 giorni, così come in quelli relativi alla fine fermentazione (tabella 1). Otto ceppi su 13 si attestano su valori di calo in peso a fine fermentazione > 12 g di CO 2 /100 ml, corrispondenti a tenore alcolico superiore a 15% vol., e quindi sufficiente per consentire la completa fermentazione dei mosti naturali. Per quanto riguarda lo sviluppo a bassa temperatura, tutti i ceppi sono stati in grado di avviare il processo fermentativo a 13 C evidenziando dopo 7 giorni di incubazione un calo in peso generalmente superiore a 2 g di CO 2 /100 ml (tabella 1). Relativamente alla resistenza all anidride solforosa, i ceppi IF22 e MF16 non sono stati in grado di avviare il processo fermentativo (tabella 1). Nel terreno BiGGY agar per la valutazione della produzione di idrogeno solforato, la quasi totalità dei ceppi si è presentata con colonie di colore marrone chiaro. Tre soli ceppi (LM18, OM18 ed OM23) hanno dato colonie beige indice di una produzione molto bassa di idrogeno solforato. Nella tabella 2 sono riportati i valori di diversi parametri chimici nei prodotti della fermentazione in MNS ad opera dei ceppi della selezione finale. I primi due parametri riportati in tabella (glucosio residuo, percentuale di etanolo prodotto) sono correlati all efficienza fermentativa dei lieviti testati. Ad eccezione del ceppo NM2, tutti i ceppi portano a secco la fermentazione. L alta produzione di glicerolo è un carattere considerato positivo, in quanto questo composto contribuisce alla sensazione di corpo e rotondità del vino. Come si osserva nella tabella 2, la produzione di questo composto in MNS va da 3,5 a 5,0 g/l, confermando i dati di letteratura che indicano per S. cerevisiae una produzione di glicerolo tra 3,5 e 6,0 g/l (Delfini e Formica, 2001). La produzione di acido acetico rientra per tutti i ceppi nei valori medi di 0,1-0,6 g/l ritenuti non percettibili all olfatto (Delfini, 1995). La produzione di acetaldeide, pur essendo comune a tutti i ceppi, risulta bassa (tra 7 e 16 mg/l), mentre la produzione di acido succinico, un acido organico che, contribuendo alla sapidità di gusto più che all acidità fissa, influisce particolarmente sulla qualità dei vini, è compresa tra mg/l. La produzione di acido piruvico, il cui accumulo nel vino potrebbe comportare la comparsa di odori sgradevoli, si mantiene bassa in tutti i ceppi testati (tabella 2). Infine, per quanto riguarda la degradazione di acido malico, tutti i ceppi testati sono in grado di degradarlo con intensità che varia considerevolmente in funzione del ceppo (10,3-27,5%). Caratterizzazione genetica La RAPD-PCR ha consentito di assegnare i 15 ceppi della selezione finale alla specie Saccharomyces cerevisiae. L analisi dei profili di restrizione del DNA mitocondriale ha evidenziato un notevole polimorfismo tra i ceppi (figura 1). Tutti i ceppi della selezione finale sono infatti risultati diversi. È interessante notare come i profili di restrizione dei ceppi 4

5 RICERCA OM18 e LM18 caratterizzati da una scarsa attitudine fermentativa in mezzo sintetico siano simili tra loro e comunque molto diversi in quanto a dimensione dei frammenti di DNA rispetto agli altri ceppi isolati da mosto Valpolicella e ad alcuni ceppi di riferimento della specie S. cerevisiae. La stessa metodologia applicata per monitorare la colonizzazione dei ceppi durante le prove di vinificazione in cantina ha consentito di evidenziare la netta prevalenza dei ceppi inoculati nel corso delle fermentazioni. Prove di vinificazione I vini prodotti con i 15 lieviti sperimentali nel corso della vendemmia 2000 sono stati sottoposti ad una prima valutazione sensoriale (novembre 2000 e marzo 2001) da parte di un panel ristretto di quattro esperti conoscitori del vino Valpolicella a cui era stato chiesto di definire, mediante test di preferenza, i cinque vini migliori. Queste valutazioni preliminari hanno consentito di selezionare un gruppo di 5 vini (OF13, LF5, PM11, OM23 e MF16) che sono stati successivamente sottoposti ad analisi chimiche (tabella 3) e ad analisi sensoriale da parte di un panel di 14 esperti assaggiatori utilizzando una scheda di valutazione sensoriale di tipo strutturata (scheda per l analisi sensoriale dei vini nei concorsi, proposta dall Associazione Internazionale degli Enologi). Ai componenti del panel è stato chiesto di esprimere una valutazione solo sui parametri olfattivi e gustativi. L elaborazione statistica effettuata mediante l analisi della varianza sui giudizi complessivi non ha evidenziato differenze statisticamente significative tra i 5 vini esaminati. Prendendo in considerazione i singoli parametri si osservano invece differenze significative sull intensità olfattiva tra il vino ottenuto con il lievito OF13 e i vini ottenuti rispettivamente con i lieviti OM23, PM11 e LF5 e sul parametro intensità gusto-olfattiva tra il vino ottenuto con il lievito LF5 e quello derivato dal lievito OM23. Inoltre, i ceppi OF13 e LF5 sono stati sempre preferiti nella valutazione sensoriale effettuata dal panel di 4 esperti assaggiatori e hanno evidenziato valori medi complessivi più elevati nelle valutazioni effettuate sulle schede strutturate. In conclusione, l insieme dei risultati descritti ha fatto ritenere i ceppi OF13 e LF5 come particolarmente caratterizzanti per il vino Valpolicella D.O.C. RINGRAZIAMENTI Si ringraziano gli enologi Andreoli e Boranga e il Dr. Fiorini per l importante contributo prestato sia nelle fasi di individuazione delle aziende sia nelle numerose valutazioni sensoriali. Si ringrazia inoltre il Laboratorio di Chimica di Veneto Agricoltura per il supporto analitico. Il lavoro è stato in parte finanziato nell ambito del progetto REG. CEE 2081/93 Miglioramento qualitativo dei vini: selezione di lieviti da ecotipi locali e loro utilizzazione in vinificazioni sperimentali in cantina. BIBLIOGRAFIA Andrighetto C., Psomas E., Tzanetakis N., Suzzi G., Lombardi A. (2000) - Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR for the identification of yeasts isolated from dairy products. Letters in Applied Microbiology, 30: 5-9. Cocito C., Delfini C. (2000) - Vérification de la contribution objective de la levure séléctionnée dans la différentiation des vin Blanc de Morgex-La Salle et Moscato di Chambave. Viticulture de Montagne, 10 (12): Cocito C., Moriondo G., Gaia P., Pra G., Rigazio L., Pagliara A., Ambrò S., Delfini C. (1998) - L oggettivo contributo del lievito selezionato nella vinificazione in rosso. L Enotecnico, 5: Delfini C. (1995) - Scienza e tecnica di microbiologia enologica. I edizione. Il lievito, Asti. Delfini C., Costa A., Cocito C., Vola G., Grosjean V., Bellocchia M., Gaia P., Pra G., Rigazio L., Conterno L., Pagliara A., Ambrò S. (1995) - Selezione dei lieviti per il miglioramento di vini bianchi D.O.C. II contributo. Vignevini Ricerca, 4: Delfini C., Formica J.V. (2001) - Wine Microbiology: Science and Technology. Marcel Dekker Inc. Publisher, New York, NY, USA, pp. 206, 208, Delfini C., Cocito C., Bonino M., Scellino R., Gaia P., Baiocchi C. (2001) - Definitive evidence for the actual contribution of yeast in the transformation of neutral precursors of grape aromas. Journal of Food Chemistry and Agriculture, 49: Querol A., Barrio E., Ràmon D. (1992) - Comparative study of different methods of yeast strain characterization. Sistematic Applied Microbiology, 15: Zambonelli C. (1988) - Microbiologia dei vini. Edagricole, Bologna. Zilio F., Lombardi A., Galeotto A., Comi G. (1998) - Profili di restrizione del DNA mitocondriale di ceppi di Saccharomyces isolati nella zona di produzione del vino Soave D.O.C. Rivista di Viticoltura ed enologia, 3: Zilio F., Lombardi A., De Dea P., Tosi E. (2000) - Caratterizzazione e selezione di lieviti per il vino Soave D.O.C. Vignevini, 6: