C.I. MEDICINA DI LABORATORIO Microbiologia Clinica CL Medicina e Chirurgia AA Modulo 8: TUBERCOLOSI. Giovanni Di Bonaventura, PhD

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1 C.I. MEDICINA DI LABORATORIO Microbiologia Clinica CL Medicina e Chirurgia AA Modulo 8: TUBERCOLOSI Giovanni Di Bonaventura, PhD Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Dipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel ) Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel ) gdibonaventura@unich.it

2 M. tuberculosis Lenta crescita (tempo di generazione medio: h) Acidi micolici e superficie cerosa Infezione primaria tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina Infezione secondaria (riattivazione) consolidamento Disseminazione TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello, meningi) Il tubercolo polmonare consiste in un granuloma formato da un nucleo centrale di necrosi caseosa contenente batteri all interno di macrofagi giganti, e da una parete esterna formata da fibroblasti, linfociti e neutrofili. 2

3 Epidemiologia Le infezioni causate da Mycobacterium tuberculosis complex rappresentano uno dei più importanti argomenti di salute pubblica mondiale: prevalenza: 14 milioni di casi di TB incidenza: 9.4 milioni di casi di TB (soprattutto Africa sub-sahariana e sud-est asiatico per elevato numero HIV e scarso accesso ai servizi sanitari) 1.7 milioni di morti World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report Geneva, Switzerland: WHO Press;

4 Importanza della diagnostica Resistenza alla terapia: Nel 2008 notificati casi di multidrug-resistant TB (MDRTB), ossia il 3.3% dei nuovi casi, causando morti. Paesi a più alta incidenza di MDRTB sono distribuiti su tutto il globo (Europa, Asia, Africa) : 49 milioni di pazienti trattati, salvate oltre 6 milioni di vite. Necessità di una diagnosi improved : detection rate globale non ottimale: 63%. L adozione di programmi di controllo sanitario richiede una diagnostica rapida ed accurata, soprattutto in quei Paesi dove difficile è l accesso ai servizi sanitari e dove non è possibile attendere i risultati dai laboratori di riferimento prima di avviare una terapia anti-tb. Spesso la diagnostica si basa soltanto sull osservazione microscopica, senza ottenere alcun dato sulle resistenze. I tests di sensibilità (AST) sono alquanto problematici: difficile esecuzione, elevato TAT (mesi), risultati discordanti per alcune molecule (etambutolo), mancanza di standardizzazione per i farmaci di seconda linea. E assolutamente indispensabile sviluppare strategie diagnostiche rapide, al fine di individuare nuovi casi di TB ed i pazienti infettati con ceppi MDR. World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report Geneva, Switzerland: WHO Press;

5 Valutazione medica La valutazione medica della malattia tubercolare si articola nelle seguenti fasi: 1. Valutazione anamnestica 2. Esame obiettivo 3. Test per stabilire pregressa infezione con M. tuberculosis 4. Radiografia del torace 5. Esame batteriologico di campioni clinici E necessario distinguere i soggetti: con infezione ma asintomatici (infezione latente) con infezione e sintomatici (infezione attiva) Nel primo caso si parla di diagnosi INDIRETTA, nel secondo di diagnosi DIRETTA. 5

6 1. Anamnesi Presenza di uno o più sintomi suggestivi per TB; nel caso, da quanto tempo persistono. Esposizione ad un soggetto con TB. Diagnosi pregressa di infezione tubercolare latente (LTBI) o malattia TB. In caso di trattamenti inadeguati o per scarsa compliance del paziente, TB può ricorrere con emergenza di isolati multi-resistenti. Considerare i fattori demografici (paese di origine, età, etnia, gruppo razziale, occupazione) che possono rappresentare fattori di rischio per l infezione tubercolare. Considerare la presenza di malattie concomitanti (HIV, diabete) che aumentino il rischio di progressione della malattia nei soggetti con infezione latente da M. tuberculosis. 6

7 2. Esame obiettivo - sintomatologia La maggior parte dei pazienti TB presenta uno o più sintomi, sebbene NON TUTTI i pazienti con TB siano sintomatici. Tutti i soggetti sintomatici per TB o risultati positivi ad un test indicativo di infezione da M. tuberculosis (tuberculin skin test, TST; interferon-gamma release assay, IGRA), debbono essere soggetti a valutazione medica per escludere la malattia tubercolare. 7

8 3. Diagnosi INDIRETTA: avvenuta infezione con M. tuberculosis La scelta del test più adatto per la ricerca dell infezione da M. tuberculosis deve tener conto di: motivi e contesto clinico disponibilità rapporto costo-efficacia Attualmente, esistono due metodi disponibili per stabilire un pregresso contatto con il microrganismo, basati sulla evidenziazione di una risposta di memoria T-cellulare a seguito di esposizione agli antigeni di M. tuberculosis: Mantoux tuberculin skin test (TST) Interferon-gamma release assays (IGRAs) QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT) T-SPOT.TB test Questi tests consentono di individuare i soggetti che hanno una infezione da M. tuberculosis, indipendentemente dallo stato dell infezione stessa (attiva o latente). Tuttavia, un risultato negativo non esclude la diagnosi di malattia tubercolare o di infezione latente (Latent Tuberculosis Infection, LTBI). 8

9 Test cutaneo per la tubercolosi: Mantoux test Si disinfetta una piccola superficie dell avambraccio, quindi si inietta superficialmente con una siringa da insulina con ago sottilissimo la dose di tubercolina. La tubercolina è una frazione proteica purificata del bacillo tubercolare che, una volta iniettata provoca nell'organismo una risposta immunitaria, che si manifesta con una reazione infiammatoria sulla cute (reazione di ipersensibilità ritardata, mediata dai linfociti T di memoria) Dopo 72 ore, si procede alla lettura del test: negativo: assenza di indurimento ed eritema inferiore a 2 mm di diametro; dubbio: con parvenza di indurimento ed eritema tra i 2 a 4 mm di diametro; positivo: con indurimento dermico evidente ed eritema superiore a 5 mm di diametro. intensamente positivo: se la papula si necrotizza centralmente e la reazione infiammatoria è moto evidente. Il test negativo evidenzia l'assenza di contatto con M. tuberculosis. Il test positivo evidenzia un contatto con M. tuberculosis e la risposta immunologica è proporzionale allo stato di attività della malattia. La diagnosi di malattia deve essere confermata su base clinica, radiologica e laboratoristica. 9

10 : Interferon-gamma release assays (IGRAs) La risposta cellulo-mediata può essere valutata in vitro sui linfociti periferici, misurandone la produzione di IFN- a seguito di esposizione agli antigeni del micobatterio tubercolare. La quantità di IFN- viene misurata utilizzando una tecnica basata su membrana (ELISPOT) o mediante ELISA. Possibile cross-reattività con M. szulgai, M. marinum, M. kansasii Interpretazione «integrata» Mantoux test IGRA test Immunizzazione (vaccino BCG)-infezione con micobatteri ATPICI Infezione con una specie appartenente al complesso M. tuberculosis positivo positivo negativo positivo 10

11 4. Esame radiografico Le alterazioni osservate all esame radiografico del torace potrebbero essere suggestive, ma mai diagnostiche, per TB. RX può essere utilizzato per escludere la TB polmonare in un soggetto normoreattivo, positivo a TST o IGRA, ed asintomatico per TB. Presenti soprattutto nei segmenti apicale e posteriore del lobo superiore o dei segmenti superiori del lobo inferiore, le lesioni potrebbero essere localizzate ovunque e differire per dimensioni, forma e cavitazione, soprattutto nell immunocompromesso (es. HIV). Soprattutto nei ragazzi, le alterazioni radiografiche sono minime; indicato un RX laterale per diagnosi differenziale con linfoadenopatia. La tomografia computerizzata può fornire informazioni aggiuntive, sebbene più costosa. Lesioni fibrotiche: possibile presenza di bacilli tubercolari in divisione con un alto potenziale per la progressione verso la malattia TB. Poichè RX non può differenziare una pregressa TB da una forma attiva, i soggetti con un quadro radiografico suggestivo per una TB pregressa e TST+ oppure IGRA+ dovrebbero essere sottoposti a terapia per LTBI soltanto dopo aver escluso una infezione in atto previa indagine colturale. Al contrario, lesioni nodulari non fibrotiche, pienamente calcificate e discrete, suggestive per la presenza di granuloma, indicano un basso rischio per la progressione verso la malattia TB. 11

12 5. Esame batteriologico Obiettivo: dimostrare la presenza di M. tuberculosis o di altri micobatteri tubercolari (M. bovis, M. africanum) E necessario che tutti i soggetti sospetti per la malattia TB debbano essere sottoposti ad indagine batteriologica. L indagine, effettuata su campioni di differente tipologia (escreato, urine, liquor), si articola nelle seguenti fasi: Prelievo del campione Osservazione microscopica per la presenza di micobatteri (AFB, Acid-Fast Bacilli) Ricerca diretta di M. tuberculosis utilizzando tests di amplificazione degli acidi nucleici (Nucleic Acid Amplification, NAA tests) Indagine colturale ed identificazione Tests di sensibilità agli antibiotici 12

13 Prelievo dei campioni Rischio biologico M. tuberculosis è considerate un agente biologico di classe III, in quanto altamente contagioso (dose infettante: 10 bacilli). Durante la raccolta dei campioni indossare adeguati DPI (in particolare: mascherina). La lavorazione del campione necessita di un livello di contenimento previsto per il laboratorio di sicurezza (BSL-3) che protegga dall infezione sia il personale che l ambiente esterno. 13

14 Prelievo dei campioni TB polmonare La tecnica più frequentemente utilizzata prevede la raccolta di espettorato. E necessario prelevare almeno 3 campioni consecutivi ad intervalli di 24 h; il campione deve essere raccolto al mattino, a digiuno, perché le secrezioni si accumulano durante la notte. MODALITA DI PRELIEVO praticare la pulizia del cavo orale (denti, gengive, lingua e parte interna delle guance) con acqua distillata sterile; sciacquare il cavo orale sempre con acqua distillata sterile, per limitare contaminazioni a seguito di tre respiri profondi, il pz effettuerà un energico colpo di tosse per raccogliere almeno 3-5 ml di campione in un contenitore sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite Qualora non fosse possibile produrre un campione di espettorato, è possible ricorrere ad un aspirato tracheo-bronchiale (pz. intubati), oppure a broncoscopia. Quale ultima soluzione, si può ricorrere a: un aspirato gastrico (3 giorni consecutivi), soprattutto nei pediatrici uno sputo indotto, ossia raccolto a seguito di aerosol con salina ipertonica (3-5%), sterile e riscaldata. Contrassegnare il campione come indotto, in quanto la secrezione in questo caso è altamente idratata e potrebbe pertanto essere scambiata come saliva TRASPORTO: entro 1 ora dalla raccolta. CONSERVAZIONE: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare. 14

15 Prelievo dei campioni TB polmonare Durante la raccolta del campione, il paziente produce un aerosol altamente contagioso per operatori sanitari/pazienti in prossimità. La raccolta deve, pertanto, essere effettuata in un ambiente dedicato dotato di ventilazione controllata (stanza di isolamento AII), in grado di contenere il rischio biologico aerogeno. Il personale sanitario deve dotarsi di mascherina. 15

16 Prelievo dei campioni TB extra-polmonare Nel caso si sospetti una TB extra-polmonare, debbono essere considerate altre tipologie di campione. campione modalità contenitore Urine In 3 giorni consecutivi: raccogliere la prima minzione completa del mattino, preferibilmente scartando il primo getto sterile, bocca larga, plastica, tappo a vite Liquor prelevare, mediante rachicentesi, la maggior quantità possibile di liquor (minimo 2 ml) sterile Sangue 2-3 prelievi; avvertire Lab (affinchè si adotti vial dedicata) vial per emocoltura Pus Biopsia disinfettare la cute con alcool prima della raccolta utilizzare per la raccolta una siringa; se non è possibile, usare un tampone con terreno di trasporto Amies o Stuart raccogliere, asetticamente, almeno 1 gr di tessuto non avvolgere in garza, immergere in fissativi o conservanti aggiungere una minima quantità di soluzione salina sterile, per evitare l essicamento sterile, bocca larga, plastica, tappo a vite tampone in terreno di trasporto sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite Trasporto: entro 1 ora dalla raccolta. Conservazione: a +4 C (tranne il sangue, a RT), per max 1 giorno; non congelare. 16

17 Decontaminazione del campione I campioni polmonari sono generalmente caratterizzati da una flora accessoria contaminante. La crescita dei contaminanti (più veloce di quella del micobatterio), unitamente alla scarsa concentrazione del micobatterio, potrebbero causare risultati falsi-negativi. Pertanto, bisogna procedure alla decontaminazione e concentrazione del campione prima di avviare le indagini di laboratorio. Tecnica di Kubica: N-acetilcisteina (mucolitico) + NaOH (base con attività antibatterica) 17

18 Diagnosi DIRETTA: osservazione microscopica per AFB La ricerca microscopica di AFB nello striscio colorato allestito da un campione può fornire una iniziale e rapida evidenza batteriologica della presenza di Micobatteri in un campione clinico. Due sono le tecniche più frequentemente impiegate a tal fine: microscopia in fluorescenza, previa colorazione con auramina-o oppure auramina-rodamina; (rapida e semplice) microscopia diretta, previa colorazione con carbolfucsina (Ziehl- Neelsen, Kinyoun); (ZN gold-standard, più sensibile rispetto a K) I Micobatteri, una volta colorati, resistono alla decolorazione con alcol/acido (Acid-Fast Bacilli, AFB). Essi tendono inoltre a formare strutture cordoniformi, grazie alla elevata idrofobicità superficiale (fattore cordale). Tale tecnica consente soltanto una identificazione presuntiva della malattia TB poichè M. tuberculosis non è l unica specie AFB. Inoltre, la sensibilità dell indagine microscopica è scarsa ( bacilli/ml di campione), significativamente minore rispetto a quella dell isolamento colturale ( bacilli/ml), sebbene fornisca risultati in tempi più rapidi (entro 24h dal prelievo). Pertanto, una osservazione microscopica negativa per AFB non esclude la malattia TB. Alcuni pazienti possono infatti avere uno striscio AFB- ma essere positivi al colturale. 18

19 Osservazione microscopica per AFB Nei campioni AFB+ si procede alla conta cellulare, ottenuta a seguito dell osservazione di un numero minimo di campi microscopici Il risultato viene, quindi, refertato in maniera semi-quantitativa mediante l adozione di uno score (4+, 3+, 2+, 1+) che sarà direttamente proporzionale alla presenza di AFB e, conseguentemente, alla contagiosità del paziente. 19

20 Diagnosi DIRETTA: amplificazione degli acidi nucleici Questa metodica si basa sulla amplificazione di specifiche sequenze contenute nel DNA/RNA di M. tuberculosis. Molto più rapida rispetto all esame colturale (2-4 ore vs settimane); sensibilità del 100% sse effettuata su campioni di espettorato (minore in quelli extrapolmonari). CDC raccomanda l utilizzo di questi tests: nei pazienti sintomatici con sospetta TB polmonare per la ricerca dei contatti (necessaria per le attività di controllo). Possibili vantaggi associati all utilizzo della NAA: precoce conferma di malattia TB, rapido avvio della terapia antibiotica, migliore outcome del paziente; maggiore efficacia degli interventi di salute pubblica (precoce e più efficiente utilizzo dell isolamento respiratorio, interruzione della trasmissione, precoce inizio della individuazione dei contatti ) L interpretazione è funzione dell osservazione microscopica: se microscopia+/naa+, conferma di infezione se microscopia-/naa+, avvio della terapia in funzione del contesto geografico e clinico se microscopia+/naa-, probabile infezione non tubercolare 20

21 Diagnosi DIRETTA: isolamento colturale ed identificazione L indagine colturale rimane il gold standard per la conferma della malattia, oltre che necessaria per valutare il genotipo dell isolato, nonchè la sua sensibilità agli antibiotici. L esame va effettuato su tutti i campioni diagnostici, indipendentemente dall esito AFB o molecolare. Utilizzo di terreni agarizzati a base d uovo e con aggiunta di emina (Lowensten-Jensen) oppure di terreni liquidi (Middlebrook medium); in entrambi i casi, si aggiungono antibiotici per inibire la flora contaminante. I sistemi automatizzati attualmente in commercio (BACTEC, MGIT, VersaTREK, MBBACT) sono in grado di evidenziare la crescita in terreno liquido della maggior parte dei micobatteri in 4-14 giorni, mentre 3-6 settimane sono necessarie per la crescita su agar. Un risultato positivo per M. tuberculosis conferma la diagnosi di malattia. Nel caso di negatività (refertata dopo 42 giorni di incubazione), la diagnosi può essere posta soltanto su base clinica. Bacilli vitali potrebbero essere infatti presenti in altri campioni/siti. L indagine colturale è importante nel monitoraggio della efficacia della terapia e, conseguentemente, della contagiosità del paziente: campioni prelevati con cadenza mensile la negatività di 2 campioni consecutivi rappresenta la prova dell efficacia terapeutica la negativizzazione di tutti i campioni indicherà la avvenuta eradicazione 21

22 Valutazione della sensibilità agli antibiotici (AST) AST indicato nei pazienti: naïve per il trattamento che sono stati trattati per > 3 mesi ma con colturale ancora positivo con recidiva a seguito di terapia Anti-tubercolari di prima scelta saggiati per il primo trattamento di M. tuberculosis: isoniazide rifampicina etambutolo streptomicina Anti-tubercolari di seconda scelta saggiati in caso di insuccesso terapeutico (recidivanti): fluorochinoloni aminoglicosidi Tecniche per AST: fenotipiche (agar, brodo, E-test) genotipiche (molecolari; RAPIDE) 22

23 AST: tecniche fenotipiche rapide MDR-XDRTB Colour Test: antibiogramma diretto. Utilizza una tecnologia thin-layer agar in una capsula Petri contenente Middlebrook 7H11 agar e l indicatore redox 2, 3 diphenyl-5-(2-thienyl) tetrazolium chloride. La piastra è divisa in 4 quadranti: 1 (senza antibiotico, quale controllo di crescita batterica); 2 (contenente isoniazide), 3 (contenente rifampicina), 4 (contenente ciprofloxacina). Il campione di espettorato viene collezionato in un contenitore contenente un terreno di trasporto con disinfettante (per limitare la crescita della flora accessoria). La miscela viene seminata in ogni quadrante. Si monitora la crescita a giorni alterni fino alla comparsa di 50 CFU nel quadrante controllo La crescita di almeno 1% (vs controllo) indica resistenza. Di semplice esecuzione, a basso costo, rapido ed accurato nella ricercar di ceppi MDR. 23

24 AST: tecniche rapide molecolari Diagnosi molecolare rapida Due approcci tecnici: PCR associata a ibridazione inversa real-time PCR Ricerca di resistenza a isoniazide e/o rifampicina PCR associata a ibridazione inversa Realtime PCR 24

25 AST: tecniche rapide molecolari Principle of the reverse hybridization. After the amplification of the target DNA by PCR using biotinylated primer, the dsdna is chemically separated into single strands and hybridized to the target DNA. The bounded DNA can be made visible by color reaction of a chromogen mediated by the alkaline phosphatase reaction. The enzyme is coupled to a streptavidin linker that binds to biotin. BCIP: 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate; NBT: Nitro blue tetrazolium. Lane 1: susceptible strain Lane 2: resistant strain. Mutations are indicated by lacking hybridization of one or more wild-type probes and by the presence of the hybridization of one or more muted probes. Resistance to rifampicin is related to rpob mutations, where isoniazide-resistance by mutations of katg and inha. 25