Produzione di proteine terapeu.che

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1 Produzione di proteine terapeu.che

2 Proteine di interesse terapeu.co Proteine come farmaci (es. insulina, an.corpi, ormoni, an.coagulan., fa:ori della coagulazione) Proteine come an.geni per la produzione di vaccini (es. HBsAg) La produzione industriale di proteine terapeu.che richiede l uso della tecnologia del DNA ricombinante per o:enere le elevate quan.tà di proteina necessarie

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5 Biosintesi dell insulina nelle cellule β del pancreas Catena A Catena B 21 aa 30 aa Unite da due pon. S-S ESONE 1 ESONE 2 PREPROINSULINA Pep.de segnale PROINSULINA C B A INSULINA Nell apparato di Golgi un enzima rimuove 33 aa che cos.tuiscono il pep.de C

6 L insulina forma esameri, stabilizza. dallo zinco, che ne modulano la solubilità

7 PRODUZIONE DI INSULINA RICOMBINANTE IN BATTERI - Plasmidi separa. codificano per la catena A e B in ceppi di E. coli separa. - Le catene A e B sono prodo:e so:o il controllo del promotore lac come proteine di fusione con la regione N-terminale di LacZ - Le sequenze LacZ sono eliminate con tra:amento con bromuro di cianogeno (scinde legami Met-X) - Le catene A e B sono mescolate assieme in condizioni ossidan., si formano i pon. S-S e viene purificata la forma na.va

8 Produzione di insulina ricombinante nel lievito Saccharomyces cerevisiae (via della proinsulina) Pro-insulina cos.tuita da catena B1-29 (mancante di Thr30) e catena A1-21 fusa al pep.de segnale dell α-factor per produrre insulina secreta.

9 Espressione cos.tu.va so:o il controllo del promotore TPI (triosofosfato isomerasi), selezione mediante complementazione con il gene della TPI di S. pombe in un ceppo di S. cerevisiae tpi::leu2

10 Valutazione dell efficienza della sequenza del pro-pep.de e della sequenza spacer nella produzione di insulina ricombinante nel lievito

11 Schema del processo industriale di produzione dell insulina ricombinante mediante la via della proinsulina.

12 Analoghi dell insulina approva. per l uso come farmaci

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14 Proprietà farmacocine.che degli analoghi dell insulina

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16 Eritropoietina L eritropoietina (EPO) è un ormone che stimola la produzione di globuli rossi. E una glicoproteina di 165 aa con 4 catene di carboidrati (3 N- e 1 O-glicosilazione). La N-glicosilazione è necessaria per la secrezione e la stabilità dell EPO nel plasma. La O- glicosilazione non sembra avere influenza sull attività biologica dell EPO. EPO ricombinante prodotta in CHO e in lievito

17 Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Espressione sotto il controllo del promotore AOX1, segnale di secrezione α-factor, induzione per 40 ore, resa 50 mg/l (12-13 copie del vettore integrate nel genoma) H (O CH 2 CH 2 ) n OH PEG

18 Harvested Fermentation Broth Centrifugation Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Microfiltration Ultrafiltration #1 Blue-dye Chromatography Hydroxyapatite Chromatography * Cation Exchange Chromatography #1 Ultrafiltration #2 PEGylation Cation Exchange Chromatography #2 Ultrafiltration #3 Sterile Filtration Final Product *This step was only applied at scales larger than 40 liters

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20 Analisi diretta dell EPO ricombinante Iso-Elettro-Focalizzazione a ph 2-6 identifica varianti con diversa carica dovuta alle catene oligosaccaridiche

21 Stru:ura degli an.corpi Domini variabili nei quali si trova il sito di riconoscimento per l an.gene e domini costan. organizza. in catene leggere e catene pesan.. In base al.po di catena pesante: IgG, IgE, IgD monomeriche IgA dimeriche IgM pentameriche Pon. disolfuro Glicosilazione

22 Risposta immunitaria e organizzazione genica delle IgG

23 An.corpi monoclonali prodo^ in linee cellulari stabilizzate (ibridomi) - linfoci. B che producono an.corpi + cellule di mieloma HGPRT - in presenza di un agente di fusione - crescita su terreno sele^vo HAT (ipoxan.na, aminopterina,.mina) - L aminopterina è un an.bio.co che inibisce la sintesi de novo degli acidi nucleici. Ipoxan.na e.mina perme:ono di sopravvivere a cellule HGPRT +, che possono usare le vie di recupero HGPRT è un enzima della via di recupero delle purine.

24 U.lizzo di an.corpi in terapia Campi di applicazione clinica Mala^e cardiovascolari Mala^e infiammatorie e autoimmuni Immunosoppressione Neoplasie ematologiche ed epiteliali Uso in terapia an.cancro: proprietà dell an.gene bersaglio Espressione stabile e omogenea nelle cellule tumorali, trascurabile in cellule sane Elevata densità di espressione Mancanza di forme circolan. Capacità di a^vare i processi di morte cellulare

25 An.corpi: come uccidono le cellule tumorali Azione dire*a Citotossicità complemento-mediata proteine del complemento legano la Fc dell an.corpo che si è legato alla cellula bersaglio e la cellula va incontro a lisi Citotossicità cellulare an6corpodipendente la Fc dell an.corpo legato alla cellula bersaglio è riconosciuta da rece:ori su cellule effe:rici ed avviene lisi cellulo-mediata o fagocitosi della cellula tumorale Apoptosi Azione indire*a Inibizione della crescita Alterazioni del ciclo cellulare L an.corpo si lega al rece:ore per un fa:ore di crescita sulla cellula tumorale in modo da bloccare il legame del ligando endogeno. La trasduzione del segnale è inibita. Sfru:a questo meccanismo Trastuzumab Agisce in questo modo Rituximab

26 Gli an6corpi monoclonali sono 6picamente murini! Regione Fc di topo e non umana An6corpi chimerici (80% umani): i domini costan. della molecola murina sono sos.tui. con le loro rispe^ve contropar. umane prendendo le sequenze geniche della catena leggera κ e della catena pesante delle IgG1, le Ig più efficien. ad a^vare il complemento e la citotossicità delle cellule effe:rici An6corpi umanizza6 (95% umani): le CDR murine sono inserite in an.corpi umani Murino Chimerico Umanizzato

27 Rituximab An.corpo chimerico dire:o contro CD20. E stato il primo an.corpo monoclonale ad avere successo nella terapia per il linfoma non-hodgkin e ad o:enere le licenza dalla FDA nel CD20 è una proteina transmembrana con le seguen. proprietà: è espressa a livelli eleva. sul 95% delle cellule B affe:e da linfoma, ma non su altre cellule del corpo è espressa sui linfoci. B sani ma non sui loro precursori immaturi (perme:endo la ricos.tuzione di un compar.mento di cellule B dopo la terapia) e sulle plasmacellule (perme:endo una produzione con.nua di immunoglobuline) dopo il legame con l an.corpo non va in circolo nel plasma e non viene internalizzata è essenziale per il differenziamento e la proliferazione dei linfoci. B L a^vazione del complemento è fondamentale nell efficacia dell an.corpo ma è molto importante anche l induzione dell apoptosi mediante influsso di calcio.

28 Trastuzumab (Hercep.n) An.corpo IgG1 umanizzato dire:o contro HER2 HER2 è un proto-oncogene che codifica il rece:ore.rosin-chinasico del fa:ore di crescita epidermico umano Il rece:ore HER2 è una proteina transmembrana che si trova su numerosi tessu. epiteliali e che viene iper-espressa nel 20-30% dei casi di tumore al seno (>2 milioni di copie contro nelle cellule epiteliali normali). L iper-espressione di solito è dovuta ad una amplificazione del gene Trastuzumab lega con alta affinità HER2 ed induce l internalizzazione del rece:ore e quindi il blocco della trasduzione del segnale I tumori con iper-espressione di HER2 vengono iden.fica. o mediante analisi immunoistochimica (posi.vità a HER2-3) o con la FISH (evidenzia la presenza di amplificazione genica) È stato il primo an.corpo monoclonale contro tumori solidi ad essere approvato dalla FDA. E riconosciuto come agente singolo nella terapia di seconda linea nei tumori al seno HER2 + metasta.ci

29 Produzione di an.corpi (IgG) nel lievito Pichia pastoris Ceppo ingegnerizzato per produrre oligosaccaridi del.po Man 5 GlcNAc 2 Espressione so:o il controllo del promotore AOX1 Resa 1.26 g/l dopo 146 ore di coltura con biomassa circa 400 g/l peso fresco di cellule (8.6 mg/l/ora)

30 Una modifica post-sintetica inusuale: la γ-carbossilazione del glutammato

31 La cascata della coagulazione del sangue Numerosi fattori della coagulazione possiedono residui di Gla (γ-carbossiglutammato) necessari per una corretta interazione con le membrane

32 Disordini gene.ci della coagulazione: emofilia A (fa:ore VIII) emofilia B (fa:ore IX) La World Federa.on of Haemophilia s.ma che nel mondo ci siano emofiliaci. La produzione dei fa:ori della coagulazione necessari per ques. pazien. a:raverso la tecnologia del DNA ricombinante perme:e di superare i problemi di contaminazioni virali che rendono meno sicuri i deriva. del plasma.

33 Fa:ore VIII Il fa:ore VIII è una proteina di 2332 aa che ha una stru:ura a domini A1-A2-B-A3-C1-C2. Il dominio B viene inizialmente rimosso e nel plasma il fa:ore VIII è associato al fa:ore di von Willebrandt (vwf), che lo stabilizza. Il dominio C2 è coinvolto nel legame a vwf e alle membrane.

34 Processamento del Fa:ore VIII

35 Fa:ore VIII ricombinante Espresso in cellule di mammifero BHK e CHO a livelli bassi: secrezione poco efficiente. Cos. molto eleva. (oltre $/anno per paziente) Produzione di fa:ore VIII ibrido uomo/maiale (sequenze FVIII di maiale nei domini A1 e A3 aumentano livelli di espressione migliorando la velocità di secrezione) in un sistema len.virale so:o il controllo del promotore EF-1α in cellule BHK Livelli di espressione: 9 pg/cellula/giorno cioè circa 7.3 mg in 2.5 l raccol. dal giorno 3 al giorno 7 di coltura Purificazione mediante cromatografia a scambio ca.onico su SulfoPropyl-Sepharose: 4.9 mg di fa:ore VIII con elevata purezza

36 Fa:ore VIII ricombinante

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40 Espressione del Fa:ore IX in cellule CHO Fa:ore IX (415 aa) espresso in CHO a 180 µg/ml (forma a^va solo 1.5 µg/ml). I livelli di espressione aumentano se viene coespressa la furina (proteasi che rimuove un pep.de segnale necessario per la γ- carbossilazione). Approvato con il nome BeneFIX nel 1998.

41 Fa:ore VIIa ricombinante Il fa:ore VII è espresso in cellule BHK come proteina a singola catena. L a^vazione (proteolisi R152-I153) è spontanea. Purificazione mediante cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità su an.corpo monoclonale contro il dominio Gla e altre due cromatografie a scambio ionico. Il fa:ore VIIa è indicato nei pazien. con emofilia A o B che hanno sviluppato an.corpi inibitori contro i fa:ori VIII o IX.

42 Nuovi approcci per aumentare l emivita di FVIII, FIX e FVIIa

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