Capitolo 9 BIOTA: BIOMARKERS IN SPECIE ITTICHE

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1 Capitolo 9 BIOTA: BIOMARKERS IN SPECIE ITTICHE 9.1 Campionamento degli organismi e metodiche utilizzate La campagna di è stata effettuata nel Dicembre 28 e sono stati recuperati organismi appartenenti alla specie Squalus acanthias (Elasmobranchi) e Chelidonichthys lucernus (Osteitti), per mezzo di rete da posta posizionate nei due siti TC42 (prossimo al terminale) e TC43 (area di controllo). La posizione delle stazioni con il dettaglio delle coordinate geografiche è riportata nel Capitolo 3 par Dagli organismi campionati sono stati prelevati fegato, cistifellea e cervello e congelati in azoto liquido per le successive analisi biochimiche; per le analisi di danno genotossico sono stati prelevati milza, branchie e sangue. Per quantificare i livelli di metallotioneine, proteine citosoliche indotte dalla esposizione a metalli pesanti, i campioni di fegato sono stati omogenati (1:3 p/v) in tampone Tris-HCl 2 mm ph 8.6 con saccarosio.5 M, leupeptina.6 mm, PMSF.5 mm, β-mercaptoetanolo.1%. Dopo centrifugazione a 3. xg per 45 minuti a 4 C, la purificazione delle metallotioneine è stata effettuata attraverso una serie di precipitazioni etanoliche. Il pellet ottenuto da questi procedimenti e contenente le metallotioneine, è stato asciugato sotto flusso d azoto, risospeso nuovamente in una soluzione di NaCl.25 M e HCl 1 N, contenente EDTA 4 mm per eliminare i cationi metallici legati alle metallotioneine. Alla soluzione così ottenuta è stato aggiunto tampone Na-fosfato 2 mm ph 8, NaCl 2 M e DTNB.43 mm ed il campione ulteriormente centrifugato a 3 xg per 5 minuti a 4 C. La concentrazione delle metallotioneine è stata valutata in rapporto ai gruppi SH determinati spettrofotometricamente a λ = 412 nm mediante reazione con DTNB. La quantificazione è stata effettuata attraverso una retta standard di calibrazione, con concentrazioni note di GSH (5-5μM) (Viarengo et al., 1997). L induzione del citocromo P451A, risposta specifica ad esposizione a composti aromatici, è stata determinata come attività enzimatica della etossiresorufina O-deetilasi (EROD); al momento dell analisi, i campioni di fegato sono stati omogenati (1:5 rapporto peso:volume) in un working-buffer contenente: tampone K-fosfato 1 mm ph 7.5 con KCl.15 M, acido etilene-diamino-tetracetico (EDTA) 1 mm. Gli omogenati così ottenuti sono stati centrifugati a 12. xg per 15 minuti a 4 C, e la frazione postmitocondriale (S9) contenuta nel sovranatante, è stata aliquotata in eppendorf e messa in ghiaccio fino al momento delle analisi (Gorbi et al., 25). L attività catalitica del citocromo P45 è stata quantificata misurando il consumo della 7- etossiresorufina, substrato specifico per l isoforma 1A, in presenza di NADPH come fattore riducente ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 63

2 e con conseguente produzione di resorufina che viene determinata mediante analisi spettrofluorimetrica. Per il saggio, un volume di 1 μl di frazione S9 è stato incubato a 3 C, per 5 minuti, in un volume finale di 1 ml di reazione contenente: tampone K-fosfato 1 mm ph 7.5, 7-etossiresorufina 4 μm, NADPH.25 mm. Trascorsi 5 minuti sono stati aggiunti 2 ml di acetone per bloccare la reazione. Una soluzione d incubazione identica a quella dei campioni è stata stoppata al tempo con l aggiunta di acetone e utilizzata come valore di bianco campione. Sia i campioni che i bianchi campione sono stati centrifugati a 6. xg per 5 minuti a 4 C, il sovranatante è stato prelevato e analizzato mediante spettrofluorimetria. La fluorescenza è stata misurata usando una coppia di lunghezze d onda di eccitazione/ emissione pari a 535/585 nm e i livelli di resorufina prodotta nei campioni sono stati quantificati con una retta standard di concentrazioni note di resorufina (.2-1 μm) diluita in tampone K-fosfato 1 mm ph 7.5. I valori di attività EROD sono stati riferiti alle proteine contenute nel campione ed espressi in pmoli/minuto/mg di proteine. Per l analisi dei metaboliti aromatici nella bile, al momento del saggio le cistifellee degli organismi sono state scongelate e svuotate dal loro contenuto biliare. Una parte della bile ottenuta è stata immediatamente diluita in un rapporto pari o maggiore di 1:1 in etanolo 5% per le analisi spettrofluorimetriche (Gorbi et al., 25). Con il metodo della fluorescenza a lunghezza d onda fissa (FF), il segnale di fluorescenza di un campione è misurato ad una determinata coppia di lunghezze d onda d eccitazione e d emissione, specifica per ciascun tipo di metabolita. Le coppie di lunghezze d onda ottimali d eccitazione ed emissione scelte sono: 29/335nm per i metaboliti del naftalene; 341/383nm per i metaboliti del pirene; 38/43nm per i metaboliti del benzo[a]pirene. La fluorescenza del campione è stata misurata alle tre diverse coppie di lunghezze d onda, e i valori ottenuti sono stati quantificati rispetto a tre curve di calibrazione ottenute con standard di 1-OH-naftolo ( µg/ml) per i metaboliti del naftalene, 1-OH-pirene (.4-21 ng/ml) per i metaboliti del pirene e benzo[a]pirene (.5-12 ng/ml) per i metaboliti del benzo[a]pirene. I risultati sono stati espressi in metaboliti-tipo µg/ml di bile o mg/ml. La proliferazione perossisomiale, biomarker specifico di esposizione a proliferatori perossisomiali, è stata valutata per via spettrofotometrica attraverso l analisi dell attività enzimatica della acil-coa ossidasi (AOX), principale enzima coinvolto nella beta-ossidazione perossisomiale degli acidi grassi. I campioni di fegato sono stati omogenati in un working buffer contenente: tampone sodio bicarbonato 1 mm, ph 7.6, EDTA 1mM, etanolo.1%, TRITON X-1.1% e centrifugati a 5 xg per 15 min a 4 C. L attività enzimatica della AOX è stata determinata seguendo la reazione di ossidazione della ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 64

3 diclorofluoresceina diacetato (DCF-DA) in presenza di una perossidasi esterna e con l aggiunta di un substrato specifico (Palmitoil CoA) alla temperatura di 25 ± 1 C e λ=52 nm (Small et al., 1985). L attività dell acetilcolinesterasi è stata determinata nei campioni di cervello, omogenati in Tris-HCl.1 M, ph 7.2 e saccarosio.25 M e centrifugati per 1 minuti a 1. xg. Il sovranatante è stato utilizzato per determinare l attività della acetilcolinesterasi (ACh) secondo il metodo di Ellman, alla temperatura di 18 ± 1 C, alla lunghezza d onda di 412 nm, con ε = 13.6 mm -1 cm -1 (George et al., 1961). La comparsa di danni genotossici è stata valutata attraverso il test della cometa e la frequenza di micronuclei (Gorbi et al., 28, Venier et al., 1997). Il test della cometa misura la perdita di integrità strutturale del DNA e permette una stima delle rotture a carico dei legami zucchero-fosfato nella doppia elica del DNA (strand breaks). Il saggio della cometa è stato eseguito sul sangue di ciascun individuo campionato. Le cellule sono state lavate in un buffer salino (1 mm fosfato,.1 M NaCl, 2 mm HEPES, 1 mm EDTA) con brevi centrifugate successive e portati alla concentrazione di 4 x 1 4 cellule x ml -1. Prima di essere imbibite su gel d agarosio a basso punto di fusione, le cellule sono state preservate in ghiaccio al riparo dalla luce. Tre strati successivi di gel d agarosio a basso punto di fusione sono aggiunti su vetrini da microscopia pre-allestiti con un film di gel d agarosio a punto di fusione normale (di supporto). Ogni strato, compreso quello centrale con le cellule, è stato fatto aderire al vetrino porta-oggetto e reso di spessore omogeneo coprendolo con un vetrino copri-oggetto, alla temperatura di circa 37 C. Lasciato raffreddare per diversi minuti, il vetrino copri-oggetto è stato rimosso delicatamente e l operazione ripetuta fino a quando tutti gli strati sono risultati pronti. Una volta preparati, i vetrini sono stati riposti per 9 minuti in una soluzione di lisi (2.5 M NaCl; 1 mm EDTA; 1 mm Trizma-base; 1% Triton X-1 e 1% DMSO), in modo da disgregare tutte le membrane cellulari e disperdere i contenuti citoplasmatici nel gel. Dopo la lisi cellulare i vetrini sono stati immersi in un buffer alcalino (75 mm NaOH; 1 mm EDTA a ph > 12.5) per 1 minuti, per favorire la denaturazione del DNA che induce una riduzione del grado di superavvolgimento del DNA, in maniera proporzionale al numero delle rotture dell asse fosfodiesterico della molecola. Gli strand breaks sono stati messi in evidenza lasciando migrare il DNA, per ulteriori 1 minuti con una elettroforesi a 1 Vcm -1 sempre nello stesso buffer. Dopo un lavaggio di 5 minuti in buffer di neutralizzazione (4 mm TRIS, ph 7.5) e colorazione con DAPI (colorante fluorescente specifico per il DNA) i vetrini sono stati analizzati al microscopio. In presenza di un DNA poco degradato i nuclei appaiono dall aspetto circolare, mentre nel caso contrario dopo la corsa elettroforetica i nuclei presentano una forma simile a quella di una cometa. Durante le campagne di bianco le quantificazione della perdita di integrità strutturale del DNA è stata effettuata attraverso una conta delle comete e loro attribuzione ad una di cinque possibili classi di danno, sulla base della grandezza delle teste e della ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 65

4 lunghezza delle comete (Danno Totale). Nella campagna di la quantificazione è stata effettuata attraverso un software d analisi di immagine CometScore 1.5 (TriTek corp) che fornisce il valore di % DNA nella coda. Per poter confrontare i risultati ottenuti tra bianco e, i valori ottenuti con il Danno Totale sono stati trasformati in valori di % di DNA nella coda attraverso un opportuna retta di conversione. Gli strand breaks che si formano in condizioni fisiologiche nel DNA cellulare vengono continuamente riparati da sistemi enzimatici che ne preservano l integrità strutturale; gli effetti genotossici relativi alla comparsa degli strand breaks sono evidenti quando viene meno l equilibrio fra processi di rottura e riparo, a favore dei primi, con un accumulo delle rotture nel DNA. Questo può avere delle conseguenze rilevanti per alcuni processi essenziali del ciclo cellulare, come la corretta segregazione del materiale genetico durante la mitosi, che può manifestarsi con la comparsa di micronuclei (MN), cioè di piccoli frammenti di cromatina fisicamente separati dal nucleo principale. La frequenza di insorgenza di micronuclei (MN) è stata valutata negli eritrociti, nelle cellule branchiali e di milza dei pesci. Le aliquote di sangue, prelevate dall arco branchiale, dopo essere state dilavate in un buffer salino (NaCl.11 M, EDTA 1 mm), sono state fissate e mantenute in Carnoy (soluzione di metanolo ed acido acetico in rapporto 3:1). I tessuti sono invece stati prima sminuzzati e filtrati in modo da ottenere un pool di cellule omogeneo; le sospensioni cellulari sono state lavate in un tampone biologico (TAE) mediante centrifugazioni successive e fissate anch esse in Carnoy. Le sospensioni cellulari sono state strisciate su vetrini da microscopia, allestiti in duplicato, e colorate con un colorante specifico per il DNA (DAPI, 1 µgml-1). La valutazione della frequenza di comparsa dei MN è stata effettuata attraverso osservazione microscopica in fluorescenza e conta cellulare; i risultati sono espressi come percentuale di cellule con micronuclei, su un totale di 2. cellule contate per ogni campione. Per le analisi degli enzimi antiossidanti una porzione del fegato degli organismi è stato omogenato (1:5 p/v) in tampone K-fosfato 1 mm, ph 7.5, con cloruro di sodio 1.8%, e fenilmetilsolfonilfluoruro (PMSF).1 mm. Dopo centrifugazione a 1. xg per 1h e 1 min a 4 C, la frazione citosolica è stata aliquotata e conservata a -8ºC. Le attività enzimatiche sono state misurate con specifici saggi spettrofotometrici utilizzando uno strumento Varian (modello Cary 5) termostatato a temperatura costante di 18 ± 1 C (Regoli et al., 25). La catalasi trasforma il perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) in acqua e ossigeno molecolare, rimuovendo così oltre che un potente ossidante cellulare, anche il principale precursore del radicale idrossilico, il più reattivo e tossico fra le specie reattive dell ossigeno. L attività della catalasi è stata misurata seguendo la diminuzione di assorbanza in funzione del tempo, dovuta alla riduzione del perossido di idrogeno ad ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 66

5 acqua; la lunghezza d onda utilizzata è stata λ = 24 nm ed il coefficiente di estinzione millimolare applicato è stato ε = -.4 mm -1 cm -1. Il saggio è stato condotto per un minuto in un volume finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 1 mm a ph 7., con H 2 O 2 12 mm ed opportune aliquote di campione. Le glutatione S-transferasi catalizzano la coniugazione di una molecola di glutatione ridotto (GSH) ai gruppi elettrofili di composti organici. Delle molte isoforme, alcune possono avere funzione antiossidante, ma la maggior parte sono coinvolte nella detossificazione di substrati organici, resi più idrosolubili e di più facile escrezione. L attività catalitica delle glutatione S-transferasi è stata analizzata seguendo l aumento di assorbanza dovuto alla formazione del complesso di coniugazione tra GSH e 1- cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), ad una lunghezza d onda λ = 34 nm e con un coefficiente di estinzione millimolare ε = 9.6 mm -1 cm -1. La reazione è stata seguita per un minuto in un volume finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 1 mm ph 6.5, CDNB 1.5 mm, GSH 1 mm ed opportune aliquote di campione. La glutatione reduttasi ha la funzione di riconvertire il glutatione ossidato nella sua forma ridotta, cioè quella funzionalmente attiva, utilizzando come cofattore riducente il NADPH. Il saggio della glutatione reduttasi è stato condotto alla lunghezza d onda λ = 34 nm e con coefficiente di estinzione millimolare ε = mm -1 cm -1, misurando il decremento di assorbanza dovuto al consumo di NADPH nel tempo. La reazione è avvenuta in un volume di saggio finale di 1 ml contenente tampone K-fosfato 1 mm a ph 7., GSSG 1 mm, NADPH.12 mm ed opportune aliquote di campione. Gli enzimi glutatione perossidasi, Se-dipendenti e Se-indipendenti, svolgono la loro funzione detossificante agendo su perossidi organici ed inorganici riducendoli all alcool corrispondente. L attività enzimatica è stata misurata seguendo l azione di un sistema di enzimi accoppiati dove il GSSG formato nella reazione delle perossidasi viene convertito nella forma ridotta GSH dalla glutatione reduttasi. Il consumo di NADPH è stato seguito come diminuzione di assorbanza a λ=34 nm (ε= mm -1 cm - 1 ). L attività delle forme enzimatiche Se-dipendenti e Se-indipendenti è stata misurata usando come substrato l idroperossido di cumene (CuPx), per verificare l efficacia di detossificazione degli enzimi su perossidi organici. Il glutatione è un tripeptide citosolico formato da γ glutamil-cistenil-glicina e oltre ad essere un importante cofattore di numerosi sistemi enzimatici glutatione-dipendenti, è in grado di neutralizzare numerose forme di radicali liberi reagendovi direttamente ed ossidandosi. Per la determinazione del glutatione totale gli omogenati di fegato sono stati preparati in acido sulfosalicilico 5% con EDTA 4 mm (1:5 p/v). I campioni sono quindi stati lasciati in ghiaccio per 45 min al fine di ottenere una ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 67

6 completa deproteinizzazione e centrifugati a 37. xg per 15 min. Il contenuto di glutatione totale è stato determinato nel sovranatante misurando per via spettrofotometrica, alla lunghezza d onda λ = 412 nm, l intensità di reazione tra i gruppi SH e l acido 5,5 -ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB). Il saggio è stato condotto in tampone K-fosfato 1 mm ph 7, EDTA 1 mm, DTNB.1 mm, NADPH.24 mm, glutatione reduttasi 1 U ed opportune aliquote di campione. I valori di assorbanza ottenuti sono stati quantificati mediante una curva di calibrazione standard a concentrazioni note di glutatione ridotto. La Capacità Antiossidante Totale è stata stimata tramite il saggio TOSC che misura l efficienza complessiva di un tessuto biologico di neutralizzare diverse forme di ROS tra cui i radicali perossilici (ROO ) e i radicali idrossilici (HO ) (Regoli and Winston, 1999). Le analisi sono state effettuate sulla componente citosolica dei campioni di fegato, omogenati (1:5 p/v) in un working-buffer costituito da tampone K-fosfato 5 mm ph 7.5, NaCl 1.8%. Gli omogenati così ottenuti sono stati centrifugati a 1. xg per 1 ora e 1 minuti a 4 C, e la frazione citosolica subaliquotata e conservata a - 8 C fino al momento delle analisi. Il saggio TOSC-A (Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay) prevede la reazione tra le diverse forme di radicali che sono artificialmente generati, e l acido α-cheto-γ-metiolbutirrico (KMBA), che funge da substrato e si ossida liberando gas etilene. La produzione di etilene risulta quantitativamente diminuita in presenza di agenti antiossidanti (come quelli contenuti nel materiale biologico) che reagiscono con i radicali neutralizzandoli e sottraendoli alla reazione con il KMBA. I radicali perossilici (ROO ) sono stati generati attraverso l omolisi termica del 2,2 -azo-bisamidinopropano (ABAP) mentre i radicali idrossilici (HO ) attraverso la reazione di Fenton ferroascorbato. Le reazioni sono state condotte in appositi contenitori di vetro da 1 ml (vials), sigillati con speciali tappi muniti di setto, mantenuti alla temperatura costante di 35 C in bagno termostatico continuamente agitato per consentire una generazione costante delle varie forme di radicali. Le condizioni finali di saggio sono state le seguenti: - per l analisi con i radicali perossilici (ROO ): un volume variabile di campione, KMBA.2 mm e ABAP 2 mm in tampone K-fosfato 5 mm ph 7.4; - per l analisi con i radicali idrossilici ( OH) : un volume variabile di campione, KMBA.2 mm, Fe μm, EDTA 3.6 μm e acido ascorbico 18 μm in tampone K-fosfato 5 mm ph 7.4; Il KMBA viene ossidato dalle diverse forme di radicali generando gas etilene. La formazione dell etilene è stata monitorata nel tempo mediante analisi gas-cromatografica su colonna capillare Supelco SPB-1 (3 m x.32 mm x.25 μm) e mediante rivelatore FID (Flame Ionization Detector), utilizzando le seguenti condizioni strumentali: temperatura del forno pari a 35 C, temperatura del FID pari a 22 C, ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 68

7 temperatura d iniezione pari a 16 C, flusso d idrogeno pari a 3 ml/minuto; flusso d elio pari a 3 ml/minuto. La differenza di produzione d etilene tra la reazione nei vials di controllo e la reazione nei vials contenenti i campioni, è stata calcolata matematicamente, integrando l area al di sotto delle rispettive curve cinetiche della produzione d etilene in funzione del tempo, considerando che ogni campione viene letto ogni 12 minuti per un tempo totale di saggio pari a 96 minuti. I risultati ottenuti permettono di quantificare il parametro TOSC, compreso tra e 1, indice della capacità complessiva del campione analizzato, di neutralizzare le varie forme di specie reattive dell ossigeno. Il valore TOSC sperimentale è ottenuto secondo la formula: TOSC = 1 ( SA / CA x 1) dove SA e CA sono gli integrali delle aree al di sotto delle curve che rappresentano rispettivamente le reazioni di un campione SA (Sample Area), e del controllo CA (Control Area). Un campione che sia privo di qualsiasi capacità di neutralizzare i radicali mostrerà una produzione di etilene in funzione del tempo uguale a quella dei controlli ( SA / CA=1) ed il risultante valore TOSC sarà pertanto pari a. Al contrario un ipotetico valore TOSC=1 corrisponderebbe ad un campione che neutralizza tutte le specie reattive prodotte, inibendo completamente la formazione di etilene nell intera durata del saggio ( SA=). Dai risultati sperimentali viene ottenuto un valore TOSC specifico, rapportato al contenuto di proteine ed espresso come unità TOSC/mg di proteine. Le proteine sono state analizzate secondo il metodo di Lowry, utilizzando albumina di siero bovino (BSA) come standard (Lowry et al., 1951). Il contenuto di malondialdeide, principale prodotto di perossidazione lipidica, è stato determinato attraverso una reazione di coniugazione con 1-metil-2-fenilindolo, che dà luogo alla formazione di un composto con assorbanza massima alla lunghezza d onda λ = 586 nm (Shaw et al., 24). Per queste analisi i campioni di fegato sono stati omogenati in Tris-HCl 2 mm ph 7.4 (1:3 p/v) e centrifugati a 3. xg per 2 min. La reazione di coniugazione è stata condotta a 45 C per 4 min in un volume finale di 1 ml costituito da: 65 µl di 1-metil-2-fenilindolo 1.3 mm in acetonitrile diluito in rapporto 3:1 con metanolo; 1 µl di H 2 O; 15 µl di HCl 37%. Dopo centrifugazione a 15. xg per 1 min, il contenuto di malondialdeide è stato misurato per via spettrofotometrica, utilizzando come standard 1,1,3,3-tetrametossipropano in Tris-HCl 2 mm (Shaw et al.,24). ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 69

8 9.2 Risultati ottenuti in Specie ittiche Il dettaglio di tutti i risultati ottenuti viene riportato nell Appendice del presente capitolo. Durante la campagna di (Dicembre 28) nella stazione TC43 è stato ritrovato un solo esemplare per ciascuna delle due specie campionate ( e C. lucernus), e per questo motivo il valore indicato è senza deviazione standard. I livelli di metallotioneine sono risultati confrontabili tra le stazioni TC43 e TC42 sia in C. lucernus (54,2 ± 1,29 Eq. GSH nmol/mg prot) che in (33,5 ± 2,6 Eq. GSH nmol/mg prot). L attività EROD ha evidenziato valori bassi e solo di poco più alti per C. lucernus nell area di riferimento TC43 (4,51 pmol/min/mg prot) rispetto a TC42 (1,53±,37 pmol/min/mg prot), e valori simili negli esemplari di dai due siti (2, ±,51 pmol/min/mg prot). Livelli leggermente più alti di metaboliti del naftalene e del BaP sono stati misurati in C. lucernus da TC42 (3,12 ±,56 mg/ml e 6,3 ± 1,39 µg/ml) rispetto a quelli di TC43 (1,92 mg/ml e 4,52 µg/ml); sono invece risultati confrontabili i livelli di metaboliti del pirene in C. lucernus dai due siti (,1 ±,2 µg/ml). Tutti i diversi tipi di metaboliti biliari hanno mostrato valori confrontabili in dai due siti (,2 ±,4 µg/ml per il pirene; 1,6 ±,43 mg/ml per il naftalene e 5, ±,31 µg/ml per il BaP) (Figura 9.2.1). L attività dell AOX ha mostrato valori confrontabili tra TC43 e TC42 in C. lucernus (1,1 ±,5 nmol/min/mg prot), mentre ha presentato valori solo mediamente più alti nella stazione TC42 rispetto a TC43 (,68 ±,1 vs,33 nmol/min/mg prot). L attività dell acetilcolinesterasi ha evidenziato andamenti diversi in funzione delle specie: in C. lucernus i valori sono risultati significativamente più bassi nella stazione di riferimento TC43 (15,9 vs 56,7 ± 1,83 nmol/min/mg prot), mentre per valori marcatamente inferiori sono stati misurati nella stazione TC42 (15,9 ± 2,91 vs 84,1 nmol/min/mg prot) (Figura 9.2.1). Valori simili di percentuale di DNA nella coda sono stati misurati negli esemplari di C. lucernus campionati nelle due stazioni (27,6 ± 2,6 %), mentre ha mostrato valori più alti in TC42 (43,5 ± 22,6 %) rispetto a TC43 (19,1 %). Anche la frequenza di micronuclei ha evidenziato qualche differenza tra le due stazioni. Nel sangue, nelle branchie e nella milza di C. lucernus è stata misurata una frequenza di micronuclei più alta in TC42 (,65 ±,45, 3.82 ±,61 e 1,94 ±,59 ) rispetto a TC43 (,,,86 e 1, ). Valori confrontabili di frequenza di micronuclei sono stati misurati nel sangue di (,42 ±,8 ), mentre nelle branchie gli organismi di TC43 hanno evidenziato valori di 4,9 rispetto a,83 ±,2 in quelli di TC42. Andamento opposto è stato osservato nella milza dove la frequenza di micronuclei in di TC42 è risultata significativamente più alta che nel sito TC43 (3,12 ± 1,28 vs,5 ) (Figura 9.2.2). ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 61

9 Per quanto riguarda i biomarkers di stress ossidativo (Figura 9.2.3), C. lucernus ha evidenziato attività di catalasi, glutatione S-transferasi e glutatione perossidasi più basse in TC42 (32,3 ± 3,1 µmol/min/mg prot, 24 ± 18,7 nmol/min/mg prot e 75,3 ± 12,2 nmol/min/mg prot rispettivamente) rispetto agli organismi campionati in TC43 (114 µmol/min/mg prot, 382 nmol/min/mg prot e 14 nmol/min/mg prot); valori confrontabili sono stati misurati per la glutatione reduttasi (6,45 ±,32 nmol/min/mg prot) e il glutatione totale (,11 ±,1 µmol/gr tess). Per quanto riguarda, attività confrontabili tra gli organismi delle stazioni TC42 e TC43 sono state misurate per le glutatione S- transferasi (593 ± 2,4 nmol/min/mg prot) e i livelli di glutatione totale (,5 ±,1 µmol/gr tess e,4 µmol/gr tess). L attività della catalasi e delle glutatione perossidasi sono risultate solo leggermente più basse negli individui campionati in TC42 (97,7 ± 17, µmol/min/mg prot e 73,9 ± 38,7 nmol/min/mg prot) rispetto a quelli della stazione TC43 (132 µmol/min/mg prot e 16 nmol/min/mg prot). La capacità antiossidante totale verso i radicali perossilici ha evidenziato livelli tendenzialmente più alti in entrambe le specie per gli organismi provenienti dalla stazione TC42 (45 ± 4,12 C. lucernus e 391 ± 87,9 UTosc/mg prot ) rispetto a quelli di TC43 (333 UTosc/mg prot e 242 UTosc/mg prot). Un andamento opposto è stato invece osservato per la capacità antiossidante totale verso i radicali idrossilici; i valori di TOSC-OH in C. lucernus sono risultati di 443 ± 267 UTosc/mg prot e 83 UTosc/mg prot rispettivamente in TC42 e TC43, mentre in i valori misurati sono stati di 46 ± 174 UTosc/mg prot e 72 UTosc/mg prot per i due siti. L accumulo di malondialdeide in C. lucernus è risultato più basso nella stazione TC42 (27,9 ± 5,89 nmol/gr tess vs 36,5 nmol/gr tess) dove, invece, lo S. acantias ha mostrato livelli tendenzialmente più alti (21,8 ± 4,54 nmol/gr tess vs 14,5 nmol/gr tess) (Figura 9.2.3). ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 611

10 Metallotioneine Eq. GSH µmol/mg prot C.lucernus C.lucernus Attivià EROD pmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB METABOLITI PIRENE µg/ml C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB METABOLITI NAFTALENE mg/ml C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB METABOLITI BaP µg/ml Attività AOX nmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB Attività acetilcolinesterasi nmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 Figura 9.2.1: Livelli di metallotioneine, attività EROD, metaboliti del pirene, metaboliti del naftalene, metaboliti del benzo[a]pirene, attività della acil CoA ossidasi (AOX) e acetilcolinesterasi in C. lucernus e campionati durante la campagna di (Dicembre 28) dai due siti TC42 e TC43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 612

11 7 Grado di frammentazione del DNA % DNA nella coda 1.2 Micronuclei sangue Frequenza MN C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TB42 TC42 C.lucernus C.lucernus TB43 ctrl TB42 TC43 (controllo) TC42 6 Micronuclei branchie Frequenza MN Micronuclei milza Frequenza MN C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 C.lucernus C.lucernus TB43 ctrl TB42 TC43 (controllo) TC42 Figura 9.2.2: Grado di frammentazione del DNA, micronuclei nel sangue, micronuclei nelle branchie e micronuclei nella milza di C. lucernus e campionati durante la campagna di (Dicembre 28) dai due siti TC42 e TC43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 613

12 Attività catalasi µmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus Attività glutatione S-transferasi nmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB Attività glutatione reduttasi nmol/min/mg prot nd C.lucernus C.lucernus nd Attività glutatione perossidasi nmol/min/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42.16 Livelli di glutatione totale µmol/gr tess 6 Capacità antiossidante totale (TOSC-ROO) UTosc/mg prot C.lucernus C.lucernus C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB Capacità antiossidante totale (TOSC-OH) UTosc/mg prot C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB Livelli di malondialdeide nmol/gr tess C.lucernus C.lucernus TC43 TB43 (controllo) ctrl TC42 TB42 Figura 9.2.3: Attività enzimatiche di catalasi, glutatione S-transferasi, glutatione reduttasi, glutatione perossidasi, livelli di glutatione, capacità antiossidante totale verso i radicali perossilici ed idrossilici, malondialdeide in C. lucernus e campionati durante la campagna di (Dicembre 28) dai due siti TC42 e TC43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 614

13 9.3 Discussione dei risultati ottenuti nelle specie ittiche campionate durante la campagna di e confronto con quelli ottenuti nelle campagne di bianco Durante la campagna di dalla stazione TC43 è stato campionato un solo organismo per ciascuna delle due specie, e non è stato pertanto possibile fare un adeguata elaborazione statistica di questi risultati. Inoltre, durante le fasi di bianco sono state rinvenute specie diverse, e ciò non ha permesso di confrontare i valori dei biomarkers misurati negli organismi ottenuti durante la fase di con quelli di individui della stessa specie e dello stesso periodo stagionale. Il confronto tra fase di e fase di bianco è stato pertanto effettuato con gli esemplari di S. acantias campionati nel Maggio 26 e di C. lucernus nell Aprile 27 (Figure ). Per entrambe le specie, i livelli di metallotioneine, l attività EROD e i metaboliti della bile hanno evidenziato valori confrontabili tra gli organismi campionati durante la fase di dalle due stazioni (T43 e T42), mentre qualche differenza è stata osservata con i risultati delle campagne di bianco (Figura 9.3.1). I livelli di metallotioneine, le cui variazioni sono spesso considerate biomarkers di esposizione a contaminanti metallici, sono risultati più bassi, per entrambe le specie, nel Dicembre 28 rispetto alle precedenti campagne di bianco. Poiché i livelli di queste proteine citosoliche sono fortemente influenzati da fattori stagionali, che nei pesci sono rappresentati in particolare dalle fasi del ciclo riproduttivo (Langston et al., 22), le differenze osservate tra la fase di e quelle di bianco riflettono probabilmente le diverse condizioni biologiche tra gli esemplari campionati nei periodi primaverili (Maggio -6 e Aprile -7) rispetto al campionamento invernale (Dicembre -8). L attività EROD e i metaboliti nella bile sono risultati in generale confrontabili tra la fase di e quelle di bianco, con livelli che rientrano nel range di variabilità naturale (Gorbi et al., 25). Tra i biomarkers di esposizione qualche differenza tra siti è stata osservata in entrambe le specie per la proliferazione perossisomiale e l acetilcolinesterasi. Confrontando i risultati con quelli dei campionamenti precedenti, l attività della acil CoA ossidasi (AOX) è diminuita sensibilmente dall Aprile 27 al Dicembre 28 in C. lucernus (specie però presente con un solo esemplare nella campagna di bianco) e tale risultato potrebbe riflettere una normale fluttuazione stagionale. Anche l acetilcolinesterasi ha presentato valori diversi tra la fase di e quelle di bianco, e il diverso andamento temporale osservato nelle due specie suggerisce ancora una volta che tali variazioni non siano imputabili a caratteristiche dell area, e dunque alla presenza di specifici inquinanti, ma piuttosto a fattori che influenzano differentemente le due specie. Per quanto riguarda i risultati dei danni genotossici (Figura 9.3.2), qualche differenza significativa è stata osservata in funzione delle stazioni e dei periodi di campionamento, ma le variazioni non sono tali da evidenziare condizioni di disturbo biologico rilevante nell area del terminale durante la fase di. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 615

14 I biomarkers di stress ossidativo hanno mostrato limitate differenze tra gli organismi delle due stazioni analizzate durante la fase di (Figura 9.3.3), ed anche il confronto con le campagne di bianco ha confermato variazioni di bassa entità, che rientrano nel range delle normali fluttuazioni stagionali dei parametri analizzati, e che generalmente prevalgono sulle differenze tra stazioni (Bocchetti and Regoli, 26). ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 616

15 TB42 TB43 Maggio-6 Metallotioneine Eq. GSH nmol/mg prot Attività EROD (pmol/min/mg prot) TC42 TB42 TC43 TB43 C. lucernus TB42 C.lucernus TC42 TB42 C. lucernus TC43 TB43 TB42 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 C. lucernus TB42 C.lucernus TC42 TB42 C. lucernus TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Maggio-6 Dicembre -8 Aprile -7 Dicembre-8.7 METABOLITI PIRENE µg/ml 4. METABOLITI NAFTALENE mg/ml TB42 Maggio-6 TB43. TC42 TB42 TC43 TB43 C. lucernus TB42 C.lucernus TC42 TB42 C. lucernus TC43 TB43 TB42 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 C. lucernus TB42 C.lucernus TB42 TC42 C. lucernus TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile -7 Dicembre-8 Maggio-6 Dicembre -8 Aprile -7 Dicembre-8 1 METABOLITI BaP µg/ml Attività AOX nmol/min/mg prot TB42 Maggio-6 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile -7 Dicembre TB42 Maggio-6 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TB42 TC42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Attività acetilcolinesterasi nmol/min/mg prot TB42 Maggio-6 TB43 TB42 TC42 Dicembre -8 TC43 TB43 C. lucernus TB42 Aprile 7 C.lucernus TC42 TB42 Dicembre-8 C. lucernus TC43 TB43 Figura 9.3.1: Variazioni dei livelli di metallotioneine, attività EROD, metaboliti del pirene, metaboliti del naftalene, metaboliti del benzo[a]pirene, attività della acil CoA ossidasi (AOX) e acetilcolinesterasi in C. lucernus e campionati durante le campagne di bianco e di dai due siti T42 e T43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 617

16 7 Grado di frammentazione del DNA % DNA nella coda TB42 TB43 Maggio-6 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Micronuclei nel sangue Frequenza di MN TB42 Maggio-6 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 6. Micronuclei nelle branchie Frequenza di MN TB42 Maggio-6 TB43 TC42 TB42 TB43 TC43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Micronuclei nella milza Frequenza di MN TB42 Maggio-6 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TB42 TC42 TB43 TC43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Figura 9.3.2: Variazioni del grado di frammentazione del DNA, micronuclei nel sangue, micronuclei nelle branchie e micronuclei nella milza di C. lucernus e campionati durante le campagne di bianco e di dai due siti T42 e T43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 618

17 3 Attività catalasi µmol/min/mg prot 1..9 Livelli di glutatione totale µmol/gr tess TB42 TB43 Maggio-6 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8. TB42 TB43 Maggio-6 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 16 Attività glutatione S-transferasi nmol/min/mg rot 12 Capacità antiossidante totale (TOSC-ROO) Utosc/mg prot TB42 TB43 Maggio-6 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Maggio-6 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 25 Attività glutatione reduttasi nmol/min/mg prot 9 Capacità antiossidante totale (TOSC-OH) Utosc/mg prot TB42 TB43 Maggio-6 TB42 TC42 TC43 TB43 TB42 TB42 TC42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 TB42 TB43 Maggio-6 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TC42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre Attività glutatione perossidasi nmol/min/mg prot 6 Livelli di malondialdeide nmol/gr tess TB42 TB43 Maggio-6 TB42 TC42 TB42 TC43 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TB43 TC42 TB42 TC43 TB43 TB42 TB42 TC42 TC43 TB43 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Maggio-6 Dicembre -8 Aprile 7 Dicembre-8 Figura 9.3.3: Variazioni delle attività enzimatiche di catalasi, glutatione S-transferasi, glutatione reduttasi, glutatione perossidasi, livelli di glutatione, capacità antiossidante totale verso i radicali perossilici ed idrossilici, malondialdeide in C. lucernus e campionati durante le campagne di bianco e di dai due siti T42 e T43. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 619

18 9.4 Conclusioni Il limitato numero di esemplari e la variabilità delle specie campionate non ha permesso di effettuare un accurato confronto tra organismi delle due aree e tra le diverse fasi di bianco o. Nonostante ciò, i risultati ottenuti dai biomarkers analizzati nelle due specie ittiche durante la campagna di permettono di escludere la presenza di condizioni di disturbo biologico significativo nell area del terminale. I biomarkers di esposizione hanno mostrato valori bassi, confrontabili con quelli misurati in organismi provenienti da aree non impattate, e all interno del normale range di variabilità stagionale caratteristico dei parametri analizzati. Anche i biomarkers genotossici e di stress ossidativo, pur evidenziando una certa variabilità inter- e intraspecifica, nel complesso hanno confermato l assenza di effetti biologici negativi sugli organismi riconducibili alle attività di nell area del terminale. ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 62

19 APPENDICE BIOMARKERS AREA TERMINALE CAMPAGNE DICEMBRE 28 Fase di ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 621

20 Area Terminale Specie di interesse per la pesca Cantiere Dicembre 28 TC42 Chelidonichthys Squalus acanthias BIOMARKERS lucernus Esposizione a metalli in traccia Metallotioneine 35, ± 2,99 55,2 ± 12,4 Eq. (GSH) nmol/mg prot Esposizione a composti aromatici Attività enzimatica della etossiresorufina O-deetilasi (EROD) 1,63 ± 1,14 1,53 ±,37 pmol/min/mg ptr Metaboliti tipo-pirene nella bile,2 ±,4,9 ±, µg/ml Metaboliti tipo-naftalene nella bile 1,27 ±,1 3,12 ±,56 mg/ml Metaboliti tipo-bap nella bile 4,74 ±,38 6,3 ± 1,39 µg/ml Prolif. perossisomiale (esposizione a proliferatori perossisomiali) Att. enzimatica AcilCoA ossidasi (AOX),68 ±,1 1,15 ±,17 nmol/min/mg prt Esposizione a organofosforici, carbammati ed altri inquinanti Att. enzimatica della acetilcolinesterasi (AchE) 15,9 ± 2,91 56,7 ± 1,82 nmol/min/mg prt Esposizione a inquinanti estrogenici Induzione gene della VTG nd nd n.d.: non determinabile in quanto al di sotto del limite di rilevabilità ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 622

21 BIOMARKERS Danni DNA Area Terminale Specie di interesse per la pesca Cantiere Dicembre 28 Squalus acanthias TC42 Chelidonichthys lucernus Integrità strutturale DNA (Comet Assay) 43,5 ± 22,6 29, ± 1,3 % DNA nella coda Micronuclei nel sangue,36 ±,33,65 ±,45 Frequenza di MN ogni 1 cellule Micronuclei nelle branchie,83 ±,2 3,82 ±,61 Frequenza di MN ogni 1 cellule Micronuclei nella milza 3,12 ± 1,28 1,94 ±,59 Frequenza di MN ogni 1 cellule Parametri stress ossidativo Att. enzimatica della catalasi 97,7 ± 17, 32,3 ± 3,1 µmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione S-transferasi (GST) 68 ± 8,8 24 ± 18,7 nmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione Reduttasi (GR) n.d. 6,22 ±,46 nmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione perossidasi (GPx) 73,9 ± 38,7 75,3 ± 12,2 nmol/min/mg prt Livelli di Glutatione totale,6 ±,,11 ±,2 µmol/g tess Capacità antiossidante totale (TOSC ROO ) 391 ± 87,9 45 ± 4,12 U Tosc/mg prt Capacità antiossidante totale (TOSC HO ) 46 ± ± 267 U Tosc/mg prt Perossidazione lipidica Livelli di malondialdeide 21,8 ± 4,54 27,9 ± 5,89 nmol/g tess n.d.: non determinabile in quanto al di sotto del limite di rilevabilità ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 623

22 BIOMARKERS Esposizione a metalli in traccia Area Terminale Specie di interesse per la pesca Cantiere Dicembre 28 Squalus acanthias TC43 Chelidonichthys lucernus Metallotioneine 32,1 53,3 Eq. (GSH) nmol/mg prot Esposizione a composti aromatici Attività enzimatica della etossiresorufina O-deetilasi (EROD) 2,35 4,51 pmol/min/mg ptr Metaboliti tipo-pirene nella bile,25,12 µg/ml Metaboliti tipo-naftalene nella bile 1,89 1,92 mg/ml Metaboliti tipo-bap nella bile 5,19 4,52 µg/ml Prolif. perossisomiale (esposizione a proliferatori perossisomiali) Att. enzimatica AcilCoA ossidasi (AOX),33 1,8 nmol/min/mg prt Esposizione a organofosforici, carbammati ed altri inquinanti Att. enzimatica della acetilcolinesterasi (AchE) 84,1 15,9 nmol/min/mg prt Esposizione a inquinanti estrogenici Induzione gene della VTG nd nd n.d.: non determinabile in quanto al di sotto del limite di rilevabilità ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 624

23 BIOMARKERS Danni DNA Area Terminale Specie di interesse per la pesca Cantiere Dicembre 28 TC43 Squalus acanthias Chelidonichthys lucernus Integrità strutturale DNA (Comet Assay) 19,2 26,1 % DNA nella coda Micronuclei nel sangue,48, Frequenza di MN ogni 1 cellule Micronuclei nelle branchie 4,9,86 Frequenza di MN ogni 1 cellule Micronuclei nella milza,5 1, Frequenza di MN ogni 1 cellule Parametri stress ossidativo Att. enzimatica della catalasi µmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione S-transferasi (GST) nmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione Reduttasi (GR) nd 6,67 nmol/min/mg prt Att. enzimatica delle Glutatione perossidasi (GPx) nmol/min/mg prt Livelli di Glutatione totale,4,11 µmol/g tess Capacità antiossidante totale (TOSC ROO ) 242, U Tosc/mg prt Capacità antiossidante totale (TOSC HO ) U Tosc/mg prt Perossidazione lipidica Livelli di malondialdeide 14,5 36,5 nmol/g tess n.d.: non determinabile in quanto al di sotto del limite di rilevabilità ISPRA (212) Monitoraggio area del Terminale GNL di Porto Viro Fase di 625