Studio traslazionale dei correlati neurobiologici e delle alterazioni neuropsichiatriche indotti

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1 Studio traslazionale dei correlati neurobiologici e delle alterazioni neuropsichiatriche indotti da derivati anfetaminici. I derivati anfetaminici (metanfetamina, metilendiossimetanfetamina) negli abusatori cronici causano disturbi psichiatrici e nei soggetti che abusano di queste sostanze sono stati dimostrati svariati effetti psicopatologici e che persistono cronicamente dopo la cessazione dell abuso. Per molto tempo si è discusso se questi effetti potessero rappresentare la slatentizzazione di una personalità pre-morbosa, che predisporrebbe quindi agli effetti psicopatologici indotti da derivati anfetaminici. In effetti il concetto di doppia diagnosi per caratterizzare il disturbo d abuso e le malattie psichiatriche è proprio basato su questa sovrapposizione concausale. In realtà ben sappiamo che i correlati neurobiologici dei derivati anfetaminici si sovrappongono a quelli presenti in alcuni disturbi psichiatrici puri. Questo induce a ipotizzare che i derivati anfetaminici di per sé possano modificare la neurobiologia in maniera persistente inducendo le stesse alterazioni anatomo-funzionali responsabili della psicopatologia. A conferma di questa ipotesi, la somministrazione dei derivati anfetaminici è considerata tuttora il miglior modello sperimentale di psicosi e le alterazioni acute indotte da questi derivati riproducono i meccanismi molecolari che operano in varie fasi dei disturbi dell umore e dei fenomeni compulsivi. Appare degno di nota il fatto che i farmaci stabilizzanti dell umore e i neurolettici siano in grado di mitigare gli effetti e i danni indotti dai derivati anfetaminici e allo stesso tempo siano in grado di curare la psicopatologia che avviene nelle malattie psichiatriche pure. Queste convergenze richiamano l esistenza di meccanismi molecolari simili nella produzione del danno da derivati anfetaminici e delle modificazioni cerebrali responsabili di eventi psicopatologici. Negli ultimi anni è emerso che il metabolismo dei neuroni regolato dall autofagia è essenziale negli effetti prodotti dai derivati anfetaminici. Gli stabilizzati dell umore, d altra parte, producono effetti marcati sull attività della via autofagica.

2 Pertanto, la presente ricerca, che si svolgerà a livello sperimentale con potenziali correlazioni cliniche, valuterà il legame tra autofagia, derivati anfetaminici e psicopatologia. In particolare: 1) Verrà dettagliato il ruolo dell autofagia nel danno indotto dai derivati anfetaminici. Procedura sperimentale. A tale scopo verranno eseguite indagini morfologiche in microscopia ottica ed elettronica e di immunoblotting in modelli sperimentali in vivo (roditore) e in vitro (colture cellulari) trattati con derivati anfetaminici, quali metanfetamina (MA) e metilendiossimetanfetamina (MDMA, ecstasy ). In particolare il progetto si focalizza sul modello in vivo in cui viene somministato un composto anfetamino-simile (MA o MDMA). In queste condizioni sperimentali si verificherà l eventuale insorgenza di alterazioni autofagiche che verranno documentate nel mesencefalo attraverso l analisi ultrastrutturale di vacuoli autofagici. Contemporaneamente verrà valutato l eventuale accumulo di substrati autofagici come l alfa si nucleina nelle stesse aree cerebrali. I modelli in vitro consentiranno di studiare in modo meccanicistico gli effetti dei derivati anfetaminici rilevati nel modello in vivo. Verranno impiegate linee cellulari dopaminergiche (cellule di feocromocitoma di ratto, PC12, cellule di neuroblastoma umano, SH-SY5Y) alle quali i composti anfetaminici (MA) verranno somministrati a varie dosi e per vari tempi di esposizione. Per ogni condizione sperimentale verranno eseguite le stesse indagini morfologiche e di immunoblotting descritte per il modello in vivo. Indagini qualitative di immunoistochimica dirette verso antigeni della via autofagica, supportate da indagini semiquantitative in immunoblotting per gli stessi antigeni, potranno documentare l effetto dei derivati anfetaminici sulla progressione della via autofagica. Questo tipo di indagine verrà approfondita mediante l analisi ultrastrutturale e di immunocitochimica in microscopia elettronica a trasmissione, che consentirà di visualizzare lo stato della via autofagica attraverso l analisi morfologica dei vacuoli autofagici e la loro marcatura per antigeni specifici di fasi distinte dell autofagia. Nel caso in cui vi sia un alterazione della via

3 autofagica, come si presuppone dalla letteratura pre-esistente, verrà verificato se tale via sia protettiva o contribuisca alla produzione della lesione. Risultati attesi. Vi sono ampie evidenze che la via autofagica sia compromessa in seguito alla somministrazione di derivati anfetaminici. Se tale effetto viene confermato ci attendiamo di: - Stabilire se l autofagia svolge un ruolo protettivo nei confronti degli effetti dei derivati anfetaminici - Ottenere un miglioramento o un esacerbazione degli effetti prodotti dai derivati anfetaminici in seguito, rispettivamente, all attivazione o inibizione della via autofagica - Ottenere, in seguito alla somministrazione di derivati anfetaminici in presenza di modulatori dell autofagia, cambiamenti nel numero e nell ultrastruttura dei vacuoli autofagici e nei livelli di specifici marker autofagici.

4 Neurobiological correlates and neuropsichiatric alterations induced by amphetamine derivatives: a traslational study Amphetamine derivatives (metamphetamine, methylendiossimethamphetamine) cause persistent psychiatric alterations in chronic abusers which last after interrupting drug intake. For a long time it was debated whether these effects could be triggered by the chronic intake of amphetamine derivatives only in predisposed individuals. These considerations led to the opportunity to express a double diagnosis, in order to characterize pure psychiatric disorders and drug-induced psychiatric alterations. It is well established that the neurobiological correlates of amphetamine derivatives overlap to those occurring in a variety of pure psychiatric disorders, leading to hypothesize that amphetamine derivatives per se could modify the neurobiology in a persistent manner inducing the same morphofunctional alterations responsible for the psychopathology. To confirm this hypothesis, administration of amphetamine derivatives is so far considered the best experimental model of psychosis and the acute alterations induced by these compounds recapitulate the molecular mechanisms acting in mood disorders and compulsive behaviour. It is noticeable that mood stabilizers and neuroleptics are able to mitigate the behavioural and toxic effects induced by amphetamine derivatives and, at the same time, to cure the psychopathology occurring in pure psychiatric disorders. These similarities call for common molecular mechanisms underlying neurotoxicity induced by amphetamine derivatives and cerebral changes responsible for psychopathological diseases. In recent years neuronal metabolism regulated by autophagy is emerging as pivotal in the effects induced by amphetamine derivatives. On the other hand, mood stabilizers produce marked effects on autophagy pathway. Therefore, the present research aims to evaluate the relationship between autophagy, amphetamine derivatives and psychopathology.

5 In particular the role of autophagy pathway in the toxicity of amphetamine derivatives will be investigated. Experimental procedures. For this purpose in vivo (rodents) and in vitro (cell cultures) models treated with amphetamine derivatives as Metamphetamine (MA) and Methylenedioxymethamphetamine (MDMA ecstasy ) will be used and morphological analysis at light and transmission electron microscope joined by western blotting will be performed. The in vivo study represent the central part of this project. Ultrastructural analysis of the midbrain from animals treated with an amphetamine derivative (MA or MDMA) will be performed to detect autophagy alterations featuring as autophagic vacuoles and alpha-synuclein aggregates. In vitro model will allow to study the fine cellular mechanisms of the amphetamines toxicity. At this purpose, dopaminergic cell lines (the PC12 cell line derived from rat pheochromocytoma and the SH-SY5Y cell line derived from human neuroblastoma) will be treated with MA at different doses and at different times of exposure. In these experimental conditions, morphological and western blotting analysis described for the in vivo experiments will be also performed. Qualitative immunohistochemistry against autophagy proteins and quantitative immunoblotting for the same antigens accompanied by densitometric analysis will document the effects of amphetamine derivatives on autophagy progression. For a more in depth investigation, transmission electron microscopy joined with immunoelectromicroscopy will allow to visualize the progression of the autophagy pathway throughout the morphological analysis of autophagy vacuoles and autophagy markers specific for distinct autophagy phases. In the presence of impairment of the autophagy pathway, as supposed by the previous literature, it will be evaluate whether this pathways is protective or contribute to cell damage.

6 Expected results. There is strong evidence that autophagy is altered after administration of amphetamine derivatives. If this effect will be confirmed it is expected: - to establish whether autophagy plays a protective role against the effects of amphetamine derivatives; - to obtain an improvement or a worsening of the effects induced by amphetamine derivatives after autophagy induction or inhibition, respectively; - to obtain changes in the number and ultrastructure of the autophagy vacuoles, as well as in the levels of specific autophagy markers, after treatment with amphetamine derivatives in the presence of the autophagy modulators.