ANALISI QUANTITATIVA DEI RESIDUI DI PESTICIDI NEL VINO DOPO ESTRAZIONE MEDIANTE METODO QuEChERS

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1 RISOLUZIONE OIV-OENO UTILIZZO DEL METODO DI ESTRAZIONE QUECHERS PER LA DETERMINAZIONE DEI PESTICIDI NEL VINO L ASSEMBLEA GENERALE Visto l articolo 2 paragrafo 2 iv dell accordo del 3 aprile 2001 istitutivo dell Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, Su proposta della Sottocommissione Metodi di Analisi, DECIDE su proposta della Commissione II Enologia di introdurre il seguente metodo di tipo II alla Raccolta dei metodi internazionali di analisi dei vini e dei mosti : ANALISI QUANTITATIVA DEI RESIDUI DI PESTICIDI NEL VINO DOPO ESTRAZIONE MEDIANTE METODO QuEChERS Tipo di metodo: II 1 - INTRODUZIONE Per la preparazione del presente metodo di analisi sono stati utilizzati vari testi di riferimento ed il metodo è stato convalidato da un laboratorio [1] [2]. 2 AMBITO D APPLICAZIONE Il presente metodo definisce le modalità di estrazione dei residui di pesticidi nel vino mediante il metodo QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe) e l analisi degli estratti ottenuti mediante GC/MS e/o LC/MS-MS. 3 - PRINCIPIO Il campione viene estratto mediante acetonitrile seguito dalla separazione liquidoliquido attraverso aggiunta di solfato di magnesio, di cloruro di sodio e di un tampone di sali di citrato. L estratto viene quindi purificato con l aiuto d amino-assorbente (SPE dispersivo con APSe solfato di magnesio). Gli estratti vengono acidificati mediante aggiunta di una piccola quantità di acido formico, al fine di migliorare la loro stabilità durante lostoccaggio. L estratto finale può essere utilizzato direttamente per le analisi di determinazione mediante GC/MS e LC/MS-MS. Per le sole analisi in LC/MS-MS, la SPE dispersiva non è indispensabile. 1

2 4. REAGENTI E PRODOTTI 4.1. Regole generali e sicurezza I pesticidi sono potenzialmente tossici e, di conseguenza, devono essere manipolati in condizioni di sicurezza suscettibili di proteggere gli analisti in particolar modo durante la preparazione di soluzioni madri a partire da sostanze attive commerciali. Adottare qualsiasi precauzione necessaria al fine di evitare una potenziale contaminazione dell acqua, solventi e altri prodotti. Fatta salva qualsivoglia indicazione contraria, i reagenti utilizzanti saranno di qualità analitica riconosciuta. 4.2 Acqua, qualità HPLC 4.3 Acetonitrile [ ] qualità HPLC 4.4 Metanolo [ ], qualità CLHP 4.5 Solfato di magnesio anidro [ ], particelle 4.6 Solfato di magnesio anidro [ ], polvere fine 4.7 Cloruro di sodio [ ] 4.8 Citrato d idrogeno disodico sesquidrato [ ] 4.9 Citrato trisodico diidrato [ ] 4.10 Miscela di sali tamponi per la fase di estrazione: Pesare 4 g di solfato di magnesio anidro granulare, 1 g di cloruro di sodio, 1 g di citrato trisodico diidrato e 0,5 g di citrato d idrogeno disodico sesquidrato all interno di un flacone. Miscelare in anticipo i sali consente di evitare la formazione di cristalli Soluzione di acido formico in acetonitrile. Diluire 0,5 ml di acido formico fino a 10 ml con acetonitrile Adsorbente ad amine primarie e secondarie APS. Per esempio Bondesil-PSA 40 µm Varian n Soluzioni di standard interno e soluzioni standard di controllo qualità. Diversi composti possono essere utilizzati come standard interno: ad esempio il trifenilfosfato [ ] e il trifenilmetano [ ]. Lo standard di controllo qualità consente di disporre di un indicatore di rendimento di estrazione dei residui dei campioni: ad esempio il tris(1,3-dicloro isopropil) fosfato o TCPP. Occorre preparare soluzioni di concentrazione appropriata. Esempio di preparazione: soluzione di TCPP a 10 mg/l All interno di un matraccio graduato di 50 ml, inserire 1 ml di soluzione madre con concentrazione di 500 mg/l di tri(dicloro isopropil) fosfato quindi portare a volume con acetonitrile. 2

3 4.14. Intervalli di calibrazione; soluzioni standard di differenti sostanze attive Soluzioni madre Preparare soluzioni madri a partire da sostanze attive con concentrazioni di 500 mg/l all interno di un solvente adatto (ad esempio, acetone). Conservazione a -18 C Soluzioni di lavoro Miscela di sostanze attive secondo l applicazione (CPG o LC) e secondo le necessità degli intervalli di taratura Retta di taratura Campioni in acetonitrile A partire dalle soluzioni di lavoro, si preparano soluzioni standard al fine di stabilire una retta di taratura da 20 a 500 µg/l. Campioni nella matrice vino A partire da un vino esente da sostanze attive, si prepare un bianco secondo il protocollo 6.1.1, quindi vengono aggiunte quantità crescenti di sostanze attive al fine di stabilire una retta di taratura da 20 a 500 µg/l. 5. Materiali 5.2. Vetreria e materiali volumetrici da laboratorio: Flaconi da 100 ml con tappo Provette da centrifuga usa e getta da 50 ml e da 12 ml con tappi da avvitare Provette graduate da 10 ml classe A Matracci graduati 10 ml, 50 ml e 100 ml di classe A Strumenti volumetrici a pistone con volumi variabili da 30 µl a 1000 µl verificati secondo ISO Siringhe per prelievi da 2 ml 5.3. Microfiltri in nylon con porosità 0,45 µm 5.4. Bilancia analitica 5.5. Dispositivo per agitazione a grande velocità (tipo Vortex) 5.6. Centrifughe per provette da 50 ml e 12 ml, con una capacità fino a g Sistema LC/MS-MS, munito di un interfaccia di ionizzazione mediante elettrospray. 3

4 5.8. Sistema CG-MS, munito di un dispositivo d iniezione e di rilevamento appropriato (ad esempio trappola di ioni o triplo quadrupolo). 6. MODALITÀ OPERATIVA 6.1. Preparazione dei campioni Estrazione mediante il metodo QuEChERS. All interno di un tubo da centrifuga, pesare 10 g o misurare 10 ml di campione (vino) e 10 ml di acetonitrile e 100 µl di una soluzione di tris(1,3-dicloro isopropil) fosfato a 10 mg/l. Agitare vigorosamente per 1 minuto. Versare il preparato di sali (4.10) all interno provetta del tubo da centrifuga contenente la miscela liquida. Agitare vigorosamente per 1 minuto. Centrifugare per 5 min. a g. 1 ml circa di soluzione viene filtrato sui filtri di nylon 25 mm/45 µm per procedere quindi all analisi mediante LC-MS Purificazione dell estratto con l aiuto di amino-assorbente ( SPE dispersiva con APS) 6 ml di fase di acetonitrile ottenuti al punto vengono travasati all interno di un provetta tubo da centrifuga contenente 900 mg di solfato di magnesio, polvere fine (4.6) e 150 mg di APS (4.12). Chiudere il tubo e agitare vigorosamente per 30 secondi, quindi centrifugare per 5 min a g. Senza attendere, isolare e acidificare l estratto così purificato aggiungendo 50 µl di soluzione acida formica (4.11). A questo punto può essere realizzata l analisi GC-MS. NOTA: per minimizzare gli effetti matrice, è possibile utilizzare una soluzione di agenti "protettori", aggiunti agli estratti dei campioni e alle soluzioni standard per la retta di taratura [3]. Preparazione di 10 ml di soluzione di agenti «protettori»: pesare 15 mg di sorbitolo, 300 mg di etilglicerolo e 100 mg di gluconolactone. Aggiungere 2 ml di acqua. Portare a 10 ml con acetonitrile. 20 μl di questa soluzione viene aggiunta in ogni flacone contenente le soluzioni di taratura (1 ml) e gli estratti dei campioni (1 ml) Risultati e calcoli Identificazione dei residui. I residui vengono identificati secondo diversi parametri: - il loro tempo di ritenzione - il loro spettro di massa - l'abbondanza relativa di frammenti ionici (si raccomanda di disporre di 1-2 transizioni in MS/MS e da 2 a 3 ioni in MS). 4

5 Quantificazione L analisi degli estratti ottenuti in e può essere eseguita utilizzando vari strumenti, parametri e colonne. Occorre tuttavia adattare le condizioni per ciascun composto sulla base degli strumenti utilizzati al fine di ottenere le migliori sensibilità. A partire dalle soluzioni standard, viene preparata una retta di taratura a 5 punti al fine di verificare la linearità per ciascuna materia attiva. La concentrazione in mg/kg (o mg/l) per ogni sostanza identificata, si ottiene direttamente a partire dalla retta di taratura Rendimento dell estrazione Il rendimento può essere verificato mediante aggiunta, all interno dei campioni, di un campione standard per controllo qualità, ad esempio il TCCP (vedere 6.1.1). Quest'ultimo deve essere compreso tra il 70 e il 120%. I risultati del rendimento non vengono presi in considerazione per correggere le percentuali di residui all interno dei vini, ma consentono di convalidare la modalità operativa. 7. FEDELTÀ DEL METODO I risultati della procedura di validazione realizzata secondo MA-F-AS1-08-FIDMET[4] e MA-F-AS1-09-PROPER [5], sono indicati nella tabella qui di seguito. I tassi di recuperi medi sono compresi tra 70% e 120% (i livelli di dosaggio effettuati hanno coperto un range di concentrazione da 0,020 mg/l a mg/l). 7.1 Ripetibilità (espressa in CV r %) La ripetibilità (espressa in CV r %) è in media uguale al 10%. 7.2 Riproducibilità La riproducibilità (CV R %) è in media uguale al 30%. % Tasso di recup. CV r % CV R % Horrat Metalaxyl ,1 Clorpirifos etile ,0 Tebuconazole ,3 Cyprodinil ,1 Tebufenozide ,2 Fludioxonil ,4 Benalaxyl ,1 Ciproconazolo ,3 Tebufenpirad ,2 Pyraclostrobin ,2 Vinclozolin ,1 Mepanipyrin ,1 Boscalid ,1 5

6 Iprovalicarb ,2 Iprodione ,1 Procimidone ,2 Pyrimethanil ,0 Carbendazim ,6 Fenbuconazole ,0 Fenitrothion ,7 Metrafenone ,7 Penconazolo ,1 Flusilazolo ,3 Oxadixyl ,3 Azoxystrobin ,2 Dimethomorph ,4 Fenexamide ,8 Tutti i risultati dei test interlaboratorio da cui sono stati reperiti i dati fedeltà sono presentati nell appendice A. 8. BIBLIOGRAFIA [1]P. Paya, J. Oliva, A. Barba, M. Anastassiades, D. Mack, I. Sigalova, B. Tasdelen; Analysis of pesticides residues using the Quick Easy Cheap Affective Rugged and Safe (QuEChERS) pesticide multiresidue method in combination with gas and liquid chromatography and tandem mass spectroscopy detection, Anal Bioanal Chem, [2]EN 15662: 2008 Alimenti di origine vegetale Metodo polivalente di determinazione dei residui di pesticidi mediante CG-SM e SL/MS/MS con estrazione/partizione con acetonitrile e purificazione mediante SPE dispersive Metodo QuEChERS; gennaio 2009; AFNOR [3]K. Mastovska, Steven J. Lehotay, and M. Anastassiades; Combination of analyte protectants to overcome matrix effects in routine GC analysis of pesticides residues in food matrixes, Anal. Chem. 2005, 77, [4]MA-F-AS1-08-FIDMET, OIV: Fedeltà dei metodi analitici (Risoluzione Oeno 5/99). [5]MA-F-AS1-09-PROPER, OIV: Protocollo per la pianificazione, la condotta e l'interpretazione degli studi di performance dei metodi di analisi (Risoluzione 6/2000). FV 1410: Risultati dello studio interlaboratorio. 6

7 ALLEGATO A RISULTATI DELLO STUDIO DI FEDELTÀ Questo documento presenta i risultati dello studio di validazione del metodo di analisi quantitativa dei residui di pesticidi nel vino dopo estrazione QuEChERS (FV 1340). Lo studio è stato realizzato secondo i documenti MA-F-AS1-08-FIDMET e MA-F-AS1-09- PROPER. 1 - Laboratori partecipanti Allo studio hanno partecipato sedici laboratori: LABORATOIRE INTER RHONE INSTITUT FUR HYGIENE UND UMWELT LABORATORIO AGROENOLÓGICO UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL MAULE AGRICULTURAL OFFICE OF BORSOD-ABAUJ-ZEMPLEN COUNTY PESTICIDE RESIDUE ANALYTICAL LABORATORY AUSTRIAN AGENCY FOR HEALTH AND FOOD SAFETY COMPETENCE CENTER FOR PLANT PROTECTION PRODUCTS LABORATOIRE DEPARTEMENTAL DE LA SARTHE LABORATOIRE PHYTOCONTROL BENAKI PHYTOPATHOLOGICAL INST. PESTICIDES RESIDUES LAB. LABORATOIRE DUBERNET OENOLOGIE ARPAL DIPARTIMENTO LA SPEZIA ARPA VENETO SERVIZIO LABORATORI VERONA ARPALAZIO SEZIONE DI LATINA ANALAB CHILE S.A. LABORATORIO REGIONAL DE LA CCAA DE LA RIOJA SCL LABORATOIRE DE BORDEAUX ARPA FVG DIP. DI PORDENONE Francia Germania Cile Ungheria Ungheria Austria Austria Francia Francia Grecia Francia Italia Italia Italia Cile Spagna Francia Italia 2 - Campioni - Materie attive analizzate Per questo studio sono stati proposti 12 campioni: - quatto vini rossi: A, B, G, H - quatto vini bianchi: C, D, I, J - due vino di Porto: E, K - due moscati: F, L 27 materie attive dovevano essere dosate e distribuite nei 12 campioni in quantità tali da coprire un range di concentrazione da 0, 015 mg/l a 0,200 mg/l (cfr. tabella sotto). 7

8 A G B H C I D J mg/l mg/l mg/l mg/l Metalaxyl E K mg/l F L mg/l Clorpirifos etile Tebuconazole Cyprodinil Tebufenozide Fludioxonil Benalaxyl Ciproconazolo Tebufenpirad Pyraclostrobin Vinclozolin Mepanipyrin Boscalid Iprovalicarb Iprodione Procimidone Pyrimethanil Carbendazim Fenbuconazole Fenitrothion Metrafenone Penconazolo Flusilazolo Oxadixyl Azoxytrobin Dimethomorph Fenexamide

9 4 - Valutazione statistica Tutti i risultati totali sono presentati nel FV In ogni tabella, i valori rimossi o anomali sono contrassegnati con caratteri diversi. 4.1 Valori rimossi Alcuni valori vengono rimossi prima della valutazione nei seguenti casi: - per valutare la ripetibilità del metodo abbiamo usato il principio dei campioni in doppio cieco: alcuni laboratori hanno dato solo un risultato su uno dei campioni della coppia, questo valore viene eliminato (indicato nella tabella xxx ) - quando i risultati sono espressi come "inferiore a" (indicati nella tabella < xxx ). I test di COCHRAN e GRUBBS sono stati applicati successivamente alle coppie di valori per eliminare le varianze anomale, da un lato, e i valori medi estremi anomali dall'altro. I valori eliminati da questi due test compaiono nelle tabelle sotto forma xxx 4.2 Ripetibilità - Riproducibilità I parametri di ripetibilità e riproducibilità sono riuniti nella tabella 2. In questa tabella sono indicati per ogni sostanza: - n.: numero di test selezionati - media: media dei risultati - TR%: tasso medio di recupero - CV r %: ripetibilità in % della media - CV R %: riproducibilità in % della media - PR CV R %: riproducibilità in % calcolata con l equazione di Horwitz (PR CV% = 2C - 0,1505) - HoR: valore di HorRaT (CV R % / PR CV R %). I criteri di valutazione scelti sono: - tasso di recupero compreso tra il 70 e il 120%. - I risultati ottenuti in condizioni di riproducibilità vengono confrontati con quelli previsti secondo il modello di Horwitz, utilizzando il rapporto HorRat. I valori di riproducibilità vengono considerati soddisfacenti quando questo rapporto è inferiore o uguale a 2. - la ripetibilità è considerata soddisfacente quando non supera il valore di 0,66x Horwitz. 9

10 TABELLA 2: Valori di fedeltà Metalaxyl Clorpirifos etile Tebuconazole Cyprodinil Tebufenozide Vino rosso 1 Vino rosso Vino 2 bianco 1 Vino bianco 2 Porto n media 0,051 0,041 0,105 0,033 0,014 TR% 102% 103% 82% 69% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,1 1 0,9 1,3 1,1 n media 0,073 0,031 0,166 0,018 TR% 73% 78% 83% 90% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,3 1 0,9 0,6 n media 0,025 0,078 0,05 0,04 TR% 100% 98% 100% 100% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,3 1,3 1,2 1,2 n media 0,045 0,036 0,098 0,023 TR% 90% 90% 94% 96% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,3 0,6 1,1 n media 0,049 0,106 TR% 98% 106% CV r % 16 6 CV R % PR CV R % HoR 1 1,3 Moscato 10

11 TABELLA 2 (seguito): Valori di fedeltà Fludioxonil Benalaxyl Ciproconazolo Tebufenpirad Pyraclostrobin Vino rosso 1 Vino rosso 2 Vino bianco 1 Vino bianco 2 Porto n media 0,026 0,064 0,015 TR% 104% 98% 100% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,7 1,2 1,4 n media 0,046 0,04 0,099 0,023 TR% 88% 98% 95% 110% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,2 1,1 0,8 n media 0,049 0,08 0,095 0,042 TR% 91% 93% 88% 98% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,4 0,9 1,3 n media 0,042 0,038 0,094 0,021 TR% 84% 95% 94% 105% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,3 1,2 1,1 1,1 n 8 9 media 0,055 0,121 TR% 110% 121% CV r % 6 5 CV R % PR CV R % HoR 1,2 1,2 Moscato 11

12 TABELLA 2 (seguito): Valori di fedeltà Vinclozolin Mepanipyrin Boscalid Iprovalicarb Iprodione Vino rosso 1 Vino rosso 2 Vino bianco 1 Vino bianco 2 Porto Moscato n media 0,031 0,020 0,039 0,08 TR% 78% 100% 78% 80% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 0,9 1 0,9 n media 0,063 0,028 0,022 0,046 TR% 79% 70% 88% 92% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,3 0,7 1,1 n media 0,022 0,097 0,034 0,083 0,174 TR% 105% 121% 85% 83% 87% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,6 1,3 1 0,7 0,8 n media 0,016 0,016 0,052 0,1 TR% 107% 114% 104% 100% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,3 1,3 1,1 1,2 n media 0,079 0,039 0,053 0,101 TR% 104% 103% 113% 107% CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,5 0,9 1 0,8 12

13 TABELLA 2 (seguito): Valori di fedeltà Vino rosso 1 Vino rosso 2 Vino bianco 1 Vino bianco 2 Porto Moscato n media 0,018 0,011 TR% 90% 110% Procimidone CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,2 1,1 n media 0,036 0,011 0,027 TR% 60% 46% 120% Pyrimethanil CV r % CV R % PR CV R % HoR 1 1 0,9 n 8 9 media 0,057 0,033 TR% 106% 120% Carbendazim CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,5 1,7 n 8 7 media 0,067 0,042 TR% 84% 105% Fenbuconazole CV r % 6 5 CV R % PR CV R % HoR 1,9 2,0 n media 0,034 0,019 TR% 85% 95% Fenitrothion CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,2 1,4 13

14 TABELLA 2 (seguito): Valori di fedeltà Vino rosso 1 Vino rosso 2 Vino bianco 1 Vino bianco 2 Porto Moscato n 7 7 media 0,038 0,018 TR% 95% 90% Metrafenone CV r % 8 7 CV R % PR CV R % HoR 0,7 0,6 n media 0,017 0,009 TR% 106% 113% Penconazolo CV r % 8 8 CV R % PR CV R % HoR 1 1,2 n media 0,035 0,019 TR% 88% 95% Flusilazolo CV r % 6 9 CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,2 n 7 10 media 0,04 0,023 TR% 80% 92% Oxadixyl CV r % 10 5 CV R % PR CV R % HoR 0,7 1,1 n media 0,078 0,045 TR% 78% 90% Azoxystrobin CV r % 10 6 CV R % PR CV R % HoR 1,2 1,2 14

15 TABELLA 2 (seguito): Valori di fedeltà Vino rosso 1 Vino rosso 2 Vino bianco 1 Vino bianco 2 Porto Moscato n media 0,086 0,019 0,019 0,047 TR% 86% 94% Dimethomorph CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,4 1,5 1,2 n media 0,083 0,026 0,025 0,039 TR% 83% 96% 93% 78% Fenexamide CV r % CV R % PR CV R % HoR 1,3 0,6 0,7 0,7 15