Agricoltura. Studio dei lieviti Saccharomyces nei vini della Valtellina

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1 Agricoltura Studio dei lieviti Saccharomyces nei vini della Valtellina QUADERNI DELLA RICERCA N 55 GIUGNO

2 INDICE PRESENTAZIONE (V.Beccalossi) 3 PREMESSA 4 I LIEVITI 5 Lieviti autoctoni e tipicità Lieviti in enologia SCOPO DELLA RICERCA 7 PIANO DELLA RICERCA 7 ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE 8 Isolamento Identificazione degli isolati Caratterizzazione genotipica SPERIMENTAZIONE IN CANTINA 12 Preparazione delle precolture Inoculo VINIFICAZIONE E MONITORAGGIO DEI VINI 16 Determinazioni chimiche Determinazione microbiologiche Valutazione sensoriale CEPPI INDAGATI 17 Ceppi per vino Valtellina Superiore Ceppi per vino Sforzato CONSIDERAZIONI FINALI 25 APPENDICE 27 2

3 Presentazione La Direzione Generale Agricoltura della Regione Lombardia è da sempre impegnata nel valorizzare e nel promuovere le produzioni di qualità tipiche delle diverse aree del nostro territorio. Azione, questa, interpretata a pieno titolo anche attraverso il Piano regionale per la Ricerca e lo Sviluppo finanziato dalla Regione Lombardia, che, come nel caso dello studio qui presentato, consente di approfondire la conoscenza dei nostri prodotti e delle tecniche di produzione degli stessi per garantirne un costante incremento qualitativo. In particolare questa pubblicazione riporta, con un taglio divulgativo, l iter seguito in tre anni di ricerca per la caratterizzazione dei lieviti autoctoni della Valtellina e per la valutazione delle loro potenzialità enologiche, ai fini della tutela e della valorizzazione di quella realtà enologica, che per storia e tradizione costituisce un patrimonio ed un orgoglio per la Valtellina e per l intera Regione Lombardia. La tipicità dei vini di Valtellina, riconosciuta dalle diverse denominazioni e indicazioni di cui possono fregiarsi molti di essi, deriva dall interazione di diversi fattori che comprendono il clima, il suolo, il vitigno, l ambiente, le tecnologie di trasformazione delle uve e, tra queste ultime, il lievito impiegato come starter di fermentazione. Oggi le aziende vitivinicole valtellinesi utilizzano ceppi di lieviti isolati da territori e uve diverse dalle loro, svolgendo così un operazione tecnica che non valorizza appieno la qualità e l unicità dei vini valtellinesi. Proprio in tal senso è da recepire l utilità di questo progetto di ricerca, che in questi anni ha realizzato l isolamento dei ceppi di lieviti autoctoni, l indagine microbiologica e genetica, e la valutazione enologica in cantina. Viviana Beccalossi Vicepresidente della Regione Lombardia Assessore all Agricoltura 3

4 Premessa Il presente lavoro nasce dall esigenza di valorizzare la realtà enologica della provincia di Sondrio che ha una produzione vinicola sicuramente limitata se confrontata ad altre, ma ugualmente vocata e altresì capace di esaltare le potenzialità dei suoi prodotti ricercando nel forte legame tra vitigno, territorio e clima, il prestigio dei propri vini. La sperimentazione che qui viene illustrata aveva lo scopo di indagare la possibilità di selezionare, studiare e caratterizzare ceppi di lieviti, frutto di una selezione naturale e di un progressivo adattamento al clima ed alle condizioni del mezzo che hanno creato delle nicchie ecologiche peculiari in ogni tipo di vino. Nell ipotizzare un loro eventuale impiego nelle produzioni vinicole valtellinesi, la cui tecnologia non si avvale a tutt oggi di una microflora autoctona, si è pensato di fornire ai produttori valtellinesi uno strumento per migliorare la qualità del proprio vino, conservandone quei caratteri tipici che, in un mercato ristretto e saturo come è attualmente quello enologico, diventano fondamentali per garantire ogni forma di sopravvivenza concorrenziale. Il lavoro è stato svolto dalla Fondazione Fojanini di Studi Superiori di Sondrio in collaborazione con l Università di Verona, più precisamente con la sezione di Microbiologia degli Alimenti del Dipartimento Scientifico e Tecnologico. La fase iniziale, della durata di circa un anno, ha comportato l isolamento, la selezione e la caratterizzazione dei numerosi ceppi di lieviti individuati sulle uve dell intera area vitata valtellinese, senza limitazioni né di zona, né di altitudini, allestendo così una ricca collezione microbica. Gli anni successivi sono stati dedicati alla valutazione enologica e tecnologica di alcuni di questi ceppi. La possibilità di utilizzare quantitativi consistenti di uve e la presenza di una cantina attrezzata per sperimentazioni sia in microvinificazione che massive, hanno permesso di svolgere un lavoro completo in grado di riproporre le reali condizioni di un processo fermentativo, in sostanza una vera ricerca applicata. Il ritrovamento di numerosi ceppi di lieviti testimonia come si siano evolute specie con caratteri fenotipici e genotipici esclusivi delle uve valtellinesi e come tali in grado di esprimersi con le massime potenzialità. Claudio Introini Presidente Fondazione Fojanini di Studi Superiori 4

5 I lieviti Lieviti autoctoni e tipicità In Provincia di Sondrio gli ettari vitati sono circa 1250 per una produzione media annua intorno ai ql. Si tratta per lo più di vigneti ricavati in impervi terrazzamenti che se da una parte sono una risorsa paesaggistica e ambientale di raro splendore, con un importante significato storico e culturale (tanto da sostenere la candidatura nella lista propositiva italiana ai fini del riconoscimento da parte dell Unesco, di Patrimonio Mondiale) (Figg.1, 2), dall altra presentano una serie di difficoltà di lavorazione che rendono le operazioni faticose, poco meccanizzabili e conseguentemente onerose. Ma se così non fosse nemmeno la Chiavennasca, nome locale del Nebbiolo che adattandosi perfettamente alle caratteristiche pedoclimatiche della Valtellina, ne identifica la produzione e il prestigio, riuscirebbe ad esprimere in pienezza il proprio carattere (Fig.3). E dalla combinazione vitigno, territorio e clima che nascono quei vini di qualità ai quali ad oggi sono riconosciute le seguente denominazioni: (Fig.4 in appendice) Terrazze retiche IGT Rosso do Valtellina DOC Valtellina Superiore DOCG Valtellina Superiore DOCG sottozona Sassella Valtellina Superiore DOCG sottozona Inferno Valtellina Superiore DOCG sottozona Grumello Valtellina Superiore DOCG sottozona Valgella Valtellina Superiore DOCG sottozona Maroggia Sforzato di Valtellina DOCG Si tratta di produzioni specifiche, che devono mantenere il loro carattere, ed esprimere quelle peculiarità che estimatori e consumatori ricercano in esse. E soltanto attraverso l unicità del luogo d origine e di produzione che certe connotazioni possono e devono essere mantenute per non incorrere in quella standardizzazione di prodotto, in quella internazionalizzazione che non lascerebbe spazio a nessun riconoscimento di tipicità (e di unicità). Elemento chiave per presentare un prodotto come tipico è la presenza di un forte legame con il territorio e con le tradizioni che da esso ne derivano. Nello specifico delle produzioni enologiche il collegamento con il territorio può essere dettato da diversi fattori che comprendono il suolo, il vitigno, l ambiente e le tecnologie di trasformazione: queste ultime si esprimono attraverso l intervento di una microflora autoctona. I lieviti sono i principali protagonisti dell evoluzione del mosto in vino; il loro utilizzo non ha per effetto soltanto una trasformazione degli zuccheri in alcol, ma la formazione di una serie di sostanze che conferiscono al prodotto le sue caratteristiche sensoriali ed organolettiche. Da qui deriva l importanza del tipo di lievito utilizzato come starter della fermentazione alcolica. Fig. 1 Terrazzamenti nella zona di produzione del Sassella D.O.C.G. Fig. 2 Terrazzamenti nella zona di produzione del Grumello D.O.C.G. Fig. 3 Grappoli di Chiavennasca 5

6 I lieviti in enologia I lieviti enologici, organismi unicellulari responsabili della fermentazione alcolica dei mosti d uva, appartengono a diversi generi e specie e si differenziano per il loro potere fermentativo, che può essere elevato, medio o modesto. Nelle primissime fasi della trasformazione si ritrovano lieviti apiculati (Fig.5), appartenenti principalmente alla specie Hanseniaspora uvarum, con una bassa tolleranza a concentrazioni di alcol superiori a 4 5 gradi alcol, sensibili all anidride solforosa e come tali destinati a scomparire ben presto nel mosto in fermentazione. Il lievito indiscutibilmente più idoneo allo svolgimento della fermentazione alcolica, quello che veramente può essere considerato il fermento alcolico per definizione è Saccharomyces cerevisiae (Figg.6, 7). Presente in piccolissimo numero nell uva prende poi il sopravvento su tutte le altre specie. E il lievito per definizione, quello del pane, della birra e della stragrande maggioranza delle bevande alcoliche, il più vigoroso, il più alcoltollerante, il più resistente all anidride solforosa, quello che, a parità di zucchero fermentato, produce la maggiore quantità di etanolo e la minor quantità di prodotti indesiderati. I ceppi appartenenti a questa specie determinano quindi fermentazioni alcoliche più pulite ed inoltre, avendo in genere un basso potere schiumogeno, sedimentando velocemente e non producendo acido solfidrico né anidride solforosa sono da considerarsi di grande interesse applicativo. Molti sono i fattori che influenzano la moltiplicazione dei lieviti: la temperatura, le sostanze nutritive presenti, l ossigeno, l alcol, il grado di limpidezza del mosto e altri ancora. Accanto al ruolo primario dei lieviti nel catalizzare la rapida, completa ed efficiente conversione dello zucchero in alcool, senza lo sviluppo di cattivi odori (offflavours), le colture di lievito hanno effetti nella formazione della componente aromatica e polifenolica del prodotto finale in quanto, tramite azioni enzimatiche, riescono a liberare o assorbire determinate sostanze in grado di influire positivamente o negativamente sulle caratteristiche del vino, oltre che sulla sua conservazione. Fig. 5 Immagine di lieviti apiculati Fig. 6 Immagine di lieviti Saccharomyces cerevisiae Fig. 7 Immagine di lieviti Saccharomyces cerevisiae 6

7 Scopo della ricerca E scientificamente accertato che i lieviti che dominano la fermentazione alcolica contribuiscono in modo determinante all espressione delle caratteristiche aromatiche e cromatiche che originano dal vitigno, intervenendo con attività enzimatiche più o meno spiccate e con azioni adsorbenti più o meno intense, che possono costituire elementi di discriminazione tra un ceppo e l altro. A tutt oggi la mancanza di preparati di lieviti autoctoni, espressione della realtà enologica valtellinese, obbliga le cantine a ricorrere all impiego di ceppi isolati da territori e da uve completamente diversi, penalizzando le produzioni nell espressione delle proprie potenzialità e delle migliori caratteristiche qualitative e rischiando un appiattimento di gusto ed una eccessiva standardizzazione del prodotto. La sperimentazione si è posta quindi l obiettivo di selezionare una microflora di lieviti autoctoni presenti sulle uve di Valtellina per poterli mettere a disposizione dei produttori. Questo potrebbe servire come impulso per la valorizzazione e l innalzamento delle produzioni vitivinicole valtellinesi, oltre che come punto di partenza per il riconoscimento di una tipicità di prodotto. Piano della ricerca Il progetto di durata triennale ( ) è stato svolto dalla Fondazione Fojanini e dal Dipartimento Scientifico e Tecnologico, sezione di Microbiologia degli Alimenti, dell Università di Verona. La tipologia di lavoro ha richiesto inizialmente pratiche microbiologiche e genetiche e successivamente applicazioni tecnologiche ed enologiche. Viste le differenti competenze le prime sono state eseguite presso l Università di Verona, mentre la parte più applicativa è stata condotta presso la cantina della Fondazione Fojanini e in alcune aziende vinicole della provincia di Sondrio. 7

8 Isolamento e caratterizzazione Isolamento I ceppi di lievito sono stati isolati nel corso delle vendemmie , quindi anche in annate precedenti l inizio della sperimentazione, prelevandoli da uve di 25 vigneti dislocati lungo tutta la valle e a differenti altitudini, in modo da avere nel complesso una rappresentazione delle svariate realtà pedoclimatiche, costituenti il comprensorio di produzione. I grappoli d uva sono stati posti in sacchetti di plastica e pigiati manualmente: 100 ml di mosto sono stati successivamente versati in beute sterili da 125 ml dove si è sviluppata la fermentazione alcolica al termine della quale si è proceduto all isolamento dei ceppi. Più precisamente si è operato nel modo seguente: sui campioni di mosto è stato stratificato olio enologico per permettere la fuoriuscita della CO 2 e il trattenimento di tutti gli altri composti volatili. Le beute sono state chiuse con un tappo di ovatta e poste per circa 2025 giorni a temperatura ambiente, misurando giornalmente la diminuzione del loro peso. Quando questo si è stabilizzato sono stati prelevati campioni che, previa diluizione, sono stati seminati su terreno YPD agarizzato (Appendice) ed incubati a 28 C per 34 giorni. Da ciascuna piastra sono state isolate 2 colonie; la scelta si è basata sulla morfologia globale delle colonie e su quella delle singole cellule osservate al microscopio, cercando ovviamente di individuare quelle con caratteristiche riconducibili al genere Saccharomyces. I ceppi isolati sono stati conservati a 4 C nei terreni di sviluppo addizionati con glicerolo al 50%. Sempre seguendo la procedura sopra descritta, sono stati isolati alcuni ceppi anche da uve in appassimento e destinate alla produzione del vino Sforzato, con l intento di selezionare in tal modo ceppi capaci di fermentare anche in condizioni difficili, a basse temperature e su masse con elevata concentrazione in zuccheri. Globalmente sono stati isolati 380 ceppi di lieviti suddivisi nelle annate come riportato nella tabella 1: Tab. 1 Ceppi isolati per Valtellina Superiore e sforzato ripartiti nelle diverse annate Vendemmia 1998 Vendemmia 2001 Vendemmia 2002 N isolati da mosto per vini Valtellina, Valtellina Superiore N isolati da mosto per vini Sforzato Identificazione degli isolati Fig. 8 Immagine di colonie umbonate di Saccharomyces cerevisiae su WL nutrient agar. Fig. 9 Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata) e Saccharomyces cerevisiae su terreno WL nutrient agar. Sui ceppi isolati nella vendemmia 1998, quindi per un totale di 170 ceppi sono stati condotti i test classici d identificazione allo scopo di individuare quelli con caratteri tecnologici idonei. Ritenendo che 170 ceppi costituissero un numero ampio e sufficientemente eterogeneo, non sono stati eseguiti approfondimenti sui lieviti isolati negli anni successivi, lieviti attualmente conservati allo stato congelato in un mezzo opportuno presso la Fondazione Fojanini. I ceppi isolati sono stati identificati mediante i seguenti saggi: Crescita su terreni specifici. Tramite i terreni di coltura disponibili in commercio, WL Nutrient Agar e Agar Lisina (Appendice), è stato possibile eliminare le colonie con morfologia diversa da quella del genere Saccharomyces. I criteri utilizzati sono stati il colore e la morfologia della colonie cresciute su terreno WL e la capacità di utilizzare l amminoacido lisina e quindi di crescere su terreno Agar Lisina (Figg.8, 9). Modalità di crescita. La maggior parte dei lieviti ha presentato sviluppo a cellule disperse, prerogativa tipica della specie Saccharomyces cerevisiae. Capacità di produrre spore. Soltanto i lieviti sporigeni sono di interesse per la fermentazione alcolica. I ceppi isolati sono stati quindi posti in condizioni stressanti, mediante la semina in terreno contenente ace 8

9 tato di sodio (Appendice), generalmente utilizzato per provocare la sporificazione. La successiva osservazione al microscopio ha messo in evidenza che la maggior parte dei lieviti selezionati sporula, moltiplicandosi per gemmazione attraverso aschi contenenti spore globose a parete liscia. Solo il 7% dei ceppi analizzati non possedeva questa caratteristica e per questo sono stati eliminati. Resistenza a diverse concentrazioni di SO 2. La resistenza dei lieviti a diverse concentrazioni di SO 2 è stata valutata in piastra con la tecnica di replica plating, che prevede l inoculo di lieviti in piastre di terreno agarizzato contenenti diverse concentrazioni di SO 2, da 80 ppm a 200 ppm. Sono stati presi in considerazione solo i lieviti che hanno tollerato le più alte concentrazioni di SO 2 formando colonie di dimensioni superiori a 0,30,4 mm di diametro. La prova di resistenza alla SO 2 ha permesso l eliminazione di un numero elevato di ceppi: su 160 ceppi saggiati, 54 sono risultati incapaci di crescere in presenza di 200 ppm di SO 2. Rilevazione profilo killer. Alcuni ceppi di Saccharomyces cerevisiae denominati killer sono dotati di una proteina (detta appunto proteina killer) capace di inibire lo sviluppo di altri ceppi della stessa specie provocandone la morte cellulare. La rilevazione di questa caratteristica è stata eseguita utilizzando il seguente protocollo: su terreno YPD e dopo 3 giorni a 28 C sono state fatte sviluppare sia la coltura del ceppo sensibile sia quelle di cui rilevare il profilo killer. Il ceppo sensibile S (S. cerevisiae DBVPG 6500) è stato centrifugato e risospeso in acqua distillata sterile per avere una concentrazione di circa 10 5 ufc/ml. Nella rilevazione del profilo killer viene utilizzato il terreno Maltagar (Difco) tamponato a ph 4,5. Sono stati seminati spot di 5 µl di precoltura, lasciando la piastra in incubazione a 28 C per 35 giorni. E stato in seguito valutato il profilo killer dei ceppi in esame mediante la presenza o meno della zona di inibizione presente intorno alle colonie dei ceppi killer. Oltre ai ceppi da testare sono stati inoculati su ogni piastra anche ceppi di lievito denominati K1 (S. cerevisiae DBVPG637), K2 (S. cerevisiae DBVPG 6499) K1K2 (S. cerevisiae DBVPG 6567), come controllo positivo. L analisi del profilo killer ha messo in evidenza la presenza di 14 ceppi di lieviti con questo carattere, che sono quindi stati eliminati. Fermentazione zuccheri. Dalla capacità o meno di utilizzare alcuni zuccheri è possibile discriminare i ceppi tra le diverse specie di lieviti di interesse enologico. In terreno base sterile (Appendice), addizionato con una soluzione sterile (1% v/v) rispettivamente di glucosio, maltosio, saccarosio, galattosio e melibiosio e distribuito in provette di vetro da 10 ml con campanella di Durhan sono stati inoculati i ceppi di lieviti in esame. Dopo l incubazione a 28 C per 5 giorni sono stati eliminati 36 ceppi perché non in grado di fermentare saccarosio e maltosio quindi non riconducibili al genere Saccharomyces. Crescita a differenti temperature. I ceppi sono stati incubati alle temperature di 34 C e 37 C. Con questo test è stato possibile discriminare le specie S. cerevisiae da S. bayanus essendo quest ultima incapace di crescere a 37 C. Test del vigore fermentativo. Il vigore fermentativo, altro importante carattere tecnologico nella selezione, tiene conto della prontezza con la quale un ceppo di lievito dà inizio alla fermentazione dei substrati liquidi e della rapidità con cui la realizza. La vigoria fermentativa posseduta da un lievito è sicuramente uno dei parametri positivi da considerare per l utilizzo di questo lievito come starter. Per valutare il vigore fermentativo 3 ml di coltura sviluppata per 3 giorni a 28 C in mosto pastorizzato di uva Chiavennasca, sono stati inoculati in beute di vetro da 125 ml, contenenti circa 100 ml di mosto con bucce, sempre di varietà Chiavennasca non pastorizzato. Le beute inoculate, chiuse con tappi di silicone forati, sono state incubate a temperatura ambiente (2025 C) provvedendo ogni giorno ad una agitazione manuale al fine di permettere un migliore rilascio di CO 2 e soprattutto di tutti quei composti, fenolici e tannici, importanti per le caratteristiche sensoriali del vino. La pesatura giornaliera delle beute con una bilancia analitica, ha consentito una valutazione dell andamento 9

10 della fermentazione alcolica (in Appendice è riportata la formula per il calcolo del calo di peso). Le oscillazioni del calo di peso, tra i vari ceppi, sono risultate minime: non sono state riscontrate, infatti, grandi differenze, permettendo così di affermare che le loro cinetiche di fermentazione non si discostano di molto da quella del ceppo commerciale e che i ceppi sono tra loro molto simili. Produzione di idrogeno solforato. La capacità dei ceppi di produrre H 2 S viene rilevata attraverso il cambiamento di colore di una cartina di acetato di piombo posta all interno della provetta. Poiché l H 2 S influisce sulla qualità del vino, sono preferibili quei ceppi che la producono, ma in piccole quantità. L attenzione è stata rivolta a quei lieviti la cui produzione risulta essere bassa o media. Caratterizzazione genotipica Fig. 10 Profilo del cariotipo di alcuni ceppi indagati nelle vinificazioni. La caratterizzazione genotipica dei lieviti selezionati è stata eseguita tramite la tecnica dell elettroforesi in campo pulsato PFGE (Appendice) che consiste nel sottoporre il DNA, durante il processo elettroforetico, ad un campo elettrico pulsato, che alternativamente cambia di intensità e direzione. La presenza di un campo elettrico di questo tipo genera un orientamento delle molecole di DNA in base alla loro dimensione e questo consente di ottenere la separazione dei frammenti più grandi. Si arriva così al cariotipo elettroforetico, che permette il confronto tra differenti ceppi e differenti specie. Il DNA dei diversi ceppi è stato preparato in blocchetti d agarosio secondo il protocollo d analisi del cariotipo dei lieviti descritto da Southern et al. e modificato da Scwartz e Cantor con l aggiunta di proteinasi K (Fig.10). Al termine dei saggi dei 170 ceppi indagati, 17 hanno mostrato caratteristiche enologiche e tecnologiche interessanti che sono riassunte nelle tabelle 2, 3a e 3b. Tab. 2 Fasi di isolamento, caratterizzazione e identificazione dei lieviti saggiati e risultato finale dello studio ISOLAMENTO IDENTIFICAZIONE Terreni selettivi Sporificazione CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA Resistenza SO2 Profilo killer Prove di fermentazione Crescita a 34 e 37 C Vigore fermentativo Produzione di H2S Analisi sensoriale Prove di fermentazione CARATTERIZZAZIONE GENOTIPICA 17 10

11 Tab. 3a Tabella riassuntiva delle caratteristiche dei 17 ceppi di lieviti selezionati tramite test d identificazione. CARATTERI LIEVITI 21A/1 21A/2 28A/2 39A/1 44C/1 47A/1 SF2A/2 SF3D/2 ST3 Sporificazione Gemmazione Morfologia cellulare Crescita in YPD: Aspetto Potere schiumogeno Crescita in WL: Aspetto Crescita su AgarLisina Crescita a 34 C 37 C Fermentazione Glucosio Saccarosio Maltosio Melibiosio Galattosio Lattosio Trealosio Raffinosio ovali medie ovali medie ovali medie ovali ovali tonde piccole ovali medie ovali medie ovali medie chiaro torbido chiaro chiaro chiaro torbido chiaro chiaro torbido verde piccola ovali Profilo killer Resistenza SO 2 (ppm) Produzione H 2 S media alta media alta media alta alta poca poca % Calo in Peso 7,98% 8,10% 8,14% 7,68% 8,04% 8,44% 8,22% 8,54% 8,0% Qualità sensoriali B B O B O O O O O Tab. 3b Tabella riassuntiva delle caratteristiche dei 17 ceppi di lieviti selezionati tramite test d identificazione. CARATTERI LIEVITI 1A/1 3A/1 4C/2 15A/1 15B/1 19A/1 19A/2 19B/2 19C/1 Sporificazione Gemmazione Morfologia cellulare Crescita in YPD: Aspetto Potere schiumogeno Ovali tonde ovali ovali tonde ovali ovali ovali ovali ovali ovali chiaro torbido chiaro chiaro chiaro torbido chiaro chiaro torbido Crescita in WL: Aspetto verde piccola Crescita su Agar Lisina Crescita a 34 C 37 C Fermentazione Glucosio Saccarosio Maltosio Melibiosio Galattosio Lattosio Trealosio Raffinosio Profilo killer Resistenza SO 2 (ppm) Produzione H 2 S media media media poca poca media media medio alta % Calo in Peso 8,4% 8,01% 7,85% 8,37% 8,33% 8,14% 8,04% 8,2% 8,3% Qualità sensoriali O B O B O O B O O 11

12 Sperimentazione in cantina La parte più consistente della ricerca ha riguardato lo studio delle doti fermentative dei ceppi isolati e dei loro caratteri di qualità. Per conoscere a pieno un ceppo, per indagare la sua capacità a dare fermentazioni regolari, a produrre maggiori o minori quantità di composti secondari, a interagire in un modo piuttosto che in un altro sul colore dei vini, a sviluppare particolari aromi, è necessario saggiarlo nelle condizioni reali di un processo fermentativo. Soltanto così si possono realmente accertare queste attitudini e conoscere le prestazioni di ciascun ceppo. La sperimentazione è stata eseguita inizialmente presso la cantina della Fondazione Fojanini su quantitativi ridotti di mosto, (microvinificazioni di circa 1 hl), poi su quantitativi consistenti (circa 30 hl). Infine alcune prove sono state condotte in 4 cantine valtellinesi ciascuna delle quali ha messo a disposizione circa 6070 hl di mosto. Il protocollo utilizzato ha previsto in tutti i casi: monitoraggio delle fermentazioni analisi chimicoanalitiche sui vini valutazione sensoriale Fig. 11 Lieviti inoculati in brodo colturale Fig. 12 mosto sterilizzato in fermentazione Fig. 13 Fase di pastorizzazione del mosto Fig. 14 Fase di pastorizzazione del mosto Preparazione delle precolture Le precolture sono colture pure di lievito selezionato che per la loro purezza e per la loro carica presentano un elevata probabilità di colonizzazione della massa a cui vengono aggiunte, a scapito dello sviluppo di possibili microrganismi contaminanti. La preparazione delle precolture ha previsto una prima fase di attivazione in laboratorio e una successiva di cantina, secondo lo schema qui riportato: 12

13 LABORATORIO coltura congelata Rivitalizzata tramite inoculo in provette contenenti terreno YPD sterile; si ottiene: brodo di coltura sterile Dopo 2 giorni la massa pienamente colonizzata, viene riversata nel: È stato utilizzato mosto fresco, filtrato e sterilizzato in autoclave sul quale è stata determinata la concentrazione iniziale di zuccheri. Ulteriore determinazione degli zuccheri mosto sterile Dopo 23 giorni la massa in piena fermentazione viene riversata nel: CANTINA mosto pastorizzato Dopo 23 giorni con la massa in piena fermentazione viene effettuato: Ulteriore determinazione degli zuccheri inoculo massa uva 13

14 Fig. 15 Mosto pastorizzato Piuttosto impegnativa è stata la fase di cantina per la difficoltà di manipolare elevati quantitativi di mosto in un ambiente non sterile. La necessità di operare in idonee condizioni ha portato ad adottare tutti gli accorgimenti possibili al fine di minimizzare il rischio di contaminazione. Gli operatori di cantina sono stati adeguatamente istruiti ed hanno operato in modo da ottenere le massime condizioni igieniche dei contenitori e delle attrezzature tramite trattamento degli stessi con vapore. Anche nelle microvinificazioni le uve, sempre pigiate e diraspate, sono state poste in tini di fermentazione, con l accortezza di omogeneizzare la massa tra un tino e l altro, quindi inoculate con il rispettivo quantitativo di mosto. Inoculo Fig. 16 Caricamento serbatoi per microvinificazioni È stato fatto su mosto fresco di pigiatura al momento della massima intensità fermentativa del mosto pastorizzato. Le fasi successive sono state trattate come una comune fermentazione per cui sono state effettuate le normali aggiunte di metabisolfito di potassio e di attivatori, follature e rimontaggi secondo i quantitativi e i tempi previsti dal protocollo interno di fermentazione. In tabella 4 sono riportate le modalità di inoculo per ciascuna tipologia di vinificazione eseguita: microvinificazioni, vinificazioni di massa e microvinificazione dello Sforzato. 14

15 Tab. 4 Schema delle fasi di preparazione delle precolture adottato nelle differenti prove MICROVINIFICAZIONE ceppi Valtellina Superiore VINIFICAZIONE MASSE ceppi Valtellina Superiore MICROVINIFICAZIONE ceppi Sforzato Ceppo starter Ceppo starter Ceppo starter 10 ml brodo YPD 500 ml brodo YPD 10 ml brodo YPD 1 l mosto sterile 4 l mosto sterile 0,51 l mosto sterile 10 l mosto pastorizzato 40 l mosto pastorizzato 2 l mosto pastorizzato 1 ql uve pigiate e diraspate 400 l mosto non pastorizzato 50 kg uve pigiate e diraspate 6070 ql uve pigiate e diraspate 15

16 Vinificazione e monitoraggio dei vini La sperimentazione è proseguita monitorando i principali parametri chimici, microbiologici e sensoriali prima sui mosti, durante le fermentazione, e poi sui vini in epoche precise come il travaso e l imbottigliamento. Determinazioni chimiche Le determinazioni chimiche sono state eseguite utilizzando le metodiche classiche ed hanno riguardato il monitoraggio di più parametri: ph, acidità totale, acidità volatile, zuccheri, grado alcolico, acido malico, anidride solforosa, composti polifenolici e aromatici (Appendice). Determinazioni microbiologiche Ad inizio, metà e fine fermentazione, è stata eseguita una conta dei lieviti in terreno YPD agarizzato per osservare l evoluzione della microflora lievitiforme e stabilirne la carica vitale. Alcune colonie, prelevate e purificate tramite striscio, sono state sottoposte a caratterizzazione genotipica mediante PFGE (Fig.17) allo scopo di verificare se il ceppo inoculato fosse stato il vero responsabile del processo fermentativo. Fig. 17 Profilo del cariotipo dei ceppi di lievito utilizzati nelle prove di vinificazione, effettuata in triplice replica. (1a) 3A/1 A, (2a) 3A/1 B, (3a) 3A/1 C, (4a) 15B/1 A, (5a) 15B/1 B, (6a) 15/B 1 C, (7a) ST3 A, (8a) ST3 B, (9a) ST3 C (1b) SF2 A/2 A, (2b) SF2 A/2 B, (3b) SF2 A/2 C, (4b) SF3 D/2 A, (5b) SF3 D/2 B, (6b) SF3 D/2 C, (7b) ST3 A, (8b) ST3 B, (9b) ST3 C Le analisi microbiologiche hanno confermato questa ipotesi, dimostrando così che i ceppi inoculati sono in grado di minimizzare lo sviluppo dei microrganismi contaminanti. Valutazione sensoriale I vini prodotti sono stati sottoposti ad un giudizio sensoriale da parte di un panel addestrato, costituito da una decina di degustatori. Sono stati utilizzati due metodi di valutazione: quello di preferenza e quello descrittivo. Con il primo è stato chiesto ai degustatori di fare una valutazione complessiva dei campioni presentati e di ordinarli secondo la preferenza, dal più gradito al meno gradito. Con il procedimento descrittivo è stata eseguita una valutazione visiva, olfattiva e gustativa tramite l assegnazione di un punteggio corrispondente all intensità di ciascun descrittore percepito, delineando in tal modo il profilo di ogni campione. La degustazione è stata eseguita nei locali della Fondazione Fojanini dove erano allestite cabine idonee allo scopo. 16

17 Ceppi indagati Ceppi per vino Valtellina Superiore Fig. 18 Ceppo 3A/1; popolazione lievitiforme e consumo di zuccheri nella vinificazione anno (30hl) Fig. 19 Ceppo 3A/1; popolazione lievitiforme e consumo di zuccheri nella vinificazione anno (70hl, prova B) Fig. 20 Ceppo 3A/1; popolazione lievitiforme e consumo di zuccheri nella vinificazione anno (70hl, prova N) Dalla fase preliminare di caratterizzazione tecnologica e genotipica sono stati selezionati, secondo i criteri illustrati precedentemente, 17 ceppi che presentavano i migliori caratteri tecnologici. Di questi ne sono stati scelti inizialmente 2, denominati 3A/1 e 15B/1 (Tab.3a e 3b). Il ceppo 3A/1 ha mostrato colonie su terreno YPD di colore bianco torbido, mentre chiaro era l aspetto delle colonie del ceppo 15B/1. Su terreno WL le colonie del ceppo 3A/1 risultavano verdine e umbonate, mentre verdi e piccole si presentavano quelle del ceppo 15B/1. Entrambi hanno mostrato crescita a 34 C e 37 C, resistenza a 200 ppm di SO 2, capacità di fermentare glucosio, saccarosio, maltosio, galattosio e raffinosio ma non melibiosio, lattosio e trealosio. Media la produzione di H 2 S per il ceppo 3A/1, ridotta quella del ceppo 15B/1. Questi due ceppi sono stati testati nell anno in prove di microvinificazione su 1 hl, condotte in triplo, confrontando i ceppi autoctoni con un ceppo commerciale normalmente usato nelle cantine della Fondazione Fojanini (Tab. 5). In una seconda sperimentazione sono state approfondite le caratteristiche del ceppo 3A/1 utilizzandolo in prove di fermentazione di 30 hl, in questo caso in doppio e sempre in confronto con il ceppo di lievito commerciale ST (Tab.6). La sperimentazione del ceppo 3A/1 è continuata nell anno con la vinificazioni in quattro cantine private che hanno messo a disposizione quantità di mosto intorno ai 70 hl. Nelle figg. 19 e 20 sono riportati i grafici dello sviluppo microbico delle prove condotte in due delle cantine, prove denominate B ed N. Parallelamente è stata studiata la capacità fermentativa del ceppo 15B/1 tramite prove in microvinificazioni utilizzando come confronto altri ceppi di lieviti sia autoctoni, che commerciali (Tab.7) In tutte le prove, allo scopo di verificare se il ceppo inoculato fosse stato il vero responsabile del processo fermentativo, sono stati fatti prelievi ed i lieviti isolati dai mosti sono stati caratterizzati geneticamente trami 17

18 te la tecnica della PFGE (Fig.17). Il cariotipo di ogni ceppo di lievito proveniente dai tini è stato comparato con il cariotipo del ceppo utilizzato nell inoculo; il confronto ha sempre fornito il medesimo tracciato elettroforetico dimostrando che i ceppi inoculati hanno dominato il processo fermentativo. I ceppi di lievito in esame hanno sempre mostrato una regolare crescita microbica che ha raggiunto a metà fermentazione valori compresi tra i 10 5 ufc/ml e i 10 9 ufc/ml (Figg. 18, 19, 20, 21, 22). Durante la fermentazione, oltre allo sviluppo microbico ed al consumo di zuccheri, sono stati monitorati i principali parametri chimici: ph, acidità totale, acidità volatile, acido malico, anidride solforosa libera e totale, polifenoli totali, antociani. In tutte le prove si è avuto un regolare andamento fermentativo che, dal momento dell inoculo della massa pastorizzata, ha dato immediatamente inizio alla trasformazione alcolica senza mostrare ritardi o interruzioni, portando sempre ad un completo consumo degli zuccheri. Da sottolineare che con i ceppi selezionati le fermentazioni hanno avuto un avvio più repentino ed in generale sono risultate più tumultuose di quelle ottenute con i ceppi commerciali. Fig. 21 Popolazione lievitiforme nella microvinificazione anno (C è il ceppo di lievito commerciale usato come confronto; gli altri sono ceppi di lieviti autoctoni) Fig. 22 Popolazione lievitiforme nella microvinificazione anno (C1, C2, C3, C4 sono diversi ceppi di lieviti commerciali usati come confronto) Questa differenza è risultata evidente soprattutto nelle microvinificazione. I parametri chimici di acidità totale, acidità volatile, ph presentavano in tutti i casi valori nella norma e del tutto simili a quelli registrati nelle prove vinificate con ceppi commerciali. 18

19 Tab. 5 Fermentazione delle prove di microvinificazione anno (sono riportati valori medi e deviazione standard) 28ott 30ott 01nov 04nov 06nov 3A/1 ST 3A/1 ST 3A/1 ST 3A/1 ST 3A/1 ST zucchero (g/100ml) 19,60 ± 0,17 20,32 ± 1,78 10,30 ± 1,31 11,96 ± 0,46 3,3 ± 0,56 3,63 ± 0,09 0,3 ± 0,04 0,26 ± 0,03 0,2 ± 0,03 0,25 ± 0,03 alcol svolto (% vol.) nd nd 5,8 ± 0,46 4,90 ± 0,26 10,6 ± 0,39 10,03 ± 0,25 12,0 ± 0,02 12,19 ± 0,05 12,3 ± 0,23 12,38 ± 0,05 acidità totale (g /l) 12,40 ± 0,36 12,50 ± 0,06 11,1 ± 0,33 11,70 ± 0,30 10,8 ± 0,10 11,40 ± 0,26 10,4 ± 0,28 10,70 ± 0,05 10,5± 0,06 10,70± 0,05 ph 3,16 ± 0,01 3,15 ± 0,01 3,09 ± 0,02 3,05 ± 0,02 3,21 ± 0,05 3,15 ± 0,01 3,22 ± 0,04 3,19 ± 0,01 3,17 ± 0,01 3,17 ± 0,01 temperatura cantina temperatura vasca nd nd 18,3 ± 0,98 19,2 ± 0,20 17,2 ± 0,53 18,6 ± 0,53 14,4 ± 0,35 14,93 ± 0,12 nd nd Tab. 6 Fermentazione delle prove anno (30 hl) 09ott 10ott 12ott 13ott 14ott 15ott 3A1/a 3A1/ b ST/a ST/b 3A1/ a 3A1/ b ST/a ST/b 3A1/a 3A1/ b ST/a ST/b 3A1/a 3A1/ b ST/a ST/b 3A1/a 3A1/ b ST/a ST/b 3A1/a 3A/ 1b ST/a ST/b zucchero ( Brix) 18,1 20,5 18, ,1 16,8 14,8 10 9,3 10,8 8,8 8 7,7 8,9 7,7 7,06 7,7 7,8 7,5 7,06 7,4 7,5 7,7 alcol svolto (%vol.) 9,86 10,8 9, ,3 13,1 11,3 12,3 13,2 13,6 12,8 12,7 acidità totale (g/l) 6,05 5,1 5,2 6,5 6,03 6,2 6,2 6,6 6,02 6,2 6,7 6,2 6,02 6,1 6,7 6,85 6,08 7,2 7,5 7,1 7,05 7,5 7,2 7,3 ph 3,61 3,9 3,43 3,44 3,54 3,47 3,51 3,52 3,59 3,48 3,53 3,55 3,51 3,35 3,4 3,38 3,47 3,44 3,46 3,47 acidità volatile (g/l) 0,12 0,27 0,18 0,12 0,26 0,32 0,39 0,39 SO 2 libera (mg/l) 19, ,6 20,8 33,6 27, ,4 SO 2 totale (mg/l) 30 30, polifenoli totali (mg/l catechina) antociani totali (mg/l) 47,3 31,9 27, flavonoidi totali (mg/l) intensità 0,24 0,29 0,13 0,63 0,43 0,4 0,34 0,43 0,4 0,47 0,5 0,43 tonalità 0,9 1,18 1,06 1,24 0,65 0,66 0,65 0,65 0,71 0,69 0,67 0,67 Tab. 7 Fermentazione delle prove di microvinificazione anno (sono riportati valori medi e deviazioni standard) inizio fermentazione fine fermentazione 3A/1 15B/1 C1 C2 C3 C4 3A/1 15B/1 C1 C2 C3 C4 zucchero ( Brix) 21,57±0,31 21,57±0,40 20,93±1,34 21,67±0,45 21,3±0,26 20,7±0,87 7,13±0,06 7,47±0,55 11,80±1,56 7,17±0,11 7,1±0,2 8,83±1,19 acidità totale (g/l) 6,77±0,06 7,03±0,29 6,87±0,25 6,73±0,12 7±0,2 6,83±0,32 7,07 ±0,12 7,23±0,15 7,87±0,06 7,53±0,12 7,10±0,26 7,87±0,35 ph 3,23±0,01 3,21±0,02 3,22 ± 0,04 3,23±0,01 3,18±0,01 3,22±0,05 3,40±0,01 3,37±0,04 3,40 ± 0,03 3,47±0,04 3,43±0,03 3,33±0,04 acido malico (g/l) 3,64 ± 0,45 3,75 ± 0,62 4,17 ± 0,86 3,57 ± 0,46 4,08 ± 0,41 3,79 ± 0,89 grado alcool (%vol.) 12,51± 0,11 12,46± 0,35 12,11± 0,19 12,22±0,27 12,17± 0,18 11,69± 0,51 acidità volatile (g/l) 0,32 ± 0,02 0,32 ± 0,03 0,33 ± 0,03 0,34 ± 0,03 0,34 ± 0,02 0,33 ± 0,03 polifenoli totali (mg/l cat.) 1119, , , , , ,18 19

20 In corrispondenza dei travasi è stato nuovamente determinato il quadro chimico ed è stata eseguita una valutazione sensoriale. I vini prodotti con i ceppi autoctoni presentano un quadro chimico d insieme simile e sovrapponibile ai vini prodotti con i ceppi commerciali. Alcune differenze si manifestano nell aspetto polifenolico per cui nelle prove con i ceppi autoctoni, sia in vasche che in microvinificazione, si registrano valori totali di polifenoli, antociani e flavonoidi sempre inferiori a quelli determinati nei vini prodotti con i lieviti commerciali (Tab. 8, 9 10, 11, 12 e fig. 23a e 23b). Tab. 8 Parametri chimici dei vini della microvinificazione anno ; (i dati si riferiscono al mese di marzo 2003) 3A/1 15B/1 ST 3 ph 3,17 ± 0,01 3,19 ± 0,02 3,17 ± 0,01 acidità totale (g/l) 10,47 ± 0,06 10,13 ± 0,06 10,70 ± 0,05 acidità volatile (g/l) 0,27 ± 0,00 0,23 ± 0,02 0,18 ± 0,00 acidità fissa (g/l) 10,16 ± 0,00 9,85 ± 0,05 10,47 ± 0,16 grado alcool (% vol.) 12,31 ± 0,23 12,56 ± 0,15 12,38 ± 0,05 zuccheri (g/100 ml) 0,24 ± 0,03 0,26 ± 0,01 0,25 ± 0,06 acido malico (g/l) 5,93 ± 0,40 6,47 ± 0,28 6,08 ± 0,03 acido lattico (g/l) 0,26 ± 0,01 0,28 ± 0,02 0,13 ± 0,01 glicerolo (g/l) 6,37 ± 0,62 6,45 ± 0,07 6,36 ± 0,33 Tab. 9 Parametri chimici dei vini della sperimentazione (30 hl); (i dati si riferiscono al mese di marzo 2004) 3A1/a 3A1/b ST/a ST/b zucchero ( Brix) 7,7 7,3 7,4 7,4 grado alcool (%vol.) 13,21 13,65 12,83 12,65 acidità totale (g/l) 6,50 6,00 5,60 6,70 ph 3,48 3,40 3,51 3,50 acido malico (g/l) 0,05 0,33 0,04 0,03 acidità volatile (g/l) 0,54 0,33 0,42 0,51 glicerolo (g/l) 5,51 5,90 6,05 5,95 polifenoli (mg/l catechina) 2680, , , ,62 antociani (mg/l) 62,62 82,19 120,39 132,31 flavonoidi (mg/l) 966, , , ,09 Tab. 10 Parametri chimici dei vini della sperimentazione (70 hl); i dati si riferiscono al mese di ottobre (C è il commerciale usato come confronto) prova B prova N 3A/1 C 3A/1 C acidità totale (g/l) 5,32 5,76 5,52 5,61 acidità volatile (g/l) 0,45 0,45 0,81 0,69 ph 3,56 3,49 3,71 3,58 grado alcool (%vol.) 12,22 11,84 12,65 12,34 SO 2 libera (mg/l) SO 2 totale (mg/l) estratto secco (g/l) 25,5 26,45 27,9 26,6 acido malico (g/l) 0,06 0,16 0,06 0,28 polifenoli totali (mg/l catechina) antociani totali (mg/l) flavonoidi totali (mg/l) flavonoidi non antocianici (mg/l) tonalità 0,901 0,897 1,044 0,938 intensità 0,437 0,46 0,481 0,483 20

21 Tab. 11 Parametri chimici dei vini della microvinificazione dell anno ; i dati si riferiscono al mese di giugno 2005 (sono riportati valori medi e deviazione standard) C1 C2 C3 C4 3A/1 15B/1 acidità totale (g/l) 7,89 ± ,31 ± 0,51 5,62 ± 0,10 7,05 ± 0,68 6,35 ± 0,04 7,06 ± 0,11 ph 3,45 ± 0,03 3,59 ± 0,04 3,59 ± 0,02 3,49 ± 0,13 3,51 ± 0,02 3,44 ± 0,05 grado alcool (%vol.) 12,10 12,22 12,17 11,69 12,50 12,46 SO 2 libera (mg/l) 21,6 20,0 18,3 18,0 15,3 17,6 SO 2 totale (mg/l) 61,3 55,0 46,0 46,3 42,0 43,6 estratto secco (g/l) 27,37 ± 0,25 24,43 ± 0,90 22,77 ± 1,20 24,50 ± 0,40 22,57 ± 1,82 24,13 ± 0,75 acido malico (g/l) 3,25 ± 0,33 2,30 ± 1,30 0,64 ± 0,31 1,88 ± 1,58 1,91 ± 0,26 3,08 ± 0,15 polifenoli totali (mg/l catechina) 1738, , , , , ,55 antociani totali (mg/l) 106,78 112,94 121,56 87,85 79,05 75,75 flavonoidi totali (mg/l) 3116, , , , , ,39 flavonoidi non antocianici (mg/l) 2961, , , , ,10 intensità 0,349 0,250 0,299 0,315 0,265 0,247 tonalità 0,723 0,899 0,837 0,764 0,828 0,809 Tab. 12 Parametri chimici dei vini della microvinificazione dell anno ; i dati si riferiscono al mese di ottobre 2005 (sono riportati valori medi e deviazione standard) C1 C2 C3 C4 3A/1 15B/1 acidità totale (g/l) 6,12 ± 0,68 5,59 ± 0,72 4,99 ± 0,26 6,56 ± 0,60 5,70 ± 0,50 6,74 ± 0,32 acidità volatile (g/l) 0,34 ± 0,05 0,41 ± 0,09 0,39 ± 0,03 0,42 ± 0,09 0,44 ± 0,09 0,34 ± 0,06 ph 3,60 ± 0,08 3,60 ± 0,03 3,63 ± 0,05 3,42 ± 0,04 3,48 ± 0,09 3,43 ± 0,05 SO 2 libera (mg/l) 23,6 27,0 23,6 21,6 20,3 23,0 SO 2 totale (mg/l) 80,0 83,6 76,6 73,0 66,0 65,0 estratto secco (g/l) 26,60 ± 0,74 25,12 ± 1,41 24,30 ± 0,62 25,48 ± 0,91 23,10 ± 0,23 25,57± 0,14 acido malico (g/l) 0,32 ± 0,43 0,97 ± 1,54 0,11 ± 0,02 1,09 ± 1,37 0,91 ± 1,21 2,42 ± 0,90 polifenoli totali (mg/l catechina) 1446, , , , , ,01 antociani totali (mg/l) 116,14 119,73 115,26 105,85 100,59 95,21 flavonoidi totali (mg/l) 3358, , , , , ,89 flavonoidi non antocianici (mg/l) 3189, , , , , ,26 intensità 0,331 0,282 0,326 0,335 0,284 0,284 tonalità 1,051 1,208 1,095 1,040 1,120 1,090 Fig. 23a Grafico delle sostanze polifenoliche al mese di ottobre 2005 per i vini prodotti nella vinificazione anno (70 hl, prova B, ceppo autoctono 3A/1) Fig. 23b Grafico delle sostanze polifenoliche al mese di ottobre 2005 per i vini prodotti nella vinificazione anno (70 hl, prova N, ceppo autoctono 3A/1) 21

22 Fig. 24a Studio del colore al mese di ottobre 2005 per i vini prodotti nella vinificazione anno (70 hl, prova B, ceppo autoctono 3A/1) Fig. 24b Studio del colore al mese di ottobre 2005 per i vini prodotti nella vinificazione anno (70 hl, prova N, ceppo autoctono 3A/1) Nella valutazione sensoriale detta di preferenza i vini prodotti con i due ceppi autoctoni 3A/1 e 15B/1 hanno sempre ottenuto un buon posizionamento, migliore di quelli ottenuti con i ceppi commerciali e con gli altri ceppi autoctoni. Per quanto riguarda le degustazioni con metodo descrittivo, nei vini prodotti con le vinificazioni di massa (30 hl) il ceppo autoctono 3A/1 (Fig.25) ha riscosso un parere favorevole per quanto riguarda l aspetto visivo, ottenendo infatti i punteggi più alti per i descrittori gradevolezza e tonalità. All analisi olfattiva è emersa un alta intensità e persistenza di gusto oltre ad un elevata capacità di conferire note floreali e fruttate. Da notare anche la maggior morbidezza. Nelle prove effettuate nelle cantine valtellinesi (70 hl, ceppo autoctono 3A/1) (Fig.26) si sono notate differenze per cui in una di queste prove, 6 giudici hanno preferito i vini prodotti con il ceppo commerciale e soltanto 3 il vino prodotto con il ceppo 3A. Il vino prodotto con il ceppo commerciale ha ottenuto i punteggi migliori in quasi tutti i descrittori visivi e olfattivi; esso primeggia per le note fruttate, per la persistenza del gusto, per la struttura e il corpo. Nella prova vinificata in un altra cantina, (prova N) (Fig.27), invece, i giudici hanno preferito il vino prodotto con il lievito autoctono 3A/1 e il vino prodotto con il lievito commerciale. Migliore è in questo caso il punteggio assegnato al vino prodotto con ceppo autoctono per quanto riguarda tutti i descrittori dell aspetto visivo: gradevolezza, tonalità e riflessi violacei. In particolare si è distinto per la tonalità. Anche per tutti i descrittori dell analisi olfattiva il campione autoctono ha ottenuto i punteggi maggiori anche se in modo non netto. Fig. 25 Fig. 26 Fig. 25 Punteggio assegnato a ciascun descrittore nella valutazione sensoriale dei vini prodotti con la sperimentazione dell anno (30hl). Fig. 26 Punteggio assegnato a ciascun descrittore nella valutazione sensoriale dei vini prodotti con la sperimentazione dell anno (prova B, 70 hl) Fig. 27 Punteggio assegnato a ciascun descrittore nella valutazione sensoriale dei vini prodotti con la sperimentazione dell anno (prova N, 70 hl) Fig

23 Ceppi per vino Sforzato Durante le vendemmie 1998, 2001 e 2002 sono stati isolati 75 ceppi di lieviti dalla linea di produzione del vino Sforzato, che si ottiene da uve raccolte nel mese di ottobre, sottoposte ad un appassimento fino a gennaio e quindi vinificate. Ci si trova ad operare in pieno inverno per cui, spesso, le basse temperature sono causa di ritardi di fermentazioni o di fermentazioni prolungate. Si sottolinea quindi l importanza di trovare e selezionare ceppi di lieviti criotolleranti, capaci di attivarsi anche in condizioni difficili, non a loro completamente ottimali. Attraverso l identificazione e la caratterizzazione, eseguite secondo i criteri descritti precedentemente, sono stati individuati 2 ceppi, denominati SF2A/2 e SF3D/2, potenzialmente idonei alla produzione dello Sforzato. Questi ceppi, (Tab. 3a), hanno mostrato su terreno YPD colonie di colore chiaro, crescita a 34 C e 37 C, resistenza a 200 ppm di SO 2, capacità di fermentare glucosio, saccarosio, maltosio, galattosio e raffinosio ma non melibiosio, lattosio e trealosio. Alta la produzione di H 2 S da parte del ceppo SF2A/2, ridotta quella del ceppo SF3D/2; esito negativo per entrambi al profilo killer. La valutazione tecnologica di questi ceppo è stata effettuata nelle annate 2003 e 2004 con prove di microvinificazione eseguite in triplo per ciascun ceppo su un quantitativo ridotto di mosto (circa 50 kg), data la quantità limitata di uva disponibile. L inoculo è stato preparato secondo le modalità già descritte (Tab.4). Queste prove sono stata condotte su uve raccolte agli inizi del mese di ottobre e lasciate appassire in locali appositi fino agli inizi di gennaio, quindi vinificate. Sul mosto in fermentazione sono state fatte aggiunte e correzioni secondo il protocollo di vinificazione normalmente seguito dalla Fondazione Fojanini. Fig. 28 Sviluppo popolazione lievitiforme nella fermentazione delle prove di microvinificazione dei ceppi di lievito per Sforzato nell anno Fig. 29 Consumo di zuccheri e produzione di etanolo nelle prove di microvinificazione dei ceppi di lievito per Sforzato nell anno Fig. 30 Consumo di zuccheri e produzione di etanolo nelle prove di vinificazione dei ceppi di lievito per Sforzato nell anno Rispetto alle vinificazioni tradizionali è stata leggermente aumentata la dose di metabisolfito di potassio, aggiunto in quantità di circa 15 g/hl. I ceppi inoculati nei tini si sono adattati alle nuove condizioni del mezzo (mosto) moltiplicandosi, aumentando la loro carica quasi fino a valori di 10 6 ufc/ml nel caso del ceppo SF2A (Fig.28). I ceppi utilizzati hanno mostrato capacità di condurre la fermentazione alcolica con un comportamento del tutto simile a quello del ceppo di lievito commerciale normalmente utilizzato (Figg. 29, 30). Le rigide temperature non hanno ostacolato lo svolgimento della fermentazione che ha avuto una durata di 1015 giorni (tempo medio richiesto da tale processo) (Tab.13, 14, 15). Anche in questo caso la fermentazione è stata dominata dal ceppo inoculato, come confermato dal profilo del cariotipo con PFGE (Fig.17). 23

24 Tab. 13 Analisi chimiche eseguite durante la fermentazione dello Sforzato nell anno 2003 (valori medi e deviazione standard) zucchero (g/100ml) alcol svolto (% vol.) acidità totale (g/l) 27gen 30gen 31gen 02feb SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST 27,1 27,1 27,1 nd nd nd 10,75 10,75 10,75 ph 0,1 0,1 0,1 temperatura cantina C 25,63 ± 0,75 0,89 ± 0,15 12,07 ± 0,12 3,44 ± 0,03 25,49 ± 0,70 0,29 ± 0,70 11,93 ± 0,12 3,34 ± 0,05 24,98 ± 0,87 0,75 ± 0,12 11,63 ± 0,55 3,34 ± 0,06 22,08 ± 0,81 2,31 ± 0,25 9,92 ± 0,14 3,21 ± 0,02 20,93 ± 0,50 2,68 ± 0,07 10,03 ± 0,26 3,19 ± 0,02 20,33 ± 0,72 2,38 ± 0,10 10,23 ± 0,25 3,19 ± 0,02 12,57 ± 0,85 6,88 ± 0,25 10,07 ± 0,15 3,20 ± 0,03 11,80 ± 0,70 7,27 ± 0,45 9,90 ± 0,10 3,19 ± 0,02 9,52 ± 1,37 8,7 ± 0,52 10,25 ± 0,22 3,19 ± 0, ,2 13,2 13, zucchero (g/100ml) alcol svolto (% vol.) acidità totale (g/l) ph temperatura cantina C 4,24 ± 0,83 12,17 ± 0,28 10,10 ± 0,17 3,33 ± 0,02 04feb 06feb 07feb 5,32 ± 0,44 11,43 ± 0,22 9,93 ± 0,12 3,31 ± 0,01 4,59 ± 0,88 11,30 ± 0,39 10,03 ± 0,12 3,35 ± 0,04 0,90 ± 0,15 14,99 ± 0,49 10,10 ± 0,10 3,37 ± 0,01 2,14 ± 0,56 13,72 ± 0,57 9,70 ± 0,10 3,37 ± 0,02 2,7 ± 1,10 13,44 ± 0,29 9,63 ± 0,15 3,34 ± 0,03 0,51 ± 0,15 15,05 ± 0,12 10,03 ± 0,06 3,39 ± 0,01 0,42 ± 0,18 14,51 ± 0,08 9,47 ± 0,06 3,37 ± 0,01 0,25 ± 0,03 14,14 ± 0,14 9,53 ± 0,06 3,36 ± 0,02 13,2 13,2 13, Tab. 14 Analisi chimiche eseguite durante la fermentazione dello Sforzato nell anno 2004 (valori medi e deviazione standard) zucchero ( Brix) alcol svolto (%vol.) acidità totale (g/l) ph acido malico (g/l) acidità volatile (g/l) 15gen 16gen 20gen 21gen SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST SF2A/2 SF3D/2 ST 27,73± 0,67 3,59± 0,04 28,63± 0,25 3,61± 0,06 26,50± 1,35 3,58± 0,03 27,20± 0,44 5,42± 0,30 3,60± 0,16 28,10± 0,87 5,47± 0,46 3,72± 0,05 28,00± 0,95 5,03± 0,25 3,67± 0,04 22,73± 1,17 5,43± 0,40 23,13± 0,31 5,76± 0,63 22,17± 2,05 5,37± 1,43 21,37± 1,14 6,60± 0 22,07± 0,68 6,53± 0,06 20,77± 2,25 6,87± 0,25 22gen 26gen 28gen 30gen zucchero ( Brix) 19,83± 1,25 20,40± 0,72 18,57± 2,12 15,17± 1,18 16,60± 0,46 14,37± 2,26 13,47± 1,18 15,27± 0,42 13,00± 2,01 12,07± 0,93 14,10± 0,46 11,87± 1,45 alcol svolto (%vol.) 13,01± 0,40 12,24± 0,51 13,53± 1,10 15,10± 0,30 14,64± 0,43 15,27± 1,06 acidità totale (g/l) 6,63± 0,06 6,50± 0,10 6,73± 0,15 7,27± 0,21 6,67± 0,12 7,37± 0,29 7,83± 0,21 7± 0,12 7,33± 0,12 7,67± 0,25 6,80± 0,44 7,20± 0,26 ph 3,64± 0,01 3,71± 0,04 3,60± 0,06 3,71± 0,01 3,79± 0,05 3,70± 0,07 3,74± 0,02 3,82± 0,05 3,73± 0,07 3,75± 0,03 3,82± 0,04 3,74± 0,06 acido malico (g/l) 2,54± 0,15 2,19± 0,08 1,97± 0,18 acidità volatile (g/l) 0,39± 0,06 0,50± 0,05 0,46± 0,02 0,71± 0,03 0,71± 0,03 0,64± 0,07 Tab. 15 Parametri chimici sui vini Sforzato prodotti nell anno 2003 e nell anno 2004 (valori medi e deviazione standard) SF2A/2 SF3D/2 ST3 SF2A/2 SF3D/2 ST3 acidità totale (g/l) 10,03±0,06 9,47±0,06 9,53±0,06 7,57±0,25 6,97±0,58 7,43±0,25 ph 3,39±0,01 3,37±0,01 3,36±0,02 3,72±0,03 3,83±0,05 3,73±0,03 zuccheri ( Brix) 10,77±0,25 11,57±0,47 10,63±0,29 grado alcool (%vol.) 15,05±0,12 14,51±0,08 14,14±0,14 15,37±0,09 15,18±0,18 15,10±0,38 acidità volatile (g/l) 0,44±0,02 0,43±0,02 0,44±0,02 0,73±0,14 0,73±0,15 0,71±0,03 acidità fissa (g/l) 9,78±0,48 8,89±0,07 9,02±0,11 6,65±0,09 6,05±0,41 6,51±0,26 acido malico (g/l) 5,01±0,30 4,58±0,16 4,72±0,31 2,42±0,16 2,10±0,03 1,92±0,14 acido lattico (g/l) 0,36±0,02 0,46±0,13 0,37±0,08 0,32±0,09 0,35±0,06 0,57±0,08 24