Coltivazione e manipolazione di cellule. Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

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1 Coltivazione e manipolazione di cellule

2 Vantaggi delle cellule in coltura rispetto agli organismi interi. Le cellule in coltura sono più omogenee di quelle dei tessuti. Le condizioni sperimentali possono essere controllate in modo più rigoroso. Una singola cellula può essere fatta crescere fino a formare una colonia che è geneticamente omogenea (clone).

3 Crescita dei microorganismi in coltura esempi: Escherichia coli e il lievito S. cerevisiae Hanno una velocità di crescita elevata e necessità nutritive semplici. Il tempo di replicazione di E. coli e di altri microorganismi simili varia tra 20 minuti ed 1 ora. Una singola cellula di E. coli, che si divide ogni 30 minuti, può formare una colonia contenente cellule in 12 ore. Crescono facilmente in piastre di coltura, solitamente su una base semisolida di agar, un polisaccaride vegetale. Colonie del lievito Saccharomyces cerevisiae

4 Mezzi di crescita per batteri e lieviti comuni. MEZZO ESSENZIALE # : Fonte di carbonio: glucosio o glicerolo Fonte di azoto: NH 4+ o un composto organico come l istidina. Sali: Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+, SO 4 2-, Cl - e PO 4 3- Oligoelementi. MEZZO ARRICCHITO: Tessuti animali o vegetali parzialmente idrolizzati (ricchi in amminoacidi, corti peptidi e lipidi) Estratti di lievito (ricchi in vitamine e cofattori di enzimi, precursori di acidi nucleici e amminoacidi) Fonte di carbonio, fonte di azoto e sali come nel mezzo essenziale # tipico per la maggior parte dei batteri e dei lieviti

5 Repliche di piastra (Replica plating) Ceppi mutanti di batteri e di lieviti possono essere isolati mediante repliche di piastre (Joshua e Esther Ledemberg, anni 40).

6 Crescita dei microorganismi in coltura In condizioni di coltura standard, la frequenza di mutazioni spontanee in E. coli è di 1 su paia di basi per generazione. E pertanto possibile che si generi una mutazione nel tempo necessario perchè una singola cellula produca poche migliaia di cellule, e quindi che alcuni geni si trovino ad essere diversi tra le cellule appartenenti allo stesso clone. Per mantenere l omogeneità genetica di un clone è pertanto necessario riclonarlo spesso in condizioni di pressione selettiva Durante la crescita delle colonie, in una cellula della colonia a sinistra si è verificata una mutazione a carico della via biosintetica dell adenina. Tutte le cellule discendenti dalla cellula mutante hanno accumulato un pigmento, derivato da intermedi nella biosintesi dell adenina che non possono essere ulteriormente metabolizzati

7 Crescita di cellule animali in colture. Le cellule animali sono molto più difficili da far crescere in coltura dei microorganismi perchè necessitano di molte più sostanze nutritive e crescono solo se attaccate a superfici rivestite in maniera appropriata. Una singola cellula di topo Una colonia di cellule umane Colonie in piastre Petri.

8 Mezzi di crescita per cellule di mammifero Mezzo contenente siero (Mezzo Eagle) Amminoacidi: Nove amminoacidi essenziali (istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina); per la maggior parte delle cellule in coltura anche cisteina, glutammina e tirosina sintetizzati, nell animale, da cellule specializzate (Concentrazione da 10-4 a 10-5 M). Vitamine: Colina, acido folico, nicotinammide, pantotenato, piridossale e tiammina (tutte 1mg/L); inositolo, (2 mg/l); riboflavina (0,1 mg/ml). Sali: NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, CaCl 2, MgCl 2. Glucosio: 0,9 g/l Siero dializzato: 5-10% del volume totale (spesso siero bovino fetale, più ricco di fattori di crescita) Vari: penicillina, streptomicina, rosso fenolo.

9 Il siero nei mezzi di coltura delle cellule animali Il siero, la parte non cellulare del sangue, è una miscela di centinaia di proteine e contiene diversi fattori necessari alla proliferazione delle cellule in coltura. Es.: Insulina, un ormone necessario alla crescita in coltura di molte cellule di vertebrato; Transferrina, una proteina di trasporto del ferro necessaria affinchè le cellule in coltura lo possano incorporare. Anche se molte cellule animali possono crescere in un semplice mezzo contenente siero come il Mezzo Eagle, alcuni tipi cellulari necessitano di specifici fattori di crescita proteici che nel siero non sono presenti (es.: eritropoietina per i precursori degli eritrociti, interleuchina 2 per i linfociti T). Questi fattori si legano a recettori proteici che attraversano la membrana plasmatica e comunicano alla cellula di aumentare di dimensione e di massa e di dare inizio alla divisione cellulare

10 Mezzi di crescita per cellule di mammifero (b) Mezzo a composizione definita (privo di siero) Amminoacidi: Come precedente + alanina ed asparagina. Vitamine, Sali e Glucosio: Come precedente. Vari: penicillina, streptomicina, rosso fenolo. Altri componenti: Acidi grassi: Acido linoleico, acido lipoico. Composti azotati: Ipoxantina, timidina, putrescina. Fonte di carbonio: Piruvato e glucosio (0,9 g/l) Oligoelementi: Cadmio, manganese, molibdeno, nichel, stagno, vanadio. Ormoni e fattori di crescita: Insulina, transferrina, idrocortisone, FGF, EGF.

11 La maggior parte delle cellule animali può crescere in coltura solo su speciali superfici solide All interno dei tessuti animali, la maggior parte delle cellule stabilisce contatti stretti ed interagisce specificamente con altre cellule, tramite giunzioni cellulari, e con la matrice extracellulare; In conseguenza di ciò, a differenza delle cellule batteriche e di lievito, che possono crescere in sospensione, la maggior parte delle cellule animali necessita di una superficie su cui crescere. Molti tipi cellulari possono aderire e crescere sul vetro o su plastiche che, dopo trattamento speciale, espongono sulla superficie gruppi carichi negativamente (per esempio SO 3 2- ). Le cellule in coltura secernono collagene e altri componenti della matrice che si legano alla matrice e fungono da ponte tra essa e le cellule. Alcune cellule tumorali possono crescere in sospensione.

12 Cellule primarie (a) Tessuti animali normali o embrioni possono essere usati per stabilire colture cellulari primarie. Per preparare cellule da mettere in coltura (o per staccare cellule aderenti da una piastra di coltura per studi biochimici), si utilizza tripsina o un altra proteasi per demolire le proteine delle giunzioni che interconnettono le cellule. Alcuni tipi cellulari crescono più facilmente in coltura. L identificazione e la preparazione di diversi fattori di crescita proteici capaci di stimolare la replicazione di specifici tipi cellulari ed i miglioramenti nei metodi di coltura, consentono di coltivare diversi tipi di cellule specializzate (es. cellule epiteliali, epatiche).

13 Cellule primarie (b) Molti studi su cellule di vertebrato sono eseguiti con i tipi cellulari che crescono più facilmente in coltura, che non sono cellule di tipo definito. Quando un embrione o un tessuto vengono posti in coltura, il tipo cellulare di solito predominante è chiamato fibroblasto, perchè secerne i tipi di proteine che sono normalmente associati ai fibroblasti nel tessuto connettivo fibroso degli animali. I fibroblasti in coltura hanno la morfologia dei fibroblasti tissutali, ma conservano la capacità di differenziarsi in altri tipi cellulari e non sono quindi tanto differenziati quanto i fibroblasti tissutali.

14 La gran parte delle cellule rimosse da un animale crescono e si dividono per un periodo di tempo limitato (circa 50 divisioni), poi muoiono.

15 Ceppi cellulari Una linea di cellule derivata da una sola coltura primaria iniziale viene chiamata ceppo cellulare; Da quello che abbiamo detto si evince che un ceppo cellulare può essere tenuto a lungo in coltura (sino a 50 replicazioni), ma non è perenne!

16 Le cellule trasformate possono crescere in coltura indefinitamente Si possono generare cellule trasformate, che sono immortali e possono formare una linea cellulare. Le alterazioni genetiche che consentono a queste cellule di crescere indefinitamente sono definite nel complesso come trasformazione oncogena. Una coltura di cellule con durata di vita indefinita è considerata immortale ed è chiamata linea cellulare, per distinguerla dal ceppo cellulare, che non è perenne. Cellule trasformate possono essere derivate da tumori, o possono generarsi spontaneamente in coltura. Le cellule delle linee cellulari sono spesso aneuploidi.

17 La tendenza alla trasformazione spontanea varia nelle diverse specie animali La capacità delle cellule di crescere indefinitamente in coltura dipende dalla specie animale da cui derivano. Le cellule di pollo normali vengono raramente trasformate e muoiono dopo poche replicazioni. Tra le cellule umane, solo le cellule tumorali crescono indefinitamente. La prima linea cellulare umana (cellule HeLa) cresciuta in coltura è stata ottenuta nel 1952 a partire da un tumore maligno (carcinoma) della cervice uterina. Le colture di cellule embrionali aderenti ottenute dai roditori danno luogo normalmente a linee cellulari.

18 Stabilizzazione di una coltura cellulare. Un numero molto piccolo di cellule non muore ma continua a crescere fino a che la loro progenie diventa prevalente nella coltura. Queste cellule costituiscono una linea cellulare, che può crescere per sempre se viene diluita e nutrita in Copyright maniera (c) by W. appropriata: H. Freeman and Companyle cellule sono immortali

19 Le linee cellulari parzialmente differenziate La maggior parte delle linee cellulari sono indifferenziate, ma alcune possono svolgere molte delle funzioni caratteristiche delle normali cellule differenziate da cui esse derivano. Un esempio è fornito da alcune linee cellulari di epatoma (HepG2, Hep3B) che sintetizzano molte delle proteine sieriche prodotte dagli epatociti normali (il tipo cellulare principale del fegato). Queste cellule di epatoma altamente differenziate vengono studiate come modelli di epatociti normali. E possibile ottenere anche cellule trasformate del tipo dei mioblasti (precursori delle cellule muscolari) che in coltura continuano a svolgere molte funzioni tipiche delle cellule differenziate specializzate (per esempio è possibile indurre la fusioni dei mioblasti trasformati per formare miotubi). Sono state coltivate con successo anche alcune linee di cellule epiteliali. Es.: la linea di rene di cane Madin-Darby (Madin-Darby canine kidney, MDCK) fornisce un modello per studiare le funzioni delle cellule epiteliali.

20 Mioblasti di ratto trasformati in coltura A sinistra La linea di mioblasti di ratto trasformati cresce in coltura indefinitamente sotto forma di cellule singole. A destra. Quando la crescita dei mioblasti viene fermata (per esempio togliendo il siero dal mezzo), le cellule si fondono producendo miotubi con la caratteristica striatura delle cellule di muscolo differenziate.

21 Alcune linee cellulari possono differenziare in coltura e generare strutture simili ai tessuti. Cellule Madin-Darby di rene di cane (MDCK). Le cellule MDCK formano un epitelio polarizzato quando vengono fatte crescere a confluenza sopra un filtro di membrana porosa, rivestito su un lato con collagene e con altre proteine della membrana basale (struttura della matrice extracellulare che sostiene uno strato epiteliale)

22 Speciali piastre di coltura consentono alle cellule di essere bagnate da mezzi di coltura appropriati su ognuno dei due lati del filtro su cui vengono cresciute le cellule

23 Linee cellulari di uso comune Linea cellulare: 3T 3 BHK 21 # MDCK HeLa # PtK 1 L6 PC 12 SP 2 # Tipo cellulare ed origine: Fibroblasti (topo) Fibroblasti (hamster siriano) Cellule epiteliali (cane) Cellule epiteliali (uomo) Cellule epiteliali (ratto canguro) Mioblasti (ratto) Cellule cromaffini ( ratto) Plasmacellule (topo) # In grado di crescere in sospensione

24 Alcune pietre miliari nello sviluppo delle colture di tessuto e di cellula 1986 Martin e Evans e colleghi isolano e coltivano cellule staminali embrionali pluripotenti di topo 1998 Thomson e Gearhart isolano cellule staminali embrionali umane 2004 Hwang et al. Produzione di una linea di cellule staminali embrionali da cellule umane clonate (????)

25 Fusione cellulare Sebbene sia poco frequente che le cellule animali in coltura diano luogo a fusione cellulare, la possibilità di fusione aumenta notevolmente in presenza di alcuni virus, dotati di un involucro lipoproteico simile alla membrana plasmatica delle cellule animali. La fusione cellulare è facilitata anche dal glicole polietilenico, che fa sì che le membrane plasmatiche di cellule adiacenti aderiscano l una all altra e si fondano Due cellule diverse possono essere indotte a fondersi creando una cellula ibrida (eterocarionte).

26 Fibroblasti 3T3 in coltura: una glicoproteina dell involucro del virus può indurre la formazione di un sincizio

27 Modello della fusione di membrana guidata dalla glicoproteina predominante dell involucro del virus dell influenza, l emagglutinina (HA).

28 Fusione cellulare Ibridi interspecifici possono essere usati per studi di genetica delle cellule somatiche. E possibile, per esempio, preparare ibridi tra cellule umane e cellule mutanti di topo mancanti di un enzima necessario alla sintesi di un particolare metabolita essenziale. Quando gli ibridi uomo-topo crescono e si dividono, perdono progressivamente in sequenza casuale i cromosomi umani, ma conservano i cromosomi di topo. In un mezzo mancante del metabolita essenziale che le cellule di topo non possono produrre, l unico cromosoma umano che contiene il gene codificante l enzima necessario sarà mantenuto. Usando diverse cellule mutanti di topo e mezzi di coltura in cui esse non possono crescere, i ricercatori hanno preparato diversi gruppi di linee cellulari ibride, ognuna contenente un singolo cromosoma umano (o un piccolo numero). Poichè ciascun cromosoma può essere identificato al microscopio, queste cellule ibride forniscono uno strumento ideale per mappare singoli geni su specifici cromosomi.

29 Le cellule ibride possono essere selezionate nel mezzo HAT Ipoxantina (una purina) Amminopterina (un antifolato) timidina

30 Vie biosintetiche ex novo e di salvataggio per la sintesi dei nucleotidi. La maggior parte delle cellule animali può sintetizzare i nucleotidi purinici e pirimidinici ex novo a partire da composti contenenti carbonio e azoto più semplici, anzichè dalle purine e pirimidine esistenti. Gli antagonisti dell acido folico (antifolati) ametopterina e amminopterina interferiscono con la donazione di gruppi metilici e formilici da parte dell acido tetraidrofolico (una forma attiva dell acido folico) nelle fasi precoci della sintesi dei nucleosidi purinici monofosfato e della timina monofosfato. Molte cellule, tuttavia, sono in grado, di aggirare il blocco metabolico indotto dagli antifolati, grazie a vie metaboliche alternative (vie di salvataggio) che permettono di sintetizzare i nucleotidi necessari a partire dalle basi puriniche e dalla timina

31 Sono state isolate diverse linee cellulari mutanti, privi di enzimi necessari a catalizzare una delle fasi della via di salvataggio (es.: linee TK - e HGPRT - ) X Resistenti alla 6-tioguanina X Resistenti alla 5- bromodeossiuridina Le linee TK - e HPGRT - sono state isolate perché resistenti all azione tossica di alcuni composti. Le mutazioni impedivano l incorporazione di tali composti nel DNA.

32 Le cellule ibride possono essere selezionate nel mezzo HAT ipoxantina (una purina), amminopterina (un antifolato), timidina Le cellule normali possono crescere in mezzo HAT, infatti, anche se l amminopterina blocca la sintesi ex novo di purine e TMP, la timidina nel mezzo viene trasportata all interno della cellula e convertita a TMP dalla TK, mentre l ipoxantina viene convertita in purine utilizzabili dalla HGPRT; Né le cellule TK - né le cellule HGPRT - possono crescere in mezzo HAT; Gli ibridi di fusione tra cellule TK - e cellule HGPRT - possono crescere in mezzo HAT; Anche gli ibridi formati dalla fusione di cellule mutanti e cellule normali possono crescere in mezzo HAT

33 Alcuni ibridi cellulari (ibridomi) possono essere utilizzati per produrre anticorpi monoclonali.

34 E possibile generare anticorpi contro proteine specifiche. Questi anticorpi sono strumenti molto efficaci per lo studio delle proteine. Gli anticorpi possono essere Copyright usati (c) by W. per H. Freeman rivelare and Company e isolare molecole specifiche.

35 Gli anticorpi Un anticorpo (detto anche immunoglobulina, Ig) è una proteina sintetizzata da un animale in risposta alla presenza di una sostanza estranea,, detta antigene. Normalmente gli anticorpi hanno il compito di proteggere l animale l dalle infezioni Gli anticorpi sono specifici e hanno una elevata affinità specifica per gli antigeni che ne hanno stimolato la sintesi. Oltre alle proteine anche altre molecole, es. acidi nucleici o polisaccaridi, p possono essere ottimi antigeni Un anticorpo riconosce un gruppo specifico o un piccolo numero di amminoacidi su una molecola che può essere anche molto grande.; il gruppo riconosciuto dall anticorpo anticorpo è detto determinante antigenico o epitopo e una moleocola grande può contenere più epitopi riconosciuti da anticorpi diversi.

36 Produzione di anticorpi Ogni linfocita B normale di un animale è capace di produrre un solo tipo di anticorpo diretto contro uno specifico determinante, o epitopo, di una molecola di antigene. Se a un animale viene iniettato un antigene, i linfociti B che producono anticorpi capaci di riconoscere quell antigene sono stimolati a crescere e proliferare. Ogni linfocita B stimolato forma, nella milza o nei linfonodi, un clone di cellule e ogni cellula produrrà anticorpi identici, chiamati anticorpi monoclonali. L esposizione di un animale ad un antigene con più epitopi stimolerà la formazione di parecchi cloni diversi di linfociti B, e ognuno produrrà un anticorpo differente. Una miscela di anticorpi che riconoscono epitopi diversi dello stesso antigene viene definita policlonale. Per molti studi che richiedono anticorpi, gli anticorpi monoclonali sono preferibile ai policlonali

37 Produzione di immunoglobuline Fotografia al microscopio elettronico di una plasmacellula,, la cellula che produce anticorpi. La cellula presenta un reticolo endoplasmatico molto sviluppato, necessario per la secrezione degli anticorpi

38 Anticorpi policlonali La maggior parte degli antigeni hanno diversi epitopi. Gli anticorpi policlonali sono una miscela eterogenea di anticorpi, ognuno specifico per un epitopo diverso dell antigene. Anticorpi monoclonali Gli anticorpi monoclonali sono tutti uguali, vengono prodotti clonando una singola cellula che produce l anticorpo e riconoscono un singolo epitopo.

39 Gli anticorpi monoclonali Se si lavora con proteine non purificate è difficile interpretare i risultati e quindi stabilire le loro funzioni; le stesse difficoltà si incontrano usando una miscela non omogenea di anticorpi! Sarebbe ideale disporre di un clone di cellule che producano un solo anticorpo!

40 Anticorpi monoclonali La purificazione di anticorpi monoclonali dal siero non è praticabile (tra l altro la concentrazione è troppo bassa) Le colture primarie di linfociti B normali non crescono indefinitamente, e pertanto queste colture non possono essere utilizzate per sintetizzare anticorpi monoclonali. Queste difficoltà possono essere superate fondendo i linfociti B normali con linfociti trasformati in senso tumorale e quindi immortali, chiamati cellule di mieloma (Cesar Milstein e Georges Kohler,, 1975).

41 Preparazione di anticorpi monoclonali

42 FILM Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

43 Gli anticorpi monoclonali La tecnica di produzione di anticorpi monoclonali permette di preparare in tempi relativamente brevi grandi quantità di anticorpi omogenei con la specificità che si desidera. Gli anticorpi monoclonali possono essere utilizzati come reagenti analitici e preparativi. Esempi di utilizzo di anticorpi monoclonali: purificazione per immunoaffinità di proteine dosaggi clinici (esempio enzimi nel sangue, virus) agenti terapeutici nella cura del cancro creazione di anticorpi catalitici

44 Identificazione e studio delle molecole all interno delle cellule.

45 L immunologia ci ha fornito tecniche molto utili per lo studio delle proteine.

46 Gli anticorpi Le tecniche immunologiche dipendono dalla capacità dei ricercatori di generare anticorpi contro uno specifico antigene. Per ottenere anticorpi contro una specifica proteina umana, per esempio, è possibile iniettarla due volte in un coniglio, a una distanza di 3 settimane. L inoculazione della proteina estranea stimola la proliferazione delle d cellule che producono anticorpi che riconoscono quella proteina. Alcune settimane dopo si preleva il sangue del coniglio immunizzato e lo si centrifuga per separare le cellule del sangue dal sopranatante, o siero. Il siero, così ottenuto, detto anche antisiero, conterrà gli anticorpi di tutti gli antigeni a cui è stato esposto il coniglio, alcuni dei quali saranno quelli diretti contro la proteina inoculata.

47 Produzione di anticorpi (contro una specifica proteina X) -X viene prodotta in E.coli e purificata (es.: cromatografia per affinità) -La proteina X pura viene quindi iniettata negli animali (topo, coniglio, pecora, gallina) -Gli animali rispondono alla stimolazione antigenica con la produzione di una grande quantità di anticorpi diversi (da parte dei diversi linfociti B presenti nella milza) contro la proteina X estranea -Per ottenere gli anticorpi contro la proteina X viene prelevato il sangue degli animali (la resa massima del nostro anticorpo può essere circa il 5% delle IgG Copyright totali (c) by W. H. del Freeman plasma) and Company

48 Anticorpi policlonali Tipi di anticorpi per studi analitici -Sono sieri contenenti diversi anticorpi contro lo stesso antigene - gli anticorpi riconoscono differenti epitopi nell antigene -Affinità molto alta (K aff =10-11 to ) -Reagenti molto sensibili -Cross-reattività (epitopi multipli) ) o effetto background (95% altre IgG) possono essere i problemi con questi reagenti

49 Anticorpi monoclonali -Prodotti da cellule B identiche immortalizzate (splenociti) -Questi splenociti producono anticorpi identici -Selezioniamo gli splenociti immortalizzati che producono anticorpi contro la proteina di nostro interesse -Specificità molto alta (epitopo singolo) -Affinità variabile (K aff =10-8 to ) -Metodologia molto laboriosa Monoclonal antibody I Monoclonal antibody II

50 Struttura di un anticorpo Gli anticorpi IgG sono costituiti da 4 catene, 2 catene pesanti (in blu) e 2 leggere (in giallo), unite da ponti disolfuro. Le catene leggere e pesanti insieme formano i domini F ab, che possiedono i siti di legame all antigene nella zona terminale. Le due catene pesanti formano il dominio F c che è unito ai domini F ab da legami flessibili.

51 Interazioni antigene - anticorpo Un antigene proteico si lega all estremità di un dominio F ab di un anticorpo che possiede una forma complementare. Gran parte della superficie partecipa all interazione

52 Domini variabili ed interazione con gli antigeni Le regioni che determinano la complementarietà (CDR) sono indicati in rosso. Le sei CDR si avvicinano formando la superficie di legame. La specificità della superficie è determinata dalle sequenze e dalle strutture delle CDR.

53 Legame di un piccolo antigene Struttura del complesso fra un frammento Fab di un anticorpo e il suo bersaglio, la fosforilcolina. I residui dell anticorpo interagiscono con la fosforilcolina tramite legami idrogeno, interazioni elettrostatiche e forze di van der Waals.

54 Interazione antigene-anticorpo anticorpo I siti di legame dell anticorpo contengono alcune o tutte le CDR dei domini variabili. Le molecole di piccole dimensioni possono prendere contatto con un numero minore di CDR (nel caso della fosforilcolina circa 15 aa dell anticorpo partecipano all interazione). Le macromolecole creano contatti molto più estesi interagendo con tutte e 6 le CDR (20 o più aa coinvolti). Le piccole molecole possono inserirsi in una fessura presente nella regione che lega l antigene, mentre macromolecole come le proteine globulari tendono ad interagire con superfici più larghe quasi piatte.

55 Anticorpi contro il lisozima,, una proteina (a) Rappresentazione delle strutture di tre complessi fra i frammenti Fab (in blu e giallo) e il lisozima del bianco d uovo (rosso). I tre anticorpi riconoscono epitopi completamente diversi sulla molecola del lisozima.

56 Anticorpi contro il lisozima,, una proteina (b) I punti di contatto tra gli anticorpi e il lisozima sono mostrati sotto forma di modelli spaziali per rivelare le diverse forme dei siti di legame dell antigene.

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58 Sistemi di individuazione delle proteine basati sull utilizzo utilizzo degli anticorpi antibody detecting reagent Epitope on the antigen Antigen

59 Reagenti che possono essere utilizzati per individuare la presenza di anticorpi Secondary antibodies Antibodies prepared against other species antibodies - Sheep anti-mouse antibodies - goat anti-rabbit antibodies - horse anti-rat antibodoes antibody detecting reagent

60 Proteina A da S. aureus Protein A binds specifically to the constant region of the antibody antibody detecting reagent A

61 Tecniche che si basano sull uso uso di anticorpi per individuare proteine qwertyuiopasdfgghjklc vbnpoiuytrewlkjhgfdsa zcvbnmlkjhgfdsaxmnb vccasdfghjklqwertyuio pppoiuytrewcvbnmzsw edrfftcvfgtybnhjunjikm klotygherdfgvwsedcfve rfgvrtyghnmasdfgwerty uinjirfgeszwertyuiujhn oikjmnerdfwertgyhjjnn lkjhgfdsapoiuytrewwer cvbnmwertyuiopasdfgh jkllwertyuioppmmmm Antibody against X qwertyuiopasdfgghjklc vbnpoiuytrewlkjhgfdsa zcvbnmlkjhgfdsaxmn bvccasdfghjklqwertyui opppoiuytrewcvbnmzs wedrfftcvfgtybnhjunjik mklotygherdfgvwsedcf verfgvrtyghnmasdfgwe rtyuinjirfgeszwertyuiuj hnoikjmnerdfwertgyhjj nnlkjhgfdsapoiuytrew wercvbnmwertyuiopas dfghjkllwertyuioppmm m

62 Il dosaggio con immunoassorbenti legati a enzimi (ELISA) consente di identificare e quantificare una proteina

63 Tecniche che utilizzano anticorpi

64 Enzime linked immunosorbent assay (ELISA - Dosaggio con enzimi legati a immunoassorbenti) Per valutare la presenza di anticorpi (test per infezione da HIV) Per valutare la presenza e per quantificare un antigene.

65 ELISA Individuazione di una proteina in un campione -Le proteine sono immobilizzate nelle singole piastre. - La presenza di X è verificata utilizzando l anticorpo contro X - Un anticorpo secondario o la proteina A, accoppiati con un enzima (E), vengono utilizzati per identificare l anticorpo che lega l antigene. Se l enzima è presente significa che l antigene è presente. -Molto semplice -E possibile automatizzare questa tecnica ed avere un alto trough-put - Utilizzata per immuno-diagnosi di malattie,, per l identificazione di patogeni,, etc. substrate E Color product

66 Western blot La tecnica del western blotting permette di identificare proteine separate in una gel-elettroforesi

67 Western blot. -Le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e trasferite su di una membrana (ricorda il Southern o il Northern blot) - La presenza di X è testata mediante un anticorpo contro X -Il reagente che identifica l anticorpo è un anticorpo secondario o la Prot. A, accoppiati ad un enzima (E). -Più affidabile dell ELISA, ampiamente utilizzato come tecnica analitica. substrate E Color product

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69 Immunoprecipitazione. -Specific proteins are taken out of complex protein solutions by antibodies. -Secondary reagent is secondary antibody or Prot. A, which is cross-linked to chromatography beads

70 Studi di interazione tra proteine. Coimmunoprecipitazione -We want to test if protein X interacts with Protein Y. -We will immunoprecipitate X and.. - test for the presence of Y in the precipitate?

71 La microscopia a fluorescenza può localizzare e quantificare molecole specifiche nella cellula La tecnica forse più versatile e potente per rendere visibili proteine all interno di una cellula è rappresentata dalla colorazione fluorescente delle cellule, seguita dalla osservazione al microscopio a fluorescenza. Si dice che un composto chimico è fluorescente se assorbe luce ad una data lunghezza d onda (lunghezza( d onda d di eccitazione) ) ed emette luce ad una specifica lunghezza d onda d maggiore. Nei microscopi a fluorescenza la luce fluorescente emessa dal campione è utilizzata per formare l immagine. l Vi sono 4 coloranti fluorescenti particolarmente utili per la colorazione fluorescente: la rodammina e il rosso Texas, che emettono luce rossa,, il Cy3, che emette luce arancione,, e la fluoresceina che emette luce verde. Questi coloranti hanno una bassa affinità e non specifica per le molecole biologiche, ma possono essere uniti chimicamente ad anticorpi purificati.

72 La microscopia a immunofluorescenza Quando un complesso anticorpo-colorante colorante fluorescente viene aggiunto a cellule o a sezioni di tessuto permeabilizzate,, il complesso si legherà agli antigeni corrispondenti, che si illumuneranno ad opera della luce di eccitazione. Questa tecnica è chiamata microscopia di immunofluorescenza.

73 Studi immunomorfologici - Immunofluorescenza Cellule intere o tessuti sono fissati per la microscopia La presenza e la localizzazione di X è testata mediante l impiego di un anticorpo contro X -Il reagente che permette di localizzare l anticorpo è un anticorpo secondario o la Prot. A, accoppiati a composti che emettono luce (es. fluoresceina) -E possibile testare la presenza di due o più proteine utilizzando reaggenti che emettono luce in modo differente

74 Marcatori fluorescenti rendono possibile la visualizzazione di proteine p all interno delle cellule Fotografia al microsopio a fluorescenza di un embrione di Drosophila in via di sviluppo. L embrione è stato colorato con anticorpi monoclonali che riconoscono la proteina che lega il DNA engrailed. Gli anticorpi sono stati marcati con un marcatore fluorescente.

75 Ibridazione in situ di RNA Schema di trascrizione di 5 geni diversi coinvolti nella formazione di schemi nell embrione precoce della mosca rivelato in un singolo embrione. Ciascuna sonda di RNA è stata marcata con un colore fluorescente diverso. Figure 9-12 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)