Chlamydia MIF IgA (Italiano)
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- Bernarda Di Lorenzo
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1 (Italiano) REF IF1250A Rev. R Test di micro-immunofluorescenza (MIF) per la ricerca nel siero umano di anticorpi di classe IgA specifici per le infezioni da Chlamydia pneumoniae e Chlamydia trachomatis Questo foglietto illustrativo è associato esclusivamente ai prodotti per l'esportazione e non è destinato alla distribuzione negli Stati Uniti. Al di fuori degli Stati Uniti: per uso diagnostico in vitro APPLICAZIONI Il sistema di Focus Diagnostics di microimmunofluorescenza (MIF) per la diagnosi di IgA anti-chlamydia viene usato per l individuazione qualitativa e semi-quantitativa nel siero umano di anticorpi di classe IgA specifici per gli antigeni di Chlamydia pneumoniae e Chlamydia trachomatis. Il saggio non è indicato per l auto-diagnosi. SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST Le clamidie sono organismi intracellulari obbligati, che provocano patologie acute e croniche in alcune specie di mammiferi e uccelli. Il ciclo vitale delle clamidie può essere diviso in due fasi distinte: uno stadio infettivo extracellulare, in cui le clamidie sono incapaci di replicazione, e uno stadio non infettivo intracellulare obbligato, in cui le clamidie sono in grado di replicare. La forma infettiva, o corpo elementare (EB), si attacca alla membrana della cellula bersaglio e penetra nella cellula mediante fagocitosi. Successivamente il corpo elementare si riorganizza in particelle reticolate (che formano alcune inclusioni) e inizia la scissione binaria. Dopo ore, le particelle reticolate si condensano a formare i corpi elementari che saranno rilasciati per iniziare un nuovo ciclo infettivo 1. L EB è in possesso di antigeni genere (gruppo)-specifici, specie-specifici e sierotipo-specifici. Gli antigeni gruppo-specifici sono quelli più strettamente associati al lipopolisaccaride (LPS) della membrana esterna. Questo LPS può essere estratto comunemente per produrre antigeni gruppo-specifici da usare come reagenti nei saggi biologici. La proteina principale della membrana esterna (MOMP) contiene antigeni sia specie-specifici che sierotipo-specifici e costituisce circa il 60% della membrana esterna dell organismo. Anche se diverse altre proteine strutturali fanno parte della membrana esterna delle clamidie, l LPS e la MOMP sono gli immunogeni dominanti della risposta immunitaria negli esseri umani 9. Il genere Chlamydia è rappresentato da tre diverse specie. Chlamydia trachomatis comprende 12 sierotipi individuali (A L) ed è l agente eziologico associato al tracoma, al linfogranuloma venereo (LGV), alla salpingite ed alla polmonite infantile 2. La maggioranza delle infezioni da C. trachomatis sono asintomatiche. 3 Il 65% dei bambini partoriti per via vaginale da madri infette vengono infettati dalla C. trachomatis. 3 Chlamydia psittaci è rappresentata da molti sierotipi responsabili della psittacosi umana, una zoonosi acuta associata ad uccelli infetti 4. Una specie di recente scoperta, C. pneumoniae, è associata alla polmonite. Gli anticorpi anti-c. pneumoniae sono rilevabili nel 25 45% degli adulti esaminati e sono responsabili di circa il 10% dei casi di polmonite 7,8. Le infezioni da C. pneumoniae possono essere subcliniche. Le infezioni da clamidie possono essere diagnosticate mediante coltura cellulare, immunofluorescenza diretta (DFA), e test sierologici. Le colture positive e il DFA consentono una diagnosi più conclusiva, ma spesso presentano delle difficoltà nella raccolta e nel trasporto del campione e una complessità eccessiva nell'esecuzione. 4,10 Di conseguenza, per la diagnosi di routine si usano tecniche di sierologia quali la fissazione del complemento (CF), l'immunofluorescenza indiretta (IFA) e i saggi immunoenzimatici (EIA) 3. Serologies may be used for presumptive diagnosis of the some chlamydia infections, including: LGV, infant pneumonia due to C. trachomatis, psittacosis and pneumonia due to C. pneumoniae. Serology is not useful for routine genital infections caused by C. trachomatis. I test sierologici possono essere utilizzati per la diagnosi presuntiva di alcune infezioni da clamidia, inclusi: LGV, polmonite infantile dovuta a C.trachomatis, psittacosi e polmonite dovuta a C. pneumoniae. I test sierologici non sono utili per le infezioni genitali routinarie causate da C. trachomatis. L'uso del test CF per le clamidie è iniziato negli anni '40. Questo saggio utilizza l'antigene LPS arricchito per il rilevamento degli anticorpi gruppo-specifici. I saggi di fissazione del complemento sono tecnicamente difficili da eseguire ed essenzialmente poco sensibili. 4 I sistemi EIA in commercio utilizzano antigeni che presentano un'estesa reattività crociata, in genere derivati dal sierotipo LGV. Conseguentemente, come nel caso del test CF, si individuano solo le risposte anticorpali gruppo-specifiche. 9 Due forme di immunofluorescenza indiretta sono attualmente disponibili. Una utilizza cellule infettate che esibiscono come substrato interi corpi elementari di clamidie. I corpi reticolati, che comprendono i corpi inclusi, esprimono epitopi genere-specifici, non consentendo perciò il rilevamento differenziale di reazioni anticorpali specie-specifiche 10. L'altro saggio IFA a disposizione, un sistema di micro-immunofluorescenza (MIF) introdotto negli anni '70 8, utilizza come substrato i corpi elementari (EB) purificati. Rimuovendo l'lps, che funziona come antigene genere-specifico, si possono usare gli EB per individuare reazioni anticorpali specifiche per le diverse specie e varianti sierologiche di clamidie. È possibile purificare e raggruppare gli EB da tutte le specie e i sierotipi di clamidie, oppure è possibile usarli come substrati individuali in spot separati. 8 Negli Stati Uniti, la polmonite è la causa principale di morte dovuta a malattie infettive. Ogni anno negli Stati Uniti sono stati stimati 4 milioni di casi di polmonite acquisita dalla collettività (CAP), i quali causano 1 milione di ricoveri ospedalieri. La polmonite è un infezione respiratoria acuta, ed è accompagnata da un infiltrato rilevabile mediante radiografia toracica od osservazioni auscultatorie indicative di polmonite (ad es. rumori respiratori alterati). Nuovi agenti patogeni stanno rendendo più complicata la diagnosi e la cura della CAP. Attualmente, Chlamydia, Mycoplasma, e Legionella sono alcune delle cause più comuni di polmonite atipica. Il termine polmonite tipica è ormai un termine datato, rimasto dal tempo in cui la gran parte delle polmoniti era causata da Streptococcus pneumoniae. La risposta immunitaria primaria alle clamidie è rappresentata da un anticorpo della classe delle IgM, che appare precocemente durante l infezione. Le risposte tramite anticorpi di classe IgG e IgA seguono a breve tempo la risposta anticorpale iniziale caratterizzata da immunoglobuline di classe M. La risposta anticorpale precoce di IgG, IgM e IgA, è rivolta contro gli antigeni gruppo- e specie-specifici di Chlamydia. Un innalzamento di quattro volte delle IgG durante le infezioni primarie dovute a clamidie, viene considerato diagnostico. Quando si sospetta un'infezione da C. pneumoniae o C. psittaci, l'individuazione di IgM è di valore altamente diagnostico. 12 Al contrario, in pazienti infettati da C. trachomatis, la presenza di IgM ha un minore potere diagnostico: una risposta anticorpale da parte di IgM è presente solo nel 28 33% dei pazienti con infezione da C. trachomatis in corso; inoltre tale risposta può verificarsi in pazienti che non hanno infezioni attive da parte di clamidie. 12 L'infezione primaria da C. pneumoniae è caratterizzata da una predominante risposta delle IgM in 2 4 settimane, una tarda risposta delle IgG in 6 8 settimane 13 e una risposta delle IgA debole o assente. 18 Dopo l'infezione acuta da C. pneumoniae, le IgM scompaiono generalmente in 2 6 mesi 13, i titoli delle IgG si innalzano e si riducono in genere lentamente, mentre le IgA tendono a scomparire rapidamente. 19
2 Pagina 2 Si stima che ogni anno nel mondo siano 92 milioni i nuovi casi di Chlamydia trachomatis (OMS, 2001). Secondo le stime, ogni anno sono quattro milioni i nuovi casi negli Stati Uniti e nei paesi industrializzati. Tra i soggetti infetti, fino al 70% delle donne e il 50% degli uomini sono asintomatici. C. trachomatis provoca spesso infezioni asintomatiche del tratto genitale sia negli uomini che nelle donne, ed il batterio può restare infettivo nell'ospite per mesi. Ciò comporta un numero elevato di soggetti infetti non diagnosticati, che a loro volta trasmettono l'infezione per via sessuale. ad altri individui Abitualmente gli uomini richiedono meno frequentemente un test diagnostico e gran parte delle infezioni si verifica nel gruppo di età compreso tra i 15 e i 24 anni. Benché ciò comporti un numero complessivamente sottostimato di casi, C. trachomatis rappresenta una delle patologie sessualmente trasmesse più facilmente curabili. Ciò ha un notevole significato in termini di salute pubblica, in quanto C. trachomatis può provocare gravi complicanze a lungo termine, soprattutto nelle donne. È una delle cause dimostrate di malattia infiammatoria pelvica (pelvic inflammatory disease, PID) che può provocare infertilità, gravidanza ectopica e dolore cronico. Queste condizioni in taluni casi possono causare danni permanenti oltre a richiedere terapie costose. Inoltre i bambini nati da madri con infezione da Chlamydia possono essere affetti da ophthalmia neonatorum e polmonite. La PID è una sindrome complessa, che comprende un'ampia gamma di malattie infiammatorie quali l'endometriosi, la salpingite e l'ascesso tubo-ovarico. Tali malattie possono essere provocate da una varietà di organismi differenti. A differenza di quanto avviene per altri specifici organismi sessualmente trasmessi, per le persone affette dalla PID non esiste un singolo regime terapeutico di elezione. Diversi regimi terapeutici antimicrobici si sono rivelati molto efficaci ai fini della guarigione clinica dei soggetti affetti da PID. Sono state messe a punto delle opzioni terapeutiche per le pazienti con PID che consentono una certa flessibilità. In genere i regimi terapeutici per la PID forniscono una copertura ad ampio spettro dei patogeni che possono avere un ruolo eziologico. I criteri di selezione per un regime di trattamento devono tenere conto, al tempo stesso, dell'eziologia microbica e della disponibilità nell'istituzione, dei tentativi di tenere sotto controllo i costi, dell'accettabilità da parte della paziente e delle differenze locali nella sensibilità antimicrobica. Fino a quando non saranno disponibili studi più definitivi, i soggetti affetti da PID continueranno a essere sottoposti a questo trattamento ad ampio spettro. Qualunque regime impiegato deve coprire C. trachomatis, N. gonorrhoeae, gli anaerobi, i bacilli gram-negativi e gli streptococchi 14. I programmi di screening per C. trachomatis devono quindi porsi come obiettivo l'individuazione e il trattamento di una percentuale significativa di infezioni asintomatiche per ridurre la morbilità associata alle infezioni da clamidia, nonché l'incidenza e la prevalenza dell infezione. Sebbene la sierologia non possa sostituire i metodi di rilevazione diretta di Chlamydia trachomatis, vi sono situazioni in cui può essere utile un test sierologico affidabile. Spesso le infezioni urogenitali dovute a questi batteri non sono clinicamente manifeste. Pertanto la ricerca degli anticorpi verso gli antigeni di C. trachomatis è utile per determinare se il paziente è già venuto in contatto con l agente infettivo. Ad esempio nei pazienti con infezione cronica in cui i batteri non sono più rilevabili a livello locale, un test sierologico positivo può costituire l'unica indicazione della presenza della Chlamydia 15. I test di microimmunofluorescenza (MIF) sono considerati il gold standard sierologico 20. È stato dimostrato che la metodica sierologica dei MIF è in grado di rilevare gli anticorpi di fase acuta contro C. trachomatis nelle pazienti affette da malattia infiammatoria pelvica (PID) con maggiore frequenza rispetto alla reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction, PCR) o rispetto alle colture tissutali su campioni di cervice e di uretra 17. Per rilevare la presenza di anticorpi verso C. trachomatis possono essere utilizzati numerosi altri test su siero umano, tra cui la fissazione del complemento, il saggio enzimoimmunologico (EIA) e il saggio radioimmunologico. Mentre gli antigeni utilizzati in questi test variano considerevolmente, tutti i test misurano gli anticorpi diretti verso i diversi determinanti antigenici delle specie Chlamydia. Nella maggior parte delle donne affette da malattia infiammatoria pelvica sono presenti anticorpi contro C. trachomatis, spesso a titolo elevato. Poiché gli anticorpi sierici persistono per molti anni dopo la fase acuta dell'infezione, è difficile impiegare i test sierologici nella diagnosi della PID acuta da Chamydia. Alcuni studi suggeriscono tuttavia che gli anticorpi specifici di breve durata della classe delle immunoglobuline A (IgA) possano costituire un potenziale marker di infezione attiva da Chlamydia 16. In uno studio 15, l'analisi Western blot di campioni sierici provenienti da donatori di sangue sani e da pazienti con infezione da C. trachomatis sono stati utilizzati per determinare le risposte anticorpali agli antigeni interi di C. trachomatis. I risultati dell'analisi Western blot hanno dimostrato che la risposta delle IgM sembrava limitata a un numero limitato di antigeni, mentre le IgA e le IgG in particolare riconoscevano un numero elevato di antigeni. L'analisi Western blot ha dimostrato che nei campioni provenienti dai pazienti infetti da C. trachomatis, le risposte IgG, IgM ed IgA agli antigeni interi di Chlamydia erano maggiori rispetto ai campioni ottenuti da donatori di sangue sani. I pazienti con infezione da C. trachomatis presentavano livelli significativamente più elevati di IgG contro LPS, MOMP, hsp60, e pgp3 nonché livelli più elevati di IgA contro LPS e MOMP rispetto ai donatori sani, se si esaminava la percentuale di soggetti con anticorpi sierici alle proteine sintetiche o agli antigeni ricombinanti. Il sistema di MIF per Chlamydia della Focus utilizza un ceppo di C. pneumoniae, due ceppi di C. psittaci e otto sierotipi (D K) di C. trachomatis. I corpi elementari delle clamidie sono stati trattati tramite una procedura brevettata per rimuovere l'lps, che altrimenti andrebbe ad interferire con il saggio, e risospesi in 3% di membrana vitellina di uovo di pollo per aumentare il contrasto di fondo. Ogni vetrino contiene dodici pozzetti e ciascuno dei pozzetti contiene quattro singoli spot. Ogni pozzetto contiene uno spot per ognuna delle tre diverse specie di clamidie analizzate nel kit più uno spot di controllo per la membrana vitellina. PRINCIPIO DEL TEST Il saggio di micro-immunofluorescenza (MIF) è un procedimento in due fasi, del tipo sandwich. Nella prima fase il siero del paziente viene diluito in PBS. Il siero diluito viene poi depositato negli appositi pozzetti sul vetrino, a contatto col substrato, e infine incubato. Successivamente all'incubazione il vetrino viene lavato in soluzione salina tamponata per rimuovere gli anticorpi del siero che non si sono legati. Nella seconda fase i pozzetti con gli antigeni vengono ricoperti con anticorpi fluorescinati anti-iga umane. Il vetrino viene poi incubato per consentire ai complessi antigene-anticorpo di reagire con gli anticorpi fluorescinati anti-iga. Dopo essere stato lavato, asciugato e montato, il vetrino viene esaminato usando un microscopio a fluorescenza. Le reazioni positive appaiono come EB fluorescenti, di un brillante verde-mela, con una matrice di membrana vitellina come fondo. I valori limite di titolazione, semiquantitativi, vengono ottenuti esaminando diluizioni seriali dei campioni positivi. MATERIALE INCLUSO Il kit della Focus Diagnostics contiene reagenti a sufficienza per effettuare 120 analisi. Vetrini con substrato per MIF anti-clamidia REF IF1201 Ag (Chlamydia MIF Substrate Slide) Dieci vetrini, ciascuno con dodici pozzetti. Ciascun pozzetto presenta quattro spot: uno come controllo della membrana vitellina e tre singoli spot di antigeni, che consistono di EB sospesi in una matrice di membrana vitellina. Conservare i pacchetti di vetrini sigillati a 2 8 C. In questo modo i vetrini sigillati rimangono stabili fino alla data riportata sull'etichetta dei pacchetti. Per evitare la condensa far riscaldare i vetrini a temperatura ambiente prima di aprire i pacchetti sigillati.
3 Pagina 3 Nota: La maggior parte dei microscopi a fluorescenza inverte l immagine del vetrino. Visti al microscopio gli antigeni appariranno come mostrato qui sotto. Coniugato per IgA-specie duplice, 3,5 ml REF IF1209 CONJ IgA (IgA Conjugate-Dual Species) Una boccetta di anticorpi fluorescinati di capra contro le IgA umane, specifiche per le catene alfa, mescolati con anticorpi fluorescinati di capra contro le IgG murine. Le IgG anti-topo sono state opportunamente standardizzate per fornire un controllo della specificità per gli antigeni. Contiene il colorante Evan's Blue, stabilizzatori di proteine e conservanti. Pronto per l'uso. Quando conservato a 2 8 C è stabile fino alla data riportata sull'etichetta. Non usare in caso di torbidità, decolorazione o altri segni di contaminazione batterica. Far riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. Controllo rilevabile polivalente, 0,30 ml REF IF1214 CONT > (Polyvalent Detectable Control) Una boccetta di anticorpi monoclonali murini preparata alla diluizione da usare nel saggio. Contiene conservanti. Quando conservato a 2 8 C è stabile fino alla data riportata sull'etichetta. Non usare in caso di torbidità, decolorazione o altri segni di contaminazione batterica. Far riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. Non pre-trattare o diluire. Controllo non rilevabile, 0,25 ml REF IF1213 CONT < (Non-Detectable Control) Una boccetta di siero umano preparata alla diluizione da usare nel saggio. Contiene conservanti. Quando conservato a 2 8 C è stabile fino alla data riportata sull'etichetta. Non usare in caso di torbidità, decolorazione o altri segni di contaminazione batterica. Far riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. Cicli ripetuti di congelamento e scongelamento sono deleteri e dovrebbero essere evitati. Non pre-trattare o diluire. Mezzo di montaggio, 2,5 ml REF IF0007 REAG MONT (Mounting Medium) Una bottiglia contagocce contenente glicerolo tamponato con PBS a ph 7,2 ± 0,1. Contiene conservanti. Se conservato a 2 8 C è stabile fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. Far riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. PBS REF IF0005 BUF (PBS) Una boccetta di fosfato tamponato salino (PBS) in polvere. Ricostituire in 1 litro di acqua distillata (o purificata). La soluzione così ottenuta è un tampone 0,01 M con ph 7,2 ± 0,1. Prima e dopo della ricostituzione conservare il PBS a 2 8 C. Far riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso. Non usare in caso di torbidità, decolorazione o altri segni di contaminazione batterica. MATERIALE RICHIESTO MA NON INCLUSO X 50 mm vetrini coprioggetto 2. Provette da test e relativi portaprovette, provette per microcentrifuga oppure piastre per microtitolazione per diluire il siero 3. Centrifuga clinica 4. Un incubatore o un bagnetto termostatato a C per incubare i vetrini 5. Un frigorifero a 2 8 C 6. Bottiglie di plastica per i lavaggi 7. Pipette calibrate o pipettatori del tipo "a pistone" con punte usa e getta. 8. Vaschetta di Coplin o piastra di colorazione per vetrini con il porta-vetrini 9. Beute o cilindri graduati puliti da 1 litro 10. Camera umida per l'incubazione dei vetrini 11. Acqua distillata o purificata 12. Timer 13. Carta assorbente per asciugare i vetrini 14. Microscopio a fluorescenza, parametri raccomandati Filtro eccitatore nm Filtro di sbarramento nm Sorgente luminosa HBO 100W, mercurio Obiettivo 20 40X, per fluorescenza, high dry AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Questo foglietto illustrativo è associato esclusivamente ai prodotti per l'esportazione e non è destinato alla distribuzione negli Stati Uniti. Al di fuori degli Stati Uniti la normativa che regola la distribuzione di questo prodotto ne prevede l'utilizzo per uso diagnostico in vitro. 2. Tutti i derivati del sangue devono essere maneggiati come potenzialmente infettivi. Il materiale di provenienza di questo prodotto (compreso i controlli) è stato analizzato, in conformità con i metodi approvati dall'fda, per la presenza di antigeni di superficie dell'epatite B, anticorpi per l'epatite C e per l'hiv-1/2 (AIDS), risultando negativo. Poiché nessun metodo di analisi può comunque fornire il 100% di garanzia che i derivati del sangue umano non trasmettano questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e le attrezzature che vengono in contatto con questi campioni, devono essere considerati come materiale potenzialmente infettivo e quindi da decontaminare dopo l'uso. Per questo materiale bisogna inoltre adoperare le procedure di raccolta e smaltimento specifiche per i materiali classificati come rischio biologico. Il CDC e gli istituti nazionali di salute suggeriscono che gli agenti potenzialmente contagiosi devono essere maneggiati al Livello 2 di Biosafety. 2,21,24 3. L' Evan's Blue è un agente cancerogeno. Evitare il contatto con occhi e pelle.
4 Pagina 4 4. Non sostituire o mescolare i reagenti di questo kit con quelli di altre partite o altre ditte. 5. Usare solo i protocolli descritti in questo opuscolo. Tempi di incubazione o temperature diversi da quelli indicati possono determinare risultati erronei. 6. La contaminazione crociata dei campioni di pazienti su un vetrino può determinare dei risultati erronei. Quindi, dopo aver depositato ogni campione, maneggiare il vetrino con cura per evitare il mescolamento con i sieri già presenti negli altri pozzetti o quelli che ancora devono essere caricati. 7. La contaminazione batterica dei campioni di siero o dei reagenti può provocare dei risultati erronei. Lavorare in condizioni sterili per evitare la contaminazione da microbi. 8. Effettuare il saggio a temperatura ambiente (approssimativamente compresa tra 20 e 25 C). 9. Utilizzare tecniche di pipettamento appropriate, mantenendo il medesimo set di pipette durante tutta la procedura, al fine di assicurare risultati ottimali e riproducibili. 10. Il Mezzo di Montaggio contiene una percentuale di glicerolo compresa tra 30 e 60% che può causare irritazione in caso di inalazione o di contatto con la pelle. In caso di inalazione o di contatto, prendere le misure di primo soccorso. DURATA E USO 1. I kit sono stabili fino alla fine del mese indicato sulla data di scadenza se conservati alla temperatura di 2 8 C. 2. Non usare il kit o i singoli reagenti dopo la data di scadenza. 3. Non esporre i reagenti ad una forte sorgente luminosa durante la conservazione o l'incubazione. 4. Prima dell uso, riscaldare i reagenti a temperatura ambiente. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il tipo di campione da usare preferibilmente è il siero. Non è stato fatto alcun tentativo per stabilire la compatibilità di questo saggio con altri tipi di campione. Risultati erronei possono derivare dall'uso di sieri iperlipemici, inattivati al calore, emolizzati o contaminati, che devono quindi essere evitati. Raccolta e manipolazione del campione Raccogliere i campioni di sangue in asepsi utilizzando tecniche autorizzate di prelievo venoso effettuate da personale qualificato. 21 Lasciare coagulare i campioni di sangue a temperatura ambiente prima della centrifugazione. In asepsi, trasferire il siero in un contenitore sterile a chiusura ermetica per la conservazione a 2 8 C. Se il test viene effettuato dopo oltre 5 giorni, congelare il campione ad almeno 20 C. Prima dell'uso scongelare e miscelare con cura i campioni. Preparazione del campione Per il test il siero va portato ad una diluizione di 1:16 usando PBS. Per determinare i valori limite di titolazione, usare il PBS per preparare le diluizioni seriali delle diluizioni usate per il test. PROTOCOLLO DEL TEST (Incubazione a 37 C) 1. Rimuovere i vetrini dal frigorifero. Prima di aprire i pacchetti attendere che i vetrini raggiungano la temperatura ambiente per evitare la condensa. 2. Depositare 25 µl del Controllo rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, nell'apposito pozzetto sul vetrino. 3. Depositare 25 µl del Controllo non rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, nell'apposito pozzetto sul vetrino. 4. Aggiungere negli appositi pozzetti sul vetrino circa 25 µl di campione diluito (vedi sopra: Preparazione del campione) per ogni siero di paziente da analizzare. Usare un sistema di notazioni per identificare i vari pozzetti al momento di leggere i risultati. 5. Incubare il/i vetrino/i in camera umida per 30 ± 2 minuti a C. 6. Rimuovere i vetrini dalla camera umida e sciacquarli delicatamente, facendo scorrere del PBS su un vetrino alla volta, badando bene a non versare il PBS direttamente sui pozzetti. Sciacquare una fila alla volta per evitare il mescolamento dei campioni. Lavare poi i vetrini immergendoli per 10 minuti in vaschette di Coplin o in vaschette di colorazione per vetrini contenenti PBS. 7. Immergere brevemente i vetrini lavati in acqua distillata o purificata, poi farli asciugare all'aria. 8. Aggiungere circa 25 µl di Coniugato per IgA-specie duplice in ogni pozzetto sul vetrino. 9. Incubare i vetrini in camera umida per 30 ± 2 minuti a C. 10. Ripetere le fasi di lavaggio 6 e Mettere qualche goccia del Mezzo di montaggio sul vetrino e coprire con un vetrino copri -oggetto di 24 X 50 mm. Eliminare eventuali bolle d'aria e l'eccesso di mezzo di montaggio usando la carta assorbente. 12. Guardare i pozzetti ad un ingrandimento finale di 400X con un microscopio a fluorescenza adeguatamente equipaggiato. Leggere i vetrini lo stesso giorno in cui si effettua il saggio per un risultato di fluorescenza ottimale. Se questo non fosse possibile, i vetrini si possono conservare al buio a 2 8 C fino a 24 ore. PROTOCOLLO DEL TEST (Incubazione a temperature ambiente) 1. Rimuovere i vetrini dal frigorifero. Prima di aprire i pacchetti attendere che i vetrini raggiungano la temperatura ambiente per evitare la condensa. 2. Depositare 25 µl del Controllo rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, nell'apposito pozzetto sul vetrino. 3. Depositare 25 µl del Controllo non rilevabile, prelevandolo direttamente dalla boccetta, nell'apposito pozzetto sul vetrino. 4. Aggiungere negli appositi pozzetti sul vetrino circa 25 µl di campione diluito (vedi sopra: Preparazione del campione) per ogni siero di paziente da analizzare. Usare un sistema di notazioni per identificare i vari pozzetti al momento di leggere i risultati. 5. Incubare i vetrini coperti per 60 ± 2 minuti a temperatura ambiente. 6. Rimuovere i vetrini dalla camera umida e sciacquarli delicatamente, facendo scorrere del PBS su un vetrino alla volta, badando bene a non versare il PBS direttamente sui pozzetti. Sciacquare una fila alla volta per evitare il mescolamento dei campioni. Lavare poi i vetrini immergendoli per 10 minuti in vaschette di Coplin o in vaschette di colorazione per vetrini contenenti PBS. 7. Immergere brevemente i vetrini lavati in acqua distillata o purificata, poi farli asciugare all'aria. Nota: se si utilizza uno strumento per automatizzare il processo di lavaggio è possibile che non ci sia tempo sufficiente per asciugare i vetrini all aria prima di aggiungere il coniugato. 8. Aggiungere circa 25 µl di Coniugato per IgA-specie duplice in ogni pozzetto sul vetrino. 9. Incubare i vetrini coperti per 30 ± 2 minuti a temperatura ambiente. 10. Ripetere le fasi di lavaggio 6 e Mettere qualche goccia del Mezzo di montaggio sul vetrino e coprire con un vetrino copri -oggetto di 24 X 50 mm. Eliminare eventuali bolle d'aria e l'eccesso di mezzo di montaggio usando la carta assorbente. 12. Guardare i pozzetti ad un ingrandimento finale di 400X con un microscopio a fluorescenza adeguatamente equipaggiato. Leggere i vetrini lo stesso giorno in cui si effettua il saggio per un risultato di fluorescenza ottimale. Se questo non fosse possibile, i vetrini si possono conservare al buio a 2 8 C fino a 24 ore. CONTROLLO DI QUALITÀ Ogni analisi (ogni volta che si tratta un vetrino o un gruppo di vetrini) dovrebbe includere entrambi i controlli, quello rilevabile e quello non rilevabile.
5 Pagina 5 Validità del saggio 1. Il controllo rilevabile dovrebbe mostrare una fluorescenza da 2+ a 4+ con corpi elementari e reagire in maniera trascurabile con il controllo della membrana vitellina. 2. Il controllo non rilevabile non deve mostrare alcuna reattività con i corpi elementari. Se i controlli non mostrano questi risultati, non bisogna considerare validi i risultati del test del paziente e bisogna ripetere il saggio. I controlli rilevabile e non rilevabile servono a individuare il mancato funzionamento dei reagenti. Il controllo rilevabile è stato fatto utilizzando anticorpi di topo e non umani. Il controllo rilevabile assicura soltanto la funzionalità dei reagenti. Possono essere testati controlli aggiuntivi, in accordo con le linee guida o le esigenze locali, statali e/o federali o delle organizzazioni accreditate. Validità del campione Fluorescenza di fondo. Occasionalmente un campione può reagire con la membrana vitellina che funge da mezzo di risospensione. Quando questo succede il saggio non sarà interpretabile se il titolo degli anticorpi contro la membrana vitellina risulta superiore o uguale al titolo degli anticorpi anti-clamidia. Tale reazione può essere confermata esaminando lo spot di controllo per la membrana vitellina. Se questo spot è fluorescente, significa che c'è reattività aspecifica (non-clamidia). Continuare ad esaminare tutte le diluizioni del siero dei pazienti. Se il titolo degli anticorpi anti-membrana vitellina risulta superiore o uguale ad ogni titolo di anticorpi anti-clamidia il risultato non è interpretabile e non dovrebbe essere refertato. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST I valori limite di titolazione e l'intensità della fluorescenza saranno determinati, nel complesso, dall'ottica del microscopio e dalle condizioni e tipo della sorgente luminosa. Per essere sicuri di ottenere un'interpretazione corretta dei risultati si raccomanda in ogni esperimento di leggere l'intensità di fluorescenza dei pozzetti di controllo prima di quella di tutti gli altri pozzetti. Lettura dei vetrini Leggere l'intensità della fluorescenza dei corpi elementari (vedere la nota qui sotto su Corpi elementari vs particelle fluorescenti verdi) e attribuirle i seguenti valori: da 2 a Fluorescenza verde-mela da moderata a intensa. Fluorescenza netta, ma debole. Negativo Nessuna fluorescenza oppure intensità di fluorescenza uguale a quella osservata nello spot corrispondente al controllo della membrana vitellina o nel pozzetto del controllo non rilevabile. Corpi elementari vs particelle fluorescenti verdi. Leggere solo la fluorescenza dei corpi elementari. La dimensione dei corpi elementari è costante e la loro densità di distribuzione è uniforme in tutta la zona della colorazione antigenica. Particelle fluorescenti verdi irregolari e a distribuzione non uniforme, se presenti, non devono essere interpretate come reattività positiva. Interpretazione dei risultati con i campioni dei pazienti Il valore limite di titolazione è definito come il reciproco della più alta diluizione del siero che mostra una netta (1+) fluorescenza verde mela. A diluizioni più basse, i campioni possono reagire in maniera incrociata con tutte e tre le specie di clamidia. È necessario diluire in maniera seriale il campione fino al valore limite di titolazione, al fine di determinare la specie primaria di clamidia che scatena la risposta immunitaria predominante. Per facilitare la diagnosi, si devono combinare risultati sierologici con le evidenze cliniche. 1:16 Un singolo campione con un titolo sierico finale di IgA anti C. trachomatis 1:16 deve essere considerato come prova che l'infezione è avvenuta in un momento imprecisato. Un'interpretazione più approfondita dipenderà dalla presentazione clinica del paziente e dai risultati relativi alle IgG e alle IgM. Titoli elevati di IgA in assenza di titoli rilevabili di IgM possono indicare una reinfezione o un'infezione cronica; viceversa titoli positivi di IgA in presenza di titoli positivi di IgM possono indicare un''infezione primaria. <1:16 Mancata rilevazione di anticorpi IgA. Reattività intra-genere I MOMP di Chlamydia contengono antigeni specie- e genere-specifici, e sono possibili reazioni crociate sierologiche tanto nelle fasi acute quanto nella fase di convalescenza. Gli spot per C. psittaci e C. trachomatis, utilizzati come controlli di speciazione della Chlamydia, sono intesi come ausilio per interpretare la specificità della reazione sierologica a C. pneumoniae. Quando si osservano reazioni crociate, la specificità della risposta immunitaria deve essere interpretata con cautela. Nella maggior parte dei casi una reazione specifica per la C. pneumoniae avrà titoli di endpoint almeno doppi rispetto ai titoli osservati negli altri due punti degli antigeni della clamidia. Per determinare se la C. pneumoniae produce la risposta immunitaria predominante, occorre procedere alla diluizione seriale dei campioni, al fine di ottenerne il titolo. Associare i risultati sierologici con l'evidenza clinica come supporto diagnostico. Gli spot per C. psittaci e C. pneumoniae, utilizzati come controlli di speciazione della Chlamydia, sono intesi come ausilio per interpretare la specificità della reazione sierologica a C. trachomatis. Quando si osservano reazioni crociate, la specificità della risposta immunitaria deve essere interpretata con cautela. Nella maggior parte dei casi, una reazione specifica verso C. trachomatis presenterà titoli di due o più volte superiore ai titoli osservati con gli altri due spot per Chlamydia. Per determinare se la C. trachomatis produce la risposta immunitaria predominante, occorre procedere alla diluizione seriale dei campioni, al fine di ottenerne il titolo. Associare i risultati sierologici con l'evidenza clinica come supporto diagnostico. LIMITAZIONI 1. L interpretazione dei risultati delle IgA dipende dalle condizioni del paziente: è estremamente importante che tutti i risultati della sierologia vengano correlati con i precedenti clinici e tutti gli altri dati a disposizione del medico curante. 2. L esecuzione di questo saggio non è intesa per la popolazione totale, pediatrica e geriatrica. 3. L esecuzione di questo saggio non è intesa per campioni diversi dal siero. Analizzare esclusivamente i tipi di campioni indicati. 4. L esecuzione di questo saggio non è intesa per il monitoraggio della terapia. 5. Un risultato negativo non esclude la presenza di un'infezione attiva. È stata riportata infatti l assenza di anticorpi in colture cellulari da persone positive. Questa è una situazione rara negli adulti, ma può verificarsi più comunemente nei bambini. Talvolta campioni prelevati troppo presto durante l infezione primaria possono non contenere anticorpi rilevabili. Se si sospetta un infezione da clamidie, è necessario prelevare un secondo campione da 10 a 21 giorni più tardi e testarlo in parallelo al campione originale. 6. Lo spot relativo a C. psittaci comprende due ceppi di C. psittaci (pappagallo e parrocchetto), ma non comprende tutti i ceppi di C. psittaci. Di conseguenza, non tutte le infezioni possono essere rilevate. Comunque, solo pochi casi di psittacosi sono stati riportati (solitamente <50 ogni anno negli U.S.), e la maggior parte dei casi sono dovuti a ceppi derivati da pappagallo o parrocchetto. Sieri da casi sospetti di psittacosi devono essere controllati anche mediante test CF allo scopo di rilevare antigeni specifici ad un gruppo di clamidie. 7. Il valore predittivo di un risultato positivo o negativo dipendono dalla prevalenza della popolazione e dalla probabilità precedentemente testata di un infezione. 8. Nel corso di un'infezione da Chlamydia la risposta anticorpale può dare una reazione crociata con diverse specie di Chlamydia. La reazione crociata può verificarsi anche per l'esposizione a più di una specie di Chlamydia.
6 Pagina 6 9. È possibile la rilevazione di anticorpi specie-specifici dovuti a una precedente esposizione o alla cross-reattività da infezioni da altre specie di Chlamydia. 10. I risultati sierologici non possono essere utilizzati per determinare il sito dell'infezione. 11. In un soggetto con infezione da clamidia i test sierologici possono essere negativi a causa della differenza immunogenetica dei ceppi nella sede delle infezioni. VALORI ATTESI Circa il 40-60% della popolazione mondiale adulta possiede anticorpi contro C. pneumoniae; ciò suggerisce che l infezione è straordinariamente predominante e la re-infezione è comune 22. Negli Stati Uniti i casi riportati di infezione da C. psittaci sono solitamente meno di 50 ogni anno, con 16 casi riportati nel Sono state identificate fonti di infezione umana da C. psittaci oltre agli uccelli infetti e potrebbero essere più comuni di quanto si pensi oggi 22. La diffusione di infezioni da C.trachomatis in donne adolescenti solitamente supera il 10% e in alcune popolazioni può raggiungere il 40%. LE CARATTERISTICHE DI ESECUZIONE Per la vendita fuori dagli Stati Uniti, le caratteristiche di perfomance del prodotto sono fornite in un foglio a parte. BIBLIOGRAFIA 1. Schacter, J Chlamydiae (Psittacosis-Lymphogranuloma Venereum-Trachoma Group), In E. Lennette, A. Balows, W. Hausler, and H. Shadomy (ed.), Manual of Clinical Microbiology 4ed, ASM Press, Washington, D.C. 2. Smith, T Chlamydia, In N. Schmidt and R. Emmons (ed.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections 6th ed, APHA, Washington, D.C. 3. Black CM. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin Microbiol Rev Jan; 10(1): La Scolea, L The Value of Non-culture Chlamydial Diagnostic Tests. Clin. Micro. News Letter 13: Shor, A., C.C. Kuo, and D.L. 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