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1 BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Edizione 20/04/2013 Solo per uso professionale TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant è un test immunoenzimatico qualitativo/quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma umano degli anticorpi di classe IgG specifici verso la proteina CagA del batterio Helicobacter pylori. SIGNIFICATO CLINICO Nel 1983 Warren e Marshall identificarono, in pazienti affetti da gastrite, un nuovo patogeno batterico gram-negativo che fu denominato Helicobacter Pylori. In seguito sono stati eseguiti diversi studi allo scopo di chiarire il rapporto tra l infezione batterica e patologie gastriche croniche. E stato dimostrato che il patogeno è associato all ulcera peptica, alla gastrite cronica di tipo B ed alla duodenite. Inoltre è stato dimostrato che, in pazienti affetti da gastrite, l eliminazione del batterio portava alla guarigione della lesione anatomica. Le procedure diagnostiche dirette alla rilevazione dell organismo e della patologia gastrica prevedono normalmente delle tecniche invasive (gastroscopia), tuttavia si può osservare nel paziente infetto una risposta immuno-specifica. Il test sierologico rappresenta quindi un metodo alternativo, rapido e semplice rispetto alla tecnica bioptica.numerosi studi hanno evidenziato che la concentrazione delle IgG anti Helicobacter pylori, anche se nella fase iniziale può non correlare con la severità della malattia, gioca un ruolo importante nella fase successiva di monitoraggio del trattamento terapeutico. Oltre alle IgG anche le IgA possono essere presenti e la loro rilevazione può essere di ausilio per dirimere i casi dove la determinazione delle IgG ha dato valori dubbi. Recentemente numerosi studi hanno evidenziato la correlazione tra proteine ad alto peso molecolare ( KDa ) codificate dal gene CagA ed un maggior rischio di sviluppare cancro allo stomaco ed ulcere duodenali. Pertanto la determinazione delle IgG anti-caga si rivela un test sicuramente molto sensibile per diagnosticare tali patologie. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant è un dosaggio immunoenzimatico in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con l antigene CagA ricombinante dell Helicobacter pylori. I campioni da esaminare vengono incubati nei micropozzetti; le IgG del Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

3 campione si legano formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgG anti-caga Helicobacter pylori viene rilevata attraverso il legame con un anticorpo monoclonale anti-igg umane coniugato con perossidasi. Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato, viene aggiunto il substrato-tmb che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente proporzionale alla quantità di IgG specifiche presenti nel campione in esame. Nel kit BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant la concentrazione degli anticorpi di classe IgG viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione ed espressa in UA/mL. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CAL 0 B Calibratore 0 (0 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibratore 1 ( 10 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibratore 2 ( 20 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibratore 3 ( 60 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibratore 4 ( 120 UA/mL) 1 x 2 ml CONTROL - D Controllo Negativo Liofilo 1 CONTROL + E Controlo Positivo Liofilo 1 DIL SPE F Diluente Campioni BEIA System 1 x 120 ml BUF WASH 20X G Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml CONJ H Coniugato 1 x 13,5 ml SUBS TMB I Substrato-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 J Soluzione Stoppante 1 x 25 ml Istruzioni per l uso 1 Quality Control Data Sheet 1 Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

4 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con antigene CagA ricombinante Helicobacter pylori, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. B. Calibratore 0 UA/ml Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-caga Helicobacter pylori. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. C. Calibratori 10,20,60 e 120 UA/mL Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti-caga Helicobacter pylori. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagenti pronto all uso. D. Controllo negativo Siero umano liofilizzato, negativo per anticorpi IgG anti-caga Helicobacter pylori. Contiene 1,6 % p/p di sodio azide come conservante. Vedere preparazione dei reagenti. E. Controllo positivo Siero umano liofilizzato, positivo per anticorpi IgG anti-caga Helicobacter pylori. Contiene 1,6 % p/p di sodio azide come conservante. Vedere preparazione dei reagenti. F. Diluente Campioni BEIA System Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso. G. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti. H. Coniugato Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-igg umane, marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso. I. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. J. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

5 MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Evitare l'essiccamento dei micropozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

6 AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a - 20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. Controllo negativo e Controllo positivo Ricostituire i controlli con 0,5 ml di acqua distillata ed attendere 30 minuti prima dell utilizzo. Agitare molto dolcemente per favorire la dissoluzione del liofilo. Il controllo cosi ricostituito è equiparabile ad un campione e deve essre diluito come tale. I valori attesi dei due controlli sono riportati sul Quality Control Data Sheet. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

7 I controlli cosi ricostituiti sono stabili 15 giorni a 2-8 C; per periodi oltre le due settimane di utilizzo si consiglia di frazionare il controllo ricostituito e di congelare a 20 C. CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire (1:81) i campioni in esame ed i Controlli con il Diluente Campioni BEIA System (esempio 10 µl di siero e 800 µl di Diluente Campioni BEIA System). Agitare su Vortex. 2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame, dei Controlli e dei Calibratori (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. 3. Quantitativo: Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero prediluito in esame, dei Controlli prediluiti e dei Calibratori. Qualitativo : Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero prediluito in esame, dei Controlli prediluiti, del Calibratore 0 (0 UA/mL), del Calibratore 1 (10 UA/mL) e del Calibratore 4 (120 UA/mL) 4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Coniugato. 7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

8 9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (120 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere > 5.0 il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere < 0.3 i valori dei sieri di controllo negativo e positivo devono rientrare nel range riportato sul Quality Control Data Sheet Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. CALCOLO QUANTITATIVO DEI RISULTATI Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore, controlli e campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del 20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle densità ottiche di ogni calibratore sull asse delle ordinate e le corrispondenti concentrazioni sull asse delle ascisse. Disegnare la migliore curva che passi attraverso i punti della calibrazione. Per calcolare la concentrazione di IgG anti-caga Helicobacter pylori di ogni campione riportare il valore della densità ottica sull asse delle ordinate e collegare con una linea retta alla curva di calibrazione. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

9 Al punto di intersezione, collegare con una linea verticale all asse delle ascisse e leggere il corrispondente valore di IgG anti-caga Helicobacter pylori. Qualora si disponesse di un sistema di calcolo automatico si consiglia di utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche: spline cubica, iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall utilizzatore. Esempio di calcolo con interpolazione spline cubica: Calibratori UA/mL Densità Ottica UA/mL Cal 0 0 0,061 Cal ,306 Cal ,575 Cal ,564 Cal ,404 Controllo negativo 0,089 1,2 Controllo positivo 0,827 29,3 Campione A 0,102 1,7 Campione B 0,784 27,7 Campione C 2,035 88,5 CALCOLO QUALITATIVO DEI RISULTATI Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l index anticorpale (I.A.) con la seguente formula: DO campione Index Anticorpale (I.A.) = DO Calibratore 1 (10 UA/mL) Per il Calibratore 1 (10 UA/mL) calcolare, se eseguito in multiplo, il valore medio di densità ottica (mdo). I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

10 Esempio di calcolo: 1ª DO 2ª DO mdo I.A. Calibratore 0 (0 UA/mL) 0,071 0,051 0,061 0,20 Calibratore 1 (10 UA/mL) 0,298 0,315 0,306 Calibratore 4 (120 UA/mL) 2,413 2,394 2,404 7,85 Controllo negativo 0,080 0,098 0,089 0,29 Controllo positivo 0,838 0,817 0,827 2,70 Campione A 0,096 0,108 0,102 0,33 Campione B 0,755 0,813 0,784 2,56 Campione C 2,039 2,030 2,035 6,65 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: Metodo Qualitativo I.A. Metodo Quantitativo UA/mL INTERPRETAZIONE > 1,1 > 11,5 0,9 8,5 0,9 1,1 8,5 11,5 Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-caga Helicobacter pylori Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-caga Helicobacter pylori ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-caga Helicobacter pylori Va tenuto presente che: - il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo; Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

11 - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili; - dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello; - risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le prestazioni del kit BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant nei confronti di un kit già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA Helicobacter pylori Cag A IgG). BEIA Helicobacter p. CagA IgG Quant EIA Helicobacter p. CagA IgG Da questi dati si ottiene: Sensibilità relativa 87,8% Specificità relativa 95,3% Concordanza 93,9% LIMITE DI RILEVAZIONE Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di rilevazione in 0,60 UA/mL. SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, fino a 1 mg/ml di bilirubina e fino a 30 mg/ml di trioleina. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

12 RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione negativo con concentrazione < 3 UA/mL e due campioni positivi a due concentrazioni circa 30 UA/mL e 90 UA/mL. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse per l intra-saggio ed 1 replicato per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse per l inter-saggio. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20 % per il campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi. LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche. PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

13 SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi e portarli a temperatura ambiente. Diluire i campioni ed i controlli 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System Metodo Qualitativo 100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 1 (10 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 4 (120 UA/mL) in doppio 100 L di controlli prediluiti in singolo o doppio, 100 L di campioni prediluiti in singolo o doppio, Metodo Quantitativo 100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 1 (10 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 2 (20 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 3 (60 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 4 (120 UA/mL) in doppio 100 L di controlli prediluiti in singolo o doppio, 100 L di campioni prediluiti in singolo o doppio, Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm Test qualitativo Test quantitativo Qualitativo 2 3 Quantitativo 2 3 A Cal 0 P1 A Cal 0 Cal 4 B Cal 0 P2 B Cal 0 Cal 4 C Cal 1 P3 C Cal 1 CN D Cal 1 D Cal 1 CP E Cal 4 E Cal 2 P1 F Cal 4 F Cal 2 P2 G CN G Cal 3 P3 H CP H Cal 3. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

14 BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Version 20/04/2013 For professional use only TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

15 INTENDED USE The BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant kit is a qualitative/quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to Helicobacter pylori CagA protein, in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE In 1983 Warren and Marshall identified, in patients with gastric disease, a new gram-negative pathogenous bacterium, which was denominated Helicobacter pylori. Afterwards many works were carried out to correlate the bacterial infection with the gastric disease. It has been demonstrated that the Helicobacter pylori infection is related with peptic ulcer, type B chronic gastritis and duodenitis. Moreover it has been demonstrated that, in patients with gastric disease, the bacterium eradication gave the recovery from the anatomic lesion. The microrganism can be isolated and diagnosed with invasive techniques (gastroscopy); it is possible to diagnose the infection with a serologic assay as it has been observed an immunospecific answer by the microrganism. Many studies have pointed out that the IgG and/or IgA antibodies concentration is a predective value to diagnose the Helicobacter pylori infection. Moreover it has been demonstrated that the IgG and IgA fall significantly after successful antibacterial therapy. Recently it has been demonstrated the correlation between the presence of antibodies to proteins with high molecular weight ( kda ), expressed by the gene CagA, and pathologic states like duodenal ulcer and gastric cancer. So the IgG anti-caga determination is a sensitive test to point out these pathologies. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant kit is a quantitative enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG antibodies to Helicobacter pylori CagA, in human serum or plasma. During the first incubation, only anti-helicobacter pylori CagA specific antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the Helicobacter pylori CagA recombinant antigen. After the first incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components. During the second incubation a monoclonal antibody Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

16 anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is added. After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgG anti-caga Helicobacter pylori concentration in the patient samples. With the BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant kit the concentration of IgG antibodies is calculated by a calibration curve expressed in Arbitrary Units/mL ( AU/mL). KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CAL 0 B Calibrator 0 (0 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibrator 1 ( 10 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibrator 2 ( 20 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibrator 3 ( 60 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibrator 4 ( 120 AU/mL) 1 x 2 ml CONTROL - D Negative Control Liophilized 1 CONTROL + E Positive Control Liophilized 1 DIL SPE F Sample Diluent BEIA System 1 x 120 ml BUF WASH 20X G Wash Buffer 1 x 100 ml CONJ H Conjugate 1 x 13,5 ml SUBS TMB I Substrate-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 J Stop Solution 1 x 25 ml Package Insert 1 Quality Control Data Sheet 1 A. Coated strips Breakable strips coated with CagA recombinant Helicobacter pylori antigen, packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

17 B. Calibrator 0 AU/mL Negative human serum for IgG antibodies anti-caga Helicobacter pylori. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. C. Calibrators AU/mL Human serum, containing IgG antibodies anti-caga Helicobacter with different known concentrations. Contain 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. D. Negative Control Lyophilized human serum, negative for IgG antibodies to CagA Helicobacter pylori. Contains 1,6 % w/w of Sodium azide as preservative. See Preparation of reagents. E. Positive Control Lyophilized human serum, positive for IgG antibodies to CagA Helicobacter pylori. Contains 1,6 % w/w of Sodium azide as preservative. See Preparation of reagents. F. Sample Diluent BEIA System Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent G. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di Kathon CG and Tween 20. See Preparation of reagents. H. Conjugate Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. I. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered solution. Contains pink dye. Ready to use reagent. J. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

18 INTERCHANGEABLE REAGENTS The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all BEIA kits. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

19 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See assay protocol. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. Negative Control and Positive Control Reconstitute the controls with 0,5 ml of distilled water and wait 30 minutes before the use. Mix slowly to favourite the reconstitution of the controls. The controls, after reconstitution, are like to samples and must be processed at the same way and so must be diluted before using. The expected values are reported in the Quality Control Data Sheet. The reconstituted controls are stable 15 days at 2-8 C; for longer period it is suggested to aliquote the controls and store at 20 C. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

20 WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples and controls to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent BEIA System (i.e. 10 µl of serum and 800 µl of Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed, controls and the Calibrators (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 3. Quantitative: Dispense 100 µl of each Calibrator and of the diluted samples and controls. Qualitative: Dispense 100 µl Calibrator 0 (0 AU/mL), Calibrator 1 (10 AU/mL), Calibrator 4 (120 AU/mL) and of the diluted samples and controls. 4. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 7. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 8. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 9. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 10. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 12. Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

21 CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The ratio of the OD for Calibrator 4 (120 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be > 5.0 The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be < 0.3 Control negative and positive values must fall inside the range reported in the Quality Control Data Sheet If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. QUANTITATIVE CALCULATION OF RESULTS Calculate the average O.D. values for each set of duplicate calibrators, controls and samples (duplicates should have a CV < 20%). Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each calibrator concentration on the ordinate against the IgG anti-caga Helicobacter pylori concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the points of the graph. To determine the concentration of IgG anti-caga Helicobacter pylori for each sample, first find the O.D. value on the ordinate and extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the corrisponding IgG anti-caga Helicobacter pylori concentration. If an automated processor is available it s advise to select among the following curve fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line. The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Example of calculation with cubic spline fit: Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

22 Calibrators AU/mL O.D. AU/mL Cal Cal Cal Cal Cal Negative control Positive control Sample A Sample B Sample C QUALITATIVE CALCULATION OF RESULTS In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using the following formula: O.D. sample Antibody Index (A. I.) = O.D. Calibrator 1 (10 AU/mL) For the Calibrator 1 (10 AU/mL) calculate, if assayed in duplicate, the mean OD value (mod). The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. 1 st O.D. 2 nd O.D. mo.d. A.I. Calibrator 0 (0 AU/mL) Calibrator 1 (10 AU/mL) Calibrator 4 (120 AU/mL) Negative control Positive control Sample A Sample B Sample C Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

23 INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: QUALITATIVE A.I. QUANTITATIVE AU/mL > 1.1 > 11.5 < INTERPRETATION Sample should be considered POSITIVE for the presence of anti- CagA Helicobacter pylori IgG antibodies. Sample should be considered NEGATIVE for the presence of anti- CagA Helicobacter pylori IgG antibodies. GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for the presence of anti-caga Helicobacter pylori IgG antibodies. Please consider that: - the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; - discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests; - results within grey zone should be made clear: re-testing the same sample; testing a sample from another collection from the same patient; comparing the results with those of a reference test. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

24 PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. SPECIFICITY AND SENSITIVITY The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing the BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant results versus an established EIA commercial kit (EIA Helicobacter pylori CagA IgG) with acceptable performances. BEIA Helicobacter p. CagA IgG Quant EIA Helicobacter p. CagA IgG From which the following table can be calculated: Relative Sensitivity 87.8% Relative Specificity 95.3% Agreement 93,9% DETECTION LIMIT: Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection limit in 0.60 AU/mL. ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with hemoglobin up to 10 mg/ml, bilirubin up to 1 mg/ml, triolein up to 30 mg/ml. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

25 REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined using one negative sample with concentration < 3 AU/mL and two positive samples, containing different concentration : about 30 AU/mL and 90 AU/mL. These samples were tested 6 times for single run in 12 different analytical runs for the withinrun and 1 time for single run in 12 different analytical runs for the run-to-run. Coefficients of variation lower than 20% have been obtained for the negative sample and 10% for the two positive samples. LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific IgG. GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HbsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

26 SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents and take them at room temperature. Pre-dilute samples and controls 1:81 with Sample Diluent BEIA system Dispense: Qualitative Test 100 L of Calibrator 0 (0 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 1 (10 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 4 (120 AU/mL) in duplicate 100 L of pre-diluted controls in single or duplicate 100 L of pre-diluted samples in single or duplicate Quantitative Test 100 L of Calibrator 0 (0 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 1 (10 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 2 (20 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 3 (60 AU/mL) in duplicate 100 L of Calibrator 4 (120 AU/mL) in duplicate 100 L of pre-diluted controls in single or duplicate 100 L of pre-diluted samples in single or duplicate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Conjugate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm Qualitative Test Quantitative Test Qualitative 2 3 Quantitative 2 3 A Cal 0 P1 A Cal 0 Cal 4 B Cal 0 P2 B Cal 0 Cal 4 C Cal 1 P3 C Cal 1 NC D Cal 1 D Cal 1 PC E Cal 4 E Cal 2 P1 F Cal 4 F Cal 2 P2 G NC G Cal 3 P3 H PC H Cal 3. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

27 REFERENCE - BIBLIOGRAFIA - Warren J.R. & Marshall B. ( 1983 ) Lancet : Johnson B.J. et al. ( 1986 ) Gut 27, Rathbone B.J. et al. ( 1986 ) Gut 27, Mitchell H.M. ( 1988 ) Medical J. Australia 149, Goodwin C.S. ( 1988 ) Lancet : Goodwin C.S. et al. ( 1989 ) Int. J. Syst. Bacteriol. 39 : Wyatt J.L. et al. ( 1989 ) Scand. J. Gastroenter. 24 ( Sup 160 ) : Loffield RJLF et al. ( 1989 ) Lancet : Forman D. et al. ( 1990 ) Int. J. Cancer 46 : Nomura A. et al. ( 1991 ) N. Engl. J. Med. 325 : Seppala K.M. et al. ( 1992 ) Scand. J. Gastroenter. 27 : Kosunen T.U. et al. ( 1992 ) Lancet 339 : Tee W. et al. ( 1995 ) J. Clin. Microbiol. 33 (5) : Cover T.L. et al. ( 1995 ) J. Clin. Microbiol. 33 ( 6 ) : Wilcon M.H. et al. ( 1996 ) J. Clinical Pathology 49 : Ching C.K. ( 1996 ) Am. J. Gastroenter. 91 (5) : Stephens J.C. et al. ( 1996 ) J. Immunologicals Methods 190: Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013

28 FRASI R E S / R-PHRASES S-PRHASES Soluzione Stoppante / Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle; Irritating to eyes and skin. S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. Controlli /Controls (Council Directive 88/379/EEC) R25 Tossico per ingestione. Toxic if swallowed. Giftig beim Verschlucken. Toxique par ingestion. Tóxico por ingestión R32 A contatto con acidi libera gas altamente tossici. Contact with acids liberates very toxic gas. ntwickelt bei Kontakt mit Saeure sehr giftige Gase. Au contact d'un acide, degage un gaz très toxique. En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos R52 Nocivo per gli organismi acquatici. Harmful to aquatic organisms. Schädlich für Wasserorganismen. Nocif pour les organismes aquatiques. Nocivo para los organismos acuáticos. R53 Può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. May cause long-term adverse effects in the aquatic environment. Kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkung haben. Peut entraîner des effets néfastes à long terme pour l'environnement aquatique. Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. S28 In caso di contatto con la pelle lavare immediatamente e abbondantemente con acqua. In case of contact with skin, rinse immediately with plenty of water. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser. En cas de contact avec la peux, laver immediatement avec beaucoup d'eau. En caso de contacto con la piel, lávase immediatamente y abundantemente con agua S45 In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrare l'etichetta). In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible). Bei Unfall oder Unwohlsein sofort den Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). En cas d'accident ou de malaise, consulter immediatement un medicin (si possible lui montrer l'etichette). En caso de accidentes o malestar consultar inmediatamente al médico(si es posible, muéstrele la etiqueta) S60 Questo materiale ed il suo contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. This material and its container must be disposed of as hazardous waste. Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61 Non disperdere nell ambiente. Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheets. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere nweisungen einholen / Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. Éviter le rejet dans l'environnement. Consulter les instructions spéciales/ la fiche de données de sécurité. Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad. Pag BEIA Helicobacter pylori CagA IgG Quant Ed. 20/04/2013